本研究建立的急性肝衰竭动物模型为潜在疗法的研究提供了一种可行的替代方案。该模型结合了物理性和药物诱导性肝损伤的双重效应，为研究新型疗法的潜力提供了合适的时间窗口。
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摘要
摘要
急性肝衰竭（ALF）是一种由多种病因引起的临床病症，导致肝脏的代谢、生化、合成和解毒功能丧失。在大多数不可逆性肝损伤病例中，同种异体原位肝移植（OLT）仍是唯一可用的治疗方法。为了研究某种治疗手段对ALF的治疗潜力，必须先在ALF动物模型中进行测试。本研究通过结合70%部分肝切除术（PHx）和对乙酰氨基酚（APAP）注射，建立了一种大鼠ALF模型，该模型具有48小时的治疗窗口期。手术中切除肝脏的中叶和左外侧叶以去除70%的肝组织，并在术后24小时开始连续2天给予APAP。ALF诱导动物的生存率显著下降。通过检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平的变化、凝血酶原时间（PT）的改变以及国际标准化比值（INR）的评估，证实了ALF的成功建立。通过qPCR分析基因表达谱，发现与细胞凋亡、炎症反应及肝损伤进展相关的基因表达水平升高。组织学评估显示肝细胞出现弥漫性变性和免疫细胞浸润。通过脾内移植同基因型健康大鼠肝细胞后，动物生存率及血清ALT、AST和ALP水平恢复，证实了ALF的可逆性。该模型为现有的ALF动物模型提供了一种可靠的替代方案，可用于研究ALF的病理生理机制以及评估新型ALF疗法的潜力。同时采用两种不同致损方式，也有助于研究物理性与药物性肝损伤的联合效应。当前操作方法的可重复性和可行性是该模型的额外优势。
引言
急性肝衰竭（ALF）被美国肝病研究学会定义为在无任何先前损伤征象的情况下，急性肝损伤迅速发展，并以肝脏的合成功能、代谢功能和解毒功能严重受损为特征1。ALF 有别于慢性肝衰竭，后者是长期累积的肝损伤所导致的肝功能衰竭；也不同于慢加急性肝衰竭（ACLF），后者是在慢性肝病基础上发生的急性肝损伤2,3,4。目前 ALF 唯一有效的治疗方法是原位肝移植（OLT），否则患者可能死亡。由于肝供体短缺，ALF 患者的死亡率极高。
为了研究替代性治疗策略的潜力并更好地理解急性肝衰竭（ALF）的病理生理机制，需要建立能够反映人类ALF发病过程的动物模型。目前已有的许多ALF动物模型均存在若干缺陷。对乙酰氨基酚（APAP）诱导的模型在时间进程、临床表现、生化指标和病理特征等方面与人类ALF最为相似，但其效应难以重复。APAP及其代谢中间产物可氧化血红蛋白，导致高铁血红蛋白血症，这在APAP诱导的动物模型中常引发问题5,6,7。另一个问题是剂量反应和死亡时间不可预测，导致实验重复....
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方案
以下所述方案已获得印度新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准，批准文号为 IAEC#355/14。
1. 准备
- 按照 Das B 等人先前所述的方法准备手术操作26。
- 使用 6–8 周龄、体重为 200–250 g 的近交系 Wistar 大鼠。
- 将动物饲养在标准的动物护理条件下，术前和术后自由摄取大鼠饲料和饮水。
- 进行 70% 肝部分切除术（PHx）时，采用氯胺酮盐酸盐（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 体重）的标准混合麻醉剂，通过腹腔注射给药。
注意：所使用的麻醉剂类型可能对术后动物的死亡率和发病率产生影响。 - 在细胞移植过程中，使用吸入性麻醉剂异氟烷（2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷），以缩短移植手术后动物的恢复时间。
- 使用定制的麻醉系统诱导和维持吸入麻醉。维持氧气流量为 4 L/min。诱导时使用 4% 异氟烷，术中维持时使用 2–3%。
2. 术前操作
- 通过腹腔注射步骤3.1中所述的氯胺酮-赛拉嗪混合物使大鼠麻醉。通过夹捏动物脚趾确认完全麻醉，仅在无足底反射时进行后续操作。
- 为防止角膜干燥，将基于羧甲基纤维素的眼药水滴入双眼。
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结果
急性肝衰竭动物模型中的存活率
对乙酰氨基酚（APAP）与70%部分肝切除（PHx）联合诱导急性肝衰竭（ALF）的最佳剂量被标准化为每公斤体重750 mg。治疗方案在70% PHx术后24小时开始，此时动物已完全从手术中恢复，包括两次间隔24小时的APAP给药。在术后48小时给予第二次APAP剂量后，观察到80%的死亡率。存活率通过Kaplan-Meier法进行分析并绘图（图1）。该模型在死亡时间和时间窗口方面具有良好的可重复性，因此适用于研究针对急性肝衰竭的治疗干预措施。
本研究共考虑了四组动物：第1组（对照组，仅给予生理盐水处理），第2组（仅给予750 mg/kg体重的APAP），第3组（生理盐水处理联合70% PHx），第4组（给予750 mg/kg体重的APAP联合70% PHx）。每组均包含三只动物，每组提供两张代表性图像。所有四组动物均在给药后2小时处死nd 相应处理剂量。从四组中采集的肝脏样本在形态上表现出明显差异。第1组显示出健康啮齿类动物肝脏的.......
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讨论
建立合适的急性肝衰竭（ALF）动物模型对于深入理解ALF的发病机制和疾病进展至关重要。一个特征明确的ALF动物模型还可为开发和测试针对ALF的新型治疗方法提供重要平台。已有大量研究致力于构建具有临床相关性的ALF模型6,12,21,23,46,47,48。这些研究大多采用手术方法或使用肝毒性化学物质诱导肝损伤。
仅通过部分肝切除术（PHx）难以建立急性肝衰竭（ALF）模型，因为缺乏由坏死和凋亡组织引起的炎症反应，PHx 本身无法反映 ALF 的病理过程。在治疗剂量下，对乙酰氨基酚（APAP）主要通过葡萄糖醛酸化和硫酸化途径.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰氨基酚（Biocetamol） | EG Pharmaceuticals | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 碱性磷酸酶试剂盒（DEA） | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 自动分析仪 | 图利普，阿尔托桑特拉克鲁斯，印度 | Screen Maaster 3000 | 用于肝功能检测的生化分析仪 |
| 聚维酮碘溶液 | Win-Medicare；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 生物安全柜（I级） | Kartos国际；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 明场显微镜 | 奥林巴斯，日本 | LX51 | |
| 头孢噻肟（Taxim®) | AlKem；印度 | 头孢噻肟钠注射液，无特定货号（本地采购） | |
| 细胞筛 | Sigma；美国 | CLS431752 | |
| I型胶原酶 | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| 棉签 | Pure Swabs Pvt Ltd；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 铺巾 | JSD Surgicals，印度德里 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| DPX 封片剂 | Sigma；美国 | 6522 | |
| 伊红Y醇溶液 | Sigma；美国 | HT110132 | |
| 镊子 | 主要外科器械；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 气体麻醉系统 | Ugo Basile；意大利 | 211000 | |
| 葡萄糖 | Himedia，印度 | GRM077 | |
| 脱毛膏（Veet）®) | Reckitt Benckiser, 印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 苏木精溶液，梅氏 | Sigma；美国 | MHS16 | |
| 肝素钠盐 | Himedia；印度 | RM554 | |
| 来自绵羊睾丸的透明质酸酶 | Sigma；美国 | H6254 | |
| I.V. 导管（Plusflon） | Mediplus，印度 | 参考文献 1732411420 | |
| 胰岛素注射器 | BD；美国 | REF 303060 | |
| 异氟烷（Forane）®) | Asecia Queenborough | 无 B506 | 吸入麻醉剂 |
| 氯胺酮（Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | 盐酸氯胺酮注射液，无特定目录号（本地采购） | |
| 美洛昔康（Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 直型微持针钳 & 弯曲的 | Mercian；英格兰 | BS-13-8 | |
| 直型微针持针器 & 弯曲的 | Mercian；英格兰 | BS-13-8 | |
| 切片机 | Histo-Line Laboratories，意大利 | MRS3500 | |
| 尼龙线 | Mighty；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 多聚甲醛 | Himedia；印度 | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist 凝胶 | Allergan India Private Limited/Sun Pharma，印度 | P3060 | 无特定目录号 |
| RPMI | Himedia；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术刀 | 主要外科手术；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 剪刀 | 主要外科手术；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGOT（ASAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGPT（ALAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| Shandon Cryotome E 冷冻切片机 | Thermo Electron Corporation；美国 | 无特定目录号 | |
| 蔗糖 | Sigma；美国 | S0389 | |
| 手术刀22号 | La Medcare，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术组 | 本地制备 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 外科用白色胶带 | 3M 印度；印度 | 1530-1 | 微孔手术胶带 |
| 缝合线 | Ethicon, Johnson & Johnson，印度 | NW 5047 | |
| 注射器（1 ml，26 G） | 迪斯波·范；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 修剪器（修边器） | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| 电子天平 | Braun | 无特定目录编号（本地采购） | |
| William's E 培养基 | Himedia；印度 | AT125 | |
| 赛拉嗪（Xylaxin®) | 印度免疫学有限公司 | 镇静、麻醉前给药、镇痛及肌肉松弛 |
参考文献
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, ....
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