结合70%部分肝切除与对乙酰氨基酚建立大鼠急性肝衰竭模型

摘要

本研究建立的急性肝衰竭动物模型为潜在疗法的研究提供了一种可行的替代方案。该模型结合了物理性和药物诱导性肝损伤的双重效应，为研究新型疗法的潜力提供了合适的时间窗口。

摘要

急性肝衰竭（ALF）是一种由多种病因引起的临床病症，导致肝脏的代谢、生化、合成和解毒功能丧失。在大多数不可逆性肝损伤病例中，同种异体原位肝移植（OLT）仍是唯一可用的治疗方法。为了研究某种治疗手段对ALF的治疗潜力，必须先在ALF动物模型中进行测试。本研究通过结合70%部分肝切除术（PHx）和对乙酰氨基酚（APAP）注射，建立了一种大鼠ALF模型，该模型具有48小时的治疗窗口期。手术中切除肝脏的中叶和左外侧叶以去除70%的肝组织，并在术后24小时开始连续2天给予APAP。ALF诱导动物的生存率显著下降。通过检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平的变化、凝血酶原时间（PT）的改变以及国际标准化比值（INR）的评估，证实了ALF的成功建立。通过qPCR分析基因表达谱，发现与细胞凋亡、炎症反应及肝损伤进展相关的基因表达水平升高。组织学评估显示肝细胞出现弥漫性变性和免疫细胞浸润。通过脾内移植同基因型健康大鼠肝细胞后，动物生存率及血清ALT、AST和ALP水平恢复，证实了ALF的可逆性。该模型为现有的ALF动物模型提供了一种可靠的替代方案，可用于研究ALF的病理生理机制以及评估新型ALF疗法的潜力。同时采用两种不同致损方式，也有助于研究物理性与药物性肝损伤的联合效应。当前操作方法的可重复性和可行性是该模型的额外优势。

引言

急性肝衰竭（ALF）被美国肝病研究学会定义为在无任何先前损伤征象的情况下，急性肝损伤迅速发展，并以肝脏的合成功能、代谢功能和解毒功能严重受损为特征¹。ALF 有别于慢性肝衰竭，后者是长期累积的肝损伤所导致的肝功能衰竭；也不同于慢加急性肝衰竭（ACLF），后者是在慢性肝病基础上发生的急性肝损伤^2,3,4。目前 ALF 唯一有效的治疗方法是原位肝移植（OLT），否则患者可能死亡。由于肝供体短缺，ALF 患者的死亡率极高。

为了研究替代性治疗策略的潜力并更好地理解急性肝衰竭（ALF）的病理生理机制，需要建立能够反映人类ALF发病过程的动物模型。目前已有的许多ALF动物模型均存在若干缺陷。对乙酰氨基酚（APAP）诱导的模型在时间进程、临床表现、生化指标和病理特征等方面与人类ALF最为相似，但其效应难以重复。APAP及其代谢中间产物可氧化血红蛋白，导致高铁血红蛋白血症，这在APAP诱导的动物模型中常引发问题^5,6,7。另一个问题是剂量反应和死亡时间不可预测，导致实验重复性差。采用四氯化碳（CCl₄）建立的ALF动物模型也存在重复性差的问题^8,9,10,11。刀豆蛋白A（Con A）和脂多糖（LPS）诱导的ALF动物模型虽分别在研究自身免疫性肝病的细胞机制和脓毒症方面具有优势，但并不能反映人类ALF的临床病程^12,13,14,15。类似地，硫代乙酰胺（TAA）也需要经生物转化生成活性代谢产物硫代乙酰胺亚砜，且在不同物种间表现出差异^16,17,18,19。D-半乳糖胺（D-Gal）可引起一些类似于ALF的生化、代谢和生理变化，但无法全面反映ALF的完整病理状态^20,21,22,23。迄今为止，极少有研究尝试将两种或多种上述方法联合使用，以建立更能准确模拟ALF综合征的动物模型¹³。因此，仍需进一步研究，以开发出能够准确反映疾病参数、具有更好重复性，并能提供充足时间窗口用于评估治疗干预效果的ALF动物模型。

在本研究中，通过结合部分肝切除（PHx）和低剂量肝毒性试剂的作用，建立了一种大鼠的替代性急性肝衰竭（ALF）模型。对乙酰氨基酚（APAP）在导致肝损伤方面具有明确的作用^5,24,25。它是一种广泛使用的镇痛药，在超治疗剂量下会生成有毒代谢产物，从而对肝脏产生毒性。APAP 是发达国家中许多死亡病例的病因。由部分肝切除引起的物理性损伤可启动多种与炎症及肝脏再生相关的过程。注射肝毒性物质 APAP 会在肝脏内造成不利环境，抑制肝细胞的增殖。这缩短了动物所承受的应激时间，再结合较低剂量的肝毒素，提高了该操作的可重复性。因此，利用此模型研究了两种类型肝损伤的联合作用。为表征所建立的 ALF 动物模型，研究人员检测了生理学和生物化学参数。通过移植同基因型健康大鼠的肝细胞，证实了 ALF 的成功可逆性。

方案

以下所述方案已获得印度新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准，批准文号为 IAEC#355/14。

1. 准备

1. 按照 Das B 等人先前所述的方法准备手术操作²⁶。
2. 使用 6–8 周龄、体重为 200–250 g 的近交系 Wistar 大鼠。
3. 将动物饲养在标准的动物护理条件下，术前和术后自由摄取大鼠饲料和饮水。
4. 进行 70% 肝部分切除术（PHx）时，采用氯胺酮盐酸盐（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 体重）的标准混合麻醉剂，通过腹腔注射给药。
   注意：所使用的麻醉剂类型可能对术后动物的死亡率和发病率产生影响。
5. 在细胞移植过程中，使用吸入性麻醉剂异氟烷（2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷），以缩短移植手术后动物的恢复时间。
6. 使用定制的麻醉系统诱导和维持吸入麻醉。维持氧气流量为 4 L/min。诱导时使用 4% 异氟烷，术中维持时使用 2–3%。

2. 术前操作

1. 通过腹腔注射步骤3.1中所述的氯胺酮-赛拉嗪混合物使大鼠麻醉。通过夹捏动物脚趾确认完全麻醉，仅在无足底反射时进行后续操作。
2. 为防止角膜干燥，将基于羧甲基纤维素的眼药水滴入双眼。
3. 使用白色胶带将麻醉后的动物固定于手术板上，使动物腹部朝上放置，并确保其口部位于手术操作者相对的远端。
4. 使用电动剪刀去除右上腹部手术区域的毛发。
5. 使用无菌棉垫以环形方式交替进行三次聚维酮碘和70%乙醇擦拭，对手术部位进行消毒。

3. 切除肝脏70%质量的肝部分切除术（PHx）

注意：整个手术操作均需在层流罩内的无菌环境中进行。仅使用无菌外科器械，以尽量降低术后感染风险。70% 肝部分切除术（70% PHx）即切除 70% 的肝脏组织，操作步骤参照 C. Mitchell 和 H. Willenbring（2008）所述方法²⁷。

1. 手术开始前，通过轻捏动物的脚趾确认其已完全麻醉。只有在无足底反射时，方可进行后续操作。
2. 在胸骨下方、剑突下方垂直于剑突且与肋骨平行的位置标记需切开的皮肤。
3. 在标记的皮肤区域覆盖一张无菌洞巾，洞口大小约为 3 cm × 1 cm。
4. 使用手术刀沿标记线做长约 2–3 cm 的横向切口，采用 22 号手术刀片。用无菌湿润棉签轻轻去除切口周围皮肤与下方肌肉层之间的连接组织。
5. 接着，在剑突下方穿过腹膜层做横向切口。
6. 借助两个用生理盐水湿润的棉签，通过轻压胸腔暴露肝左叶。将一个棉签置于切口部位的膈面区域，另一个棉签置于切口下方区域，以抬起肝叶。
7. 将一段长 8–10 cm 的无菌尼龙缝合线环（4–0 规格，直径 0.15 mm）滑过暴露的肝左叶。借助显微解剖镊或湿润棉签，将线环移至肝叶基部靠近肝门处。
8. 使用显微外科持针器和显微镊将线环两端打结，尽可能靠近肝叶基部打结，以阻断血管并减少肝叶切除后的出血。在另一侧再打两个附加结。
9. 注意打结位置不可过于靠近邻近血管，以免引起静脉阻塞（狭窄）。
10. 使用显微外科剪在结扎结上方剪除肝叶，留下一块变色的组织，称为缺血残端。
    注：大鼠肝脏与小鼠类似，分为四个明显肝叶：中叶、右外侧叶、左外侧叶和尾状叶，分别约占肝脏总质量的 40%、20%、30% 和 7%。可通过切除任意组合的肝叶以达到切除 70% 肝质量的目的。在本研究中，切除的是中叶和左外侧叶。
11. 仔细寻找中叶，避免损伤左外侧叶残留的残端。轻柔地将其从腹腔中拉出，在肝叶基部如前所述使用一段长 8–10 cm 的尼龙线（4–0 规格）打结。在另一侧再打两个附加结。按照前述所有注意事项，仔细切除并移除已结扎的中叶。
12. 切除肝叶后，使用可吸收的 4–0 肠线连续缝合腹膜，随后使用间断缝合关闭皮肤。
13. 在缝合线周围的皮肤上涂抹聚维酮碘，以预防感染。
14. 移除洞巾，并将动物从手术板上取下。

4. 动物术后护理

1. 使用1 mL注射器，将12 mg头孢噻肟抗生素溶于1 mL 5%葡萄糖溶液中，对动物进行腹腔注射，以预防术后感染风险。
2. 术后给予美洛昔康（1 mg/kg体重）皮下注射镇痛，并按照每日一次的给药方案，继续给予后续两剂。
3. 将手术后的动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的标准条件下，并定期进行监测。

5. 在部分肝切除动物中注射药物以诱导肝衰竭

1. 术后24小时，当动物已成功从70%肝部分切除术（PHx）中恢复后，先测量动物的体重，然后进行注射。
2. 在70%肝部分切除术后24小时、动物成功恢复后，按750 mg/kg体重剂量经腹腔注射对乙酰氨基酚（APAP）；24小时后重复给予一次相同剂量。
   注意：对乙酰氨基酚（APAP）共给予两剂，均经腹腔注射（即分别在70%肝部分切除术后24小时和48小时）。
3. 每次注射APAP后，在各个时间点测量恢复中动物的体重。
   注意：对乙酰氨基酚（APAP，商品名biocetamol）以150 mg/mL的浓度溶于2%苯甲醇溶液中，用于动物注射。

6. 在急性肝衰竭动物模型中移植健康肝细胞

注意：为了研究大鼠急性肝衰竭（ALF）的可逆性，可在诱导ALF的同时，将健康的同系型大鼠肝细胞通过脾内移植的方式移植到ALF模型动物体内。^st APAP剂量。在本研究中，为了给移植细胞提供充足的归巢和植入时间，移植操作在给予第一次APAP剂量后立即进行^st APAP剂量。大鼠肝细胞通过贝里（Berry）和弗兰德斯（Friends）等人首次发表的方案进行分离。²⁸ 并在后续多项研究中被改进和应用^29,30,31 进行一些修改。对于ALF动物模型中的脾内细胞移植，请遵循以下步骤。

1. 将体重为250–350 g的大鼠放入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）麻醉诱导舱中，使用4%异氟烷和4 L/min的氧气流进行麻醉诱导。通过夹捏动物脚趾时是否存在足底反射来判断麻醉深度。
2. 将麻醉后的大鼠置于手术板上，使其左侧朝上。通过合适的面罩维持2–3%异氟烷吸入麻醉。
3. 剃除左侧体壁区域的毛发，并用聚维酮碘溶液进行皮肤消毒。
4. 在已剃毛的皮肤区域做一横向切口。
5. 在腹膜层做1–2 cm的切口，以暴露脾脏。
6. 用两个湿润的棉签轻轻将脾脏从腹腔中取出并托起。
7. 将待移植的细胞（通常每只动物10⁷个）悬浮于50 µL IMDM培养基中，装入带有29 G针头的1 mL胰岛素注射器内。
8. 轻轻将针头刺入脾脏皮质，并在2–3分钟内将细胞悬液注入脾脏。
9. 细胞移植完成后，小心拔出针头，并用湿润的棉签轻压针刺部位，防止细胞悬液外漏。
10. 分别采用连续缝合和间断缝合方式，使用4–0可吸收缝线关闭腹膜和皮肤。
11. 在缝合部位的皮肤上涂抹聚维酮碘溶液，以预防手术部位感染。
12. 术后护理中，向动物腹腔注射1 mL浓度为12 mg/mL的抗生素溶液（如头孢噻肟），并皮下注射镇痛剂（如美洛昔康），剂量为1 mg/kg体重。随后将动物转移至温暖的恢复笼中。
13. 将手术后的动物在12小时光照/12小时黑暗循环的正常条件下单独隔离饲养，直至手术伤口完全愈合，通常需要3–4天。

7. 急性肝衰竭发展的表征

1. 注射氯胺酮-赛拉嗪溶液过量处死动物，于第二次注射后2小时进行^nd APAP处理剂量，并采集血液和组织样本。
2. 从血液中采集血清用于生化研究³².
3. 处理肝脏组织样本以进行组织学和基因表达研究^33,34,35.

结果

急性肝衰竭动物模型中的存活率
对乙酰氨基酚（APAP）与70%部分肝切除（PHx）联合诱导急性肝衰竭（ALF）的最佳剂量被标准化为每公斤体重750 mg。治疗方案在70% PHx术后24小时开始，此时动物已完全从手术中恢复，包括两次间隔24小时的APAP给药。在术后48小时给予第二次APAP剂量后，观察到80%的死亡率。存活率通过Kaplan-Meier法进行分析并绘图（图1）。该模型在死亡时间和时间窗口方面具有良好的可重复性，因此适用于研究针对急性肝衰竭的治疗干预措施。

本研究共考虑了四组动物：第1组（对照组，仅给予生理盐水处理），第2组（仅给予750 mg/kg体重的APAP），第3组（生理盐水处理联合70% PHx），第4组（给予750 mg/kg体重的APAP联合70% PHx）。每组均包含三只动物，每组提供两张代表性图像。所有四组动物均在给药后2小时处死^nd 相应处理剂量。从四组中采集的肝脏样本在形态上表现出明显差异。第1组显示出健康啮齿类动物肝脏的...

讨论

建立合适的急性肝衰竭（ALF）动物模型对于深入理解ALF的发病机制和疾病进展至关重要。一个特征明确的ALF动物模型还可为开发和测试针对ALF的新型治疗方法提供重要平台。已有大量研究致力于构建具有临床相关性的ALF模型^{6,12,21,23,46,47,48}。这些研究大多采用手术方法或使用肝毒性化学物质诱导肝损伤。

仅通过部分肝切除术（PHx）难以建立急性肝衰竭（ALF）模型，因为缺乏由坏死和凋亡组织引起的炎症反应，PHx 本身无法反映 ALF 的病理过程。在治疗剂量下，对乙酰氨基酚（APAP）主要通过葡萄糖醛酸化和硫酸化途径...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰氨基酚（Biocetamol）	EG Pharmaceuticals		无特定目录编号（本地采购）
碱性磷酸酶试剂盒（DEA）	Coral 临床系统，印度		无特定目录编号（本地采购）
自动分析仪	图利普，阿尔托桑特拉克鲁斯，印度	Screen Maaster 3000	用于肝功能检测的生化分析仪
聚维酮碘溶液	Win-Medicare；印度		无特定目录编号（本地采购）
生物安全柜（I级）	Kartos国际；印度		无特定目录编号（本地采购）
明场显微镜	奥林巴斯，日本	LX51
头孢噻肟（Taxim®)	AlKem；印度		头孢噻肟钠注射液，无特定货号（本地采购）
细胞筛	Sigma；美国	CLS431752
I型胶原酶	Gibco by Life Technologies	17100-017
棉签	Pure Swabs Pvt Ltd；印度		无特定目录编号（本地采购）
铺巾	JSD Surgicals，印度德里		无特定目录编号（本地采购）
DPX 封片剂	Sigma；美国	6522
伊红Y醇溶液	Sigma；美国	HT110132
镊子	主要外科器械；印度		无特定目录编号（本地采购）
气体麻醉系统	Ugo Basile；意大利	211000
葡萄糖	Himedia，印度	GRM077
脱毛膏（Veet）®)	Reckitt Benckiser, 印度		无特定目录编号（本地采购）
苏木精溶液，梅氏	Sigma；美国	MHS16
肝素钠盐	Himedia；印度	RM554
来自绵羊睾丸的透明质酸酶	Sigma；美国	H6254
I.V. 导管（Plusflon）	Mediplus，印度	参考文献 1732411420
胰岛素注射器	BD；美国	REF 303060
异氟烷（Forane）®)	Asecia Queenborough	无 B506	吸入麻醉剂
氯胺酮（Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		盐酸氯胺酮注射液，无特定目录号（本地采购）
美洛昔康（Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd；印度		无特定目录编号（本地采购）
直型微持针钳 & 弯曲的	Mercian；英格兰	BS-13-8
直型微针持针器 & 弯曲的	Mercian；英格兰	BS-13-8
切片机	Histo-Line Laboratories，意大利	MRS3500
尼龙线	Mighty；印度		无特定目录编号（本地采购）
多聚甲醛	Himedia；印度	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist 凝胶	Allergan India Private Limited/Sun Pharma，印度	P3060	无特定目录号
RPMI	Himedia；印度		无特定目录编号（本地采购）
手术刀	主要外科手术；印度		无特定目录编号（本地采购）
剪刀	主要外科手术；印度		无特定目录编号（本地采购）
SGOT（ASAT）试剂盒	Coral 临床系统，印度		无特定目录编号（本地采购）
SGPT（ALAT）试剂盒	Coral 临床系统，印度		无特定目录编号（本地采购）
Shandon Cryotome E 冷冻切片机	Thermo Electron Corporation；美国		无特定目录号
蔗糖	Sigma；美国	S0389
手术刀22号	La Medcare，印度		无特定目录编号（本地采购）
手术组	本地制备		无特定目录编号（本地采购）
外科用白色胶带	3M 印度；印度	1530-1	微孔手术胶带
缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson，印度	NW 5047
注射器（1 ml，26 G）	迪斯波·范；印度		无特定目录编号（本地采购）
修剪器（修边器）	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
电子天平	Braun		无特定目录编号（本地采购）
William's E 培养基	Himedia；印度	AT125
赛拉嗪（Xylaxin®)	印度免疫学有限公司		镇静、麻醉前给药、镇痛及肌肉松弛