通过结合70%部分切除术和对乙酰氨基酚，生成急性肝衰竭大鼠模型

摘要

本研究开发的急性肝衰竭动物模型为研究潜在疗法提供了可行的替代方法。目前的模型采用身体和药物引起的肝损伤的综合效应，为研究新疗法的潜力提供了一个合适的时间窗口。

摘要

急性肝衰竭（ALF）是由各种病因引起的临床疾病，导致肝脏代谢、生化、合成和排毒功能的丧失。在大多数不可逆转的肝损伤病例中，正交肝脏移植（OLT）仍然是唯一可用的治疗方法。为了研究ALF治疗的治疗潜力，它事先在ALF的动物模型中进行测试是至关重要的。在目前的研究中，通过结合70%的局部肝切除术（PHx）和注射对乙酰氨基酚（APAP），在大鼠中开发了ALF模型，这种注射提供了48小时的治疗窗口。肝脏的中位和左侧叶被切除，以切除70%的肝质量，APAP在手术后给予24小时2天。发现ALF诱导动物的存活率严重下降。ALF的发展通过酶丙氨酸氨基转移酶（ALT）、阿斯巴酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的血清水平改变得到确认;孕激素时间的变化（PT）;以及国际标准化比率（INR）的评估。qPCR对基因表达特征的研究表明，参与凋亡、炎症和肝损伤进展的基因表达水平增加。通过组织学评价，观察到肝细胞扩散变性和免疫细胞渗透。ALF的可逆性通过恢复ALT、AST和ALP的存活和血清水平，在合成健康大鼠肝细胞的静脉内移植后得到确认。该模型为研究ALF的病理生理学以及评估ALF新疗法的潜力提供了一种可靠的替代方法。使用两种不同的方法也使得研究身体和药物引起的肝损伤的综合作用成为可能。现有程序的可重复性和可行性是该模型的附加优势。

引言

急性肝功能衰竭（ALF）被美国肝病研究协会定义为急性肝损伤的迅速发展，没有任何损害前的迹象，其特点是肝脏^的合成、代谢和排毒功能严重受损。ALF不同于慢性肝衰竭，其中心力衰竭是由于长期引起的肝损伤和急性慢性肝衰竭（ACLF），其中突然肝损伤发生慢性肝病2，3，4。ALF 的唯一可用治疗方法是正交肝脏移植 （OLT），否则可能发生死亡。由于肝捐赠者短缺，ALF患者的死亡率非常高。

为了研究替代治疗方法的潜力，并更好地了解ALF的病理生理学，需要能够反映人类ALF发生的动物模型。许多已经可用的ALF动物模型有几个缺点。对乙酰氨基酚 （APAP） 效应难以重现，但在时间、临床、生化和病理参数方面有最接近的相似性。APAP诱导的动物模型经常遇到问题，由于由APAP及其中间^体5，6，7氧化引起的血红蛋白血症的存在。另一个问题是缺乏可重复性，这反映在不可预测的剂量反应和死亡时间上。使用四氯化碳（CCl_4）生产的ALF动物模型具有较差的可重复性8，9，10，11。Concavalin A（Con A）和利波糖（LPS）诱导的ALF动物模型并不反映人类疾病的临床模式，尽管在研究自身免疫性肝病的细胞机制和脓毒症研究中分别具有优势12、13、14、15。同样，硫乙酰胺（TAA）也需要生物转化到活性代谢物硫乙酰胺，并显示物种变异16，17，18，19。D-加曲霉素（D-Gal）产生一些生物化学、代谢和生理变化，类似于ALF，但无法反映整个ALF病理状况20、21、22、23。很少有尝试结合两个或两个以上这些方法，以开发ALF模型，能够更好地反映ALF^{综合征13。}因此，需要进一步的研究，以开发一个模型，能够反映疾病参数，具有更好的可重复性，并提供足够的时间来研究治疗干预的效果。

在目前的研究中，结合部分肝切除术（PHx）和低剂量的肝毒试剂，在大鼠中创建了一种替代ALF模型。APAP在造成^肝损伤5，24，25方面具有公认的作用。它是一种广泛使用的镇痛剂，通过形成有毒的代谢物，在超治疗剂量下对肝脏有毒。在发达国家，APAP是许多死亡的原因。部分肝切除术引起的身体损伤启动炎症和肝脏再生过程中的各种过程的激活。注射肝毒剂APAP在肝脏中造成恶劣的环境，防止肝细胞的增殖。这减少了动物的压力期，当与小剂量的肝毒素结合，导致更好的重复程序。因此，利用该模型，研究了两种肝损伤的组合效应。为了描述已开发的ALF动物模型，研究了生理和生化参数。通过联合体健康大鼠肝细胞移植，证实了ALF的成功可逆性。

方案

下文所述的程序已获得新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会的批准。批准的序列号为 IAEC#355/14。

1. 准备

1. 准备手术，如Das B^等人26所述。
2. 使用6~8周大、体重为200~250克的近亲繁殖的威斯塔大鼠。
3. 将动物放在标准动物护理条件下，在手术前后用大鼠粪便和利他来喂食。
4. 当执行 70% PHx 时，使用盐酸氯胺酮（100 毫克/千克体重）和木兰辛 （10 mg/kg 体重）的标准鸡尾酒混合物，在腹内注射。
   注:使用的麻醉剂类型对死亡率和发病率有术后影响。
5. 在细胞移植过程中，使用吸入麻醉异二烯（2-氯-2-（二氧基）-1，1-1-三氟乙酮），以减少动物在移植手术后的恢复时间。
6. 使用定制的麻醉系统诱导和维持吸入麻醉。将氧气流量保持在 4 L/min。用于诱导使用，在手术过程中，共4%的共分法，2~3%的维护使用。

2. 术前程序

1. 通过注射步骤3.1中描述的氯胺酮-乙酰胺混合物来麻醉大鼠。通过捏住动物脚趾确认完全麻醉。只有在没有踏板反射时，才会执行进一步的程序。
2. 为了防止角膜干燥，在双眼上应用基于甲苯的甲基纤维素眼滴。
3. 用白胶带将麻醉动物约束到手术板上。将腹部朝上的动物放上，确保口腔与做手术的人位于远端。
4. 使用电动剪子从右上腹部手术区去除头发。
5. 用消毒棉垫以圆周运动的方式，用三次交替擦洗的波维酮碘和70%乙醇对手术部位进行消毒。

3. 部分肝切除术（PHx）去除70%的肝脏质量

注:在层流罩的无菌环境下执行整个外科手术。仅使用无菌手术器械，以尽量减少手术后感染的风险。切除70%的肝质量，命名为70%部分肝切除术（70%PHx），由C.米切尔和H.Willenbring描述，2008^年27。

1. 在手术开始前，通过捏合动物脚趾确认动物的完全麻醉。只有在没有踏板反射时，才会执行进一步的程序。
2. 标记要切割的皮肤，正好在胸骨下方，垂直于胸腔，并平行于肋骨。
3. 将无公的窗帘片在标记的皮肤上开口约 3 厘米 x 1 厘米。
4. 用手术刀沿着标记的线条执行大约 2⁄3 厘米的横向切口。使用手术刀片22号。使用无菌湿棉吸头，轻轻去除皮肤附着在切口区域附近底层肌肉层。
5. 接下来，通过西波叶过程下方的围层进行横向切口。
6. 在两个盐水润湿棉尖的帮助下，通过对胸部施加温和的压力来暴露肝脏的左叶。将一个棉尖放在切口部分的隔膜区域，将另一个棉尖放在切口区域下方，以提升肝瓣。
7. 在裸露的肝叶周围滑动一个 8⁄10 厘米长的无菌尼龙螺纹环（尺寸 4⁄0，直径 0.15 mm）。在微解剖钳或湿棉芽的帮助下，将环绕到靠近冬叶的叶底。
8. 在显微手术针架和微钳的帮助下，将环的两端系上，将结放在尽可能靠近叶底的位置，以收缩血管，减少肝瓣切除后出血。把另外两个结绑在另一边。
9. 小心不要将结系得太靠近附近的血管，否则可能会导致静脉阻塞（狭窄）。
10. 使用显微手术剪刀将绑叶切在结正上方，从而留下一个变色的组织，称为缺血树桩代替叶。
    注:大鼠肝脏与小鼠肝脏一样，分为四个不同的叶:中叶、右侧叶、左侧叶和牛叶，分别代表肝脏总质量的40%、20%、30%和7%。这些叶的任何组合都可以去除，以切除70%的肝脏质量。在目前的研究中，中位叶和左侧叶被移除。
11. 小心地定位中叶，而不会损坏左侧叶的剩余树桩。轻轻地把它从腹腔中拉出来，在叶底绑一个8×10厘米长的尼龙线（大小4×0）结，如前所述。把另外两个结绑在另一边。小心切除并删除绑的中位叶，采取上述所有预防措施。
12. 去除叶后，使用可吸收的铬缝 4⁄0 缝合，并连续缝合，然后用中断缝合的皮肤缝合。
13. 在缝合线周围的皮肤上涂抹波维酮碘，以防止感染。
14. 取出窗帘，将动物从手术板上取出。

4. 动物术后护理

1. 在1mL的5%葡萄糖溶液中，用1mL的葡萄糖溶液中，用12mg的cefotaxime抗生素给动物注射12毫克的西弗切酮抗生素，以保护它免受术后感染的风险。
2. 在手术后，为缓解疼痛，进行皮下注射镇痛梅洛西卡姆（1毫克/千克体重），再注射两剂，保持每天一剂。
3. 在12小时光/暗循环的标准条件下将操作的动物安置在室内，并定期进行监控。

5. 在部分肝切除术的动物中注射药物，以诱发肝衰竭

1. 手术后24小时，当动物从70%的PHx中成功恢复时，测量动物的体重，然后注射。
2. 在动物从外科手术中成功恢复后，在70%PHx后24小时在部分肝切除术的动物中注射750毫克/千克APAP的APAP内腹重量。在 24 小时后再次重复剂量。
   注:两剂APAP在腹内给动物施用（即，24小时和48小时后，70%PHx程序，分别）。
3. 在注射APAP后的每个时间点，测量恢复动物的体重。
   注:APAP（生物乙酰胺）作为150mg/mL溶液注射在动物中，以2%苯基醇。

6. ALF动物模型中健康肝细胞的移植

注:为了研究ALF在大鼠中的可逆性，在ALF诱导的动物中移植健康的合成大鼠肝细胞，以及APAP^的第1剂量。在目前的研究中，为了为移植的细胞提供充足的时间进行驯养和移植，移植是在给予^第1剂APAP之后完成的。鼠肝细胞被分离，最初由贝瑞和友邦^等人28号发表的协议，后来在其他各种研究中进行了修改，^{29，30，31.}对于ALF动物模型中细胞的静脉内移植，请按照以下步骤操作。

1. 将大鼠放入聚（甲基丙烯酸酯）室，用于诱导麻醉，其中 4% 的亚夫兰和 4 L/min 氧气流量，用于 250–350 克体重的大鼠。在捏动物的脚趾时，由于没有踏板反射，检查麻醉的深度。
2. 将麻醉大鼠放在手术板上，使其左侧侧向朝上。通过合适的喉舌吸入2~3%的胶合物时保持麻醉。
3. 在左侧侧向区域切下皮肤，用波维多酮碘溶液消毒。
4. 在皮肤的被割染区域进行横向切口。
5. 在围层中切割1⁄2厘米，露出脾脏。
6. 轻轻地取出围膜腔的脾脏，在两个湿棉尖的帮助下抬起来。
7. 将细胞（通常每只动物10⁷个）移植在50μL IMDM培养基中，用29G针头在1mL胰岛素注射器中。
8. 轻轻地将针头穿入脾皮层，并在2~3分钟内将细胞悬浮液释放到脾脏中。
9. 细胞移植完成后，小心地拿出针头，用湿棉尖刺穿针，避免细胞悬浮液从部位泄漏。
10. 用4+0可吸收缝合线关闭围肠和皮肤，分别连续和不连续缝合。
11. 在缝合处的皮肤上涂抹波维酮碘溶液，以防止手术部位的感染。
12. 作为术后护理的一部分，在腹内注射1mL体积的12mg/mL抗生素（如西法管）溶液和皮下注射镇痛药（例如，梅洛西卡姆）1毫克/千克体重。将动物移到温暖的恢复笼中。
13. 在12小时光/暗循环的正常条件下，保持手术动物隔离，直到手术伤口完全愈合。这可能需要 3⁄4 天。

7. ALF开发的特征

1. 在第^二剂量的APAP治疗后，通过过量的氯胺酮-乙酰胺溶液2h对动物实施安乐死，并收集血液和组织样本。
2. 从血液中收集血清进行生化^研究32。
3. 过程肝组织样本用于组织学和基因表达研究33，34，35。

结果

ALF动物模型中的存活率
APAP的最佳剂量导致ALF与70%PHx结合被标准化为750毫克/千克体重。治疗方案在70%PHx后24小时开始，当动物从手术中完全恢复时，由24小时间隔的两个APAP剂量组成。第二剂APAP（手术后48小时）施用后，死亡率观察到80%。通过卡普兰-迈尔方法分析和绘制生存百分比（图1）。该模型提供的死亡时间和时间段的可重复性使其成为研究针对ALF的治疗干预的合适候选者。

研究考虑了四组动物:第1组（对照组，仅盐碱治疗），第2组（仅APAP在750毫克/千克体重），组3（盐碱处理70%PHx）和第4组（APAP在750毫克/千克体重70%PHx）。所有组中各包含三只动物，每个组包括两个代表性图像。在施用^第二剂治疗后，所有四组动物在2小时后被安乐死。从所有四组采集的肝脏样本显示了彼此不同的形态。第1组显示了健康啮齿动物肝脏的红褐色形态。第2组肝脏样本在形态水平上没有明显的损伤迹象，与组1的健康肝脏相似。从组3和4采集的肝脏样本看起来不健康...

讨论

为ALF开发适当的动物模型对于更好地了解ALF的发病机制和进展至关重要。具有良好特征的ALF动物模型也为针对ALF的新治疗方法的开发和试验提供了机会。已多次尝试开发与临床相关的ALF^{6、12、21、23、46、47、48}的临床模型。这些研究大多要么利用外科手术，要么通过肝毒性化学物质诱发肝损伤。

单靠PHx很难创建ALF模型，因为PHx不会反映ALF的病理学，因为没有坏死和凋亡组织引起的炎症。在治疗剂量时，APAP 完全由葡萄糖素和硫酸化过程代谢。在高剂量时，当这些通路饱和时，APAP由主要由肝细胞合成的细胞色素p450酶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对乙酰氨基酚 （Biocetamol）	EG Pharmaceuticals		无特定目录号（本地采购）
碱性磷酸酶试剂盒 （DEA）	印度珊瑚临床系统		无特定目录号（本地采购）
自动分析仪	Tulip，Alto Santracruz，印度	Screen Maaster 3000	肝功能测试生化分析仪
Betadine （Povidon-碘溶液）	Win-Medicare;印度		无特定目录号 （本地采购）
生物安全柜 （I 类）	Kartos international;印度		无特定目录号（当地采购）
明场显微镜	Olympus，日本	LX51
孢噻肟 （Taxim®）	阿尔凯姆;印度		头孢噻肟钠注射液，无特异性目录号（本地采购）
细胞过滤器	Sigma;Life	CLS431752
I 型胶原酶	Gibco	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd;印度		无特定目录号（本地采购）
Drape Sheet	JSD Surgicals， Delhi， India		无特定目录号（本地采购）
DPX 封片剂	Sigma;US	6522
曙红 Y 溶液，含酒精	的 Sigma;美国	HT110132
钳	大手术;印度		无特定目录号 （Local Procurement）
气体麻醉系统	Ugo Basile;意大利	211000
Glucose	Himedia， 印度	GRM077
脱毛霜 （Veet®）	Reckitt Benckiser，印度		无特定目录号（本地采购）
苏木精溶液，Mayer's	Sigma;US	MHS16
肝素钠盐	Himedia;印度	RM554
来自绵羊睾丸的透明质酸酶	Sigma;US	H6254
I.V. 插管 （Plusflon）	Mediplus，印度	Ref 1732411420
胰岛素注射器	BD;US	REF 303060
异氟醚 （Forane®）	Asecia Queenborough	No B506	吸入麻醉剂
氯胺酮 （Ketamax®）	Troikaa Pharmaceuticals Ltd. 三驾		盐酸氯胺酮IP，无特定目录号（本地采购）
美洛昔康（Melonex®）	Intas Pharmaceuticals Ltd;印度		无特定目录号 （本地采购）
微型持针器 直 & 弯曲	Mercian;英格兰	BS-13-8
微型持针器直 & 弯曲	Mercian;英国	BS-13-8
切片机	Histo-Line Laboratories，意大利	MRS3500
尼龙线	Mighty;印度		无特定目录号 （Local Procurement）
多聚甲醛	Himedia;印度	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma， India	P3060	无特定目录号
RPMI	Himedia;印度		无特定目录号 （Local Procurement）
手术刀	Major Surgicals;印度		无特定目录号 （Local Procurement）
剪刀	Major Surgicals;印度		无特定目录号 （本地采购）
SGOT （ASAT） KIT	印度珊瑚临床系统		无特定目录号 （本地采购）
SGPT （ALAT）	KIT 印度珊瑚临床系统		无特定目录号 （本地采购）
Shandon Cryotome E 低温恒	器Thermo Electron Corporation;美国		无特定目录号
蔗糖	Sigma;US	S0389
手术刀片 No. 22	La Medcare， India		无特定目录号（本地采购）
手术板	本地制造		无特定目录号（本地采购）
手术白胶带	3M 印度;印度	1530-1	微孔手术胶带
缝合	Ethicon， Johnson &Johnson， 印度	NW 5047
注射器（1ml，26 g）	Dispo Van;印度		无特定目录号 （本地采购）
修剪器 （Clipper）	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
称重机	Braun		无特定目录号 （本地采购）
William's E Media	Himedia;印度	AT125
甲苯噻嗪 （Xylaxin®）	Indian Immunologicals Limited		镇静剂、麻醉前麻醉剂、镇痛剂和肌肉松弛剂