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单细胞微吸法作为荧光激活细胞分选的替代策略用于巨型病毒混合物的分离

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DOI：

10.3791/60148

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2019年10月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Hospitalo-Universitaire (IHU) - Méditerranée Infection, 2Microbes, Evolution, Phylogeny and Infection (MEΦI), Aix-Marseille Université UM63, Institut de Recherche pour le Développement IRD 198, Assistance Publique - Hôpitaux de Marseille (AP-HM)

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分离感染性变形虫的单细胞微吸吮方法。为了分离感染了福斯托病毒（Faustoviruses）及未知巨型病毒的Vermamoeba vermiformis中的病毒亚群，我们开发了如下所述的实验方案，并证明该方法能够分离出两种丰度较低的新型巨型病毒。

摘要

在阿米巴共培养过程中，单个孔中可能分离出不止一种病毒。我们此前通过终点稀释法和/或针对病毒群体应用荧光激活细胞分选（FACS）来解决这一问题。然而，当混合物中的病毒具有相似的形态学特征，且其中一种病毒增殖较慢时，双病毒感染的情况往往直到基因组组装阶段才会被发现，此时病毒已无法分离以进行后续表征。为解决这一难题，我们开发了一种单细胞微吸法，可实现高度相似病毒的分离与克隆。在本研究中，我们展示了这一替代策略如何帮助我们成功分离出Clandestinovirus ST1和Usurpativirus LCD7这两种微小的病毒亚群，它们均为巨型病毒，生长缓慢，且与具有裂解性并快速生长的Faustovirus相比，不会引起阿米巴细胞裂解。通过特异性基因扩增对纯度进行检测，并制备了病毒用于进一步的表征分析。

引言

核质大DNA病毒（NCLDV）具有极高的多样性，由感染真核生物的四个科所定义1。首个被描述的基因组大小超过300 kbp的病毒是Phycodnaviridae科，其中包括Paramecium bursaria Chlorella virus 1（PBCV1）2。Mimivirus的分离与首次描述表明，病毒在颗粒大小（450 nm）和基因组长度（1.2 Mb）两方面均扩大了一倍3。自那时起，已有多种巨型病毒被报道，通常通过阿米巴共培养方法分离获得。可从Acanthamoeba sp.细胞中分离出多种形态和遗传内容各异的巨型病毒，包括Marseillevirus、Pandoravirus、Pithovirus、Mollivirus、Cedratvirus、Pacmanvirus、Tupanvirus以及最近发现的Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。与此同时，从Vermamoeba vermiformis中分离培养，使得巨型病毒Faustovirus、Kaumoebavirus和Orpheovirus得以被分离和描述18,19,20。其他一些巨型病毒则与其宿主原生生物共同被分离，例如Cafeteria roenbergensis21、Aureococcus anophagefferens22、Chrysochromulina ericina23和Bodo saltans24。所有这些病毒的分离成果均得益于越来越多的研究团队投入病毒分离工作，以及高通量策略的不断更新与优化25,26,27,28，例如结合流式细胞术对共培养系统进行改进。

2016年，我们采用了一种结合共培养与流式细胞术的策略来分离巨型病毒27。该策略旨在增加接种样本的数量，丰富用作细胞宿主的原生生物种类，并快速检测细胞宿主的裂解情况。随后，该系统增加了一个额外步骤，以避免初步的分子生物学鉴定，实现对未知病毒种群（如Pacmanvirus29）的快速检测。将流式细胞术与细胞分选技术联用，曾成功分离出Mimivirus与Cedratvirus A11的混合物30。然而，我们随后遇到了流式细胞术在分离和检测这些病毒亚群方面的局限性。在测序后，当我们组装Faustovirus ST125和Faustovirus LCD7（未发表数据）的基因组时，意外地在每个组装结果中发现了两个额外的基因组，分别属于两种在公共基因组数据库中未被识别的新型病毒。然而，无论是流式细胞术还是透射电子显微镜（TEM）均未显示阿米巴同时感染了两种不同的病毒——Clandestinovirus ST1和Usurpativirus LCD7。我们根据这三种病毒的基因组设计了特异性的PCR体系，分别用于扩增Faustovirus、Usurpativirus和Clandestinovirus的标记基因，目的是建立基于PCR的系统，以验证所分离病毒的纯度。然而，终点稀释法和流式细胞术均未能实现它们的分离。由于Clandestinovirus和Usurpativirus种群的形态学特征和复制特性尚未被表征，因此分离单一病毒种群十分困难。流式细胞术仅检测到一个病毒种群，原因是两个种群信号重叠（在成功分离后验证）。我们尝试使用单颗粒分选技术将病毒分配至96孔板进行分离，但未观察到任何细胞病变效应，且PCR扩增也未能检测到Clandestinovirus或Usurpativirus。最终，只有将终点稀释法与单个阿米巴微吸出技术相结合，才成功将这两种丰度较低的巨型病毒从Faustovirus中分离出来。本文即介绍这一分离方法。

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方案

1. 变形虫培养

  1. 使用 Vermamoeba vermiformis（CDC19 菌株）作为细胞载体。
  2. 在 75 cm2 的细胞培养瓶中加入 30 mL 蛋白酶-蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）（表 1），以及 3 mL 浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的阿米巴原虫。
  3. 将培养物置于 28 °C 条件下培养。
  4. 48 小时后，使用计数板对阿米巴原虫进行定量。
  5. 洗涤时，收集浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的细胞，于 720 × g 离心 10 分钟使阿米巴原虫沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于适量的饥饿培养基中，以获得 1 × 106 个细胞/mL 的悬液（表 1）。

2. 在阿米巴原虫中扩增病毒储备液

注意：稀释前，需先培养原始样品以获得足够的新鲜培养物，然后进行过滤。

  1. 使用饥饿培养基中浓度为 1 × 106 的阿米巴培养物。
  2. 将来自储备液的病毒混合物（Faustovirus/Usurpativirus LCD7 或 Faustovirus/Clandestinovirus ST1）在共培养过程后接种至细胞载体上，感染复数（MOI） 为 0.01。
    注意：感染复数（MOI）至关重要，可降低主要病毒种群的丰度以及被感染细胞的数量。
  3. 在 30 °C 下孵育，直至出现细胞病变效应（CPE），例如阿米巴细胞变圆或裂解，通常在感染后约 10 至 14 小时发生。
  4. 收集培养基，并通过 5 µm 滤膜过滤，以去除细胞碎片。

3. 终点稀释法

  1. 用饥饿培养基（表1）对病毒样品进行系列稀释（10-1 至 10-11）。
  2. 向每个培养皿中含 1 × 106 个Vermamoeba vermiformis 的 2 mL 培养物中加入 100 µL 接种混合液。
  3. 将培养皿放入可密封的塑料袋中，于 30 °C 培养。
  4. 感染后 6 小时开始使用倒置光学显微镜观察培养皿，并每隔 4 至 8 小时检查一次细胞形态。
  5. 当出现以细胞变圆为特征的细胞病变效应时，开始进行单细胞微吸管分离操作。

4. 单细胞微吸吮

  1. 准备宿主。
    注意：    此步骤旨在将感染的单细胞释放到新鲜的细胞培养基中。
    1. 用含有 10 µg/mL 万古霉素、10 µg/mL 亚胺培南、20 µg/mL 环丙沙星、20 µg/mL 多西环素和 20 µg/mL 伏立康唑的抗菌剂处理培养物中的变形虫，以防止细菌和真菌污染。
      注意：该操作在生物安全柜外的实验台上进行。将浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的变形虫各取 2 mL 加入 15 个培养皿中。为促进变形虫贴壁，将培养物在 30 °C 下孵育 30 分钟。
  2. 根据以下标准，从有限稀释培养中选择用于显微吸管操作的培养皿：1）无可见的真菌或细菌污染；2）观察到病毒引起的变形虫细胞病变效应；3）变形虫处于裂解前期和变圆阶段（以避免吸入病毒颗粒）。
  3. 准备配备以下材料的工作站（见 图 1A,B）：
    显微操作仪，用于微吸管的定位；
    手动控制压力装置，用于将细胞吸入和释放出微吸管；
    倒置显微镜；
    即插即用电机模块；
    摄像头；
    计算机模块，用于观察操作过程并拍摄图像。
  4. 选择一根微吸管（见 图 1C）。
    注意：细胞的大小、细胞膜对表面的形变与黏附性以及细胞运动性可能影响显微吸管操作的顺利进行。可根据细胞类型的具体大小和吸管方式精确选择和调整微吸管的直径。本实验中使用内径为 20 µm 的微吸管来吸取一个变圆的变形虫（直径约 10 µm），这有助于细胞在吸管内保持稳定位置并便于顺利释放。
  5. 安装系统。
    1. 将电机模块上的夹持系统工作角度固定为 45°。
    2. 进行双重安装，先安装夹持系统，再安装微吸管。
    3. 通过微吸管滴入少量油后对细胞进行调焦。
      注意：设备提供的矿物油具有生物相容性。
    4. 按照制造商的建议完成安装。
  6. 克隆细胞（见 图 2A,B）。
    注意：    该操作步骤与 Fröhlich 和 König31 所描述的方法类似。
    1. 将含有 2 mL 感染变形虫的培养皿置于显微镜下。
    2. 先对细胞进行调焦，再对浸入培养液中的微吸管进行调焦。
    3. 选取一个变圆的单个细胞，并将微吸管靠近显微操作仪。
    4. 通过手动压力控制对细胞进行轻柔吸液，将其吸入微吸管内。将该单个细胞从原始样品中移出，并释放至新的细胞培养基中，随后在 30 °C 下孵育。
    5. 每天使用倒置光学显微镜进行观察，记录细胞形态变化，并监测细胞病变效应的出现情况。

5. PCR 筛选

注意：在完成步骤4后，必须通过PCR进行系统性筛选，以确认分离效果。在Usurpativirus/Faustovirus和Clandestinovirus/Faustovirus中，特异性引物和探针系统的设计与应用均使用Primer-BLAST在线工具32（表2）完成。

  1. 使用自动化提取系统，按照制造商提供的方案，从部分阳性培养样本（即观察到细胞病变效应的样本）中提取DNA。
  2. 使用适当设计的引物。
    注意： 本研究中设计的引物用于扩增被注释为核心基因的RpB2（Faustovirus）、LCD7主要衣壳蛋白（Usurpatvirus）以及次要衣壳蛋白（Clandestinovirus）。
  3. 使用PCR仪进行标准PCR扩增。
    1. 进行20 µL的PCR反应，包含每种引物各50 µM（表2）、1x Master Mix以及无RNase的水。
    2. 在95 °C下激活Taq DNA聚合酶5分钟，随后进行45个循环：95 °C变性10秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸30秒。
  4. 将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用DNA凝胶染料（材料表）染色，并在紫外光下观察。

6. 病毒的制备与纯化

  1. 将剩余的培养皿培养物放回小烧瓶中。
  2. 为进行病毒扩增，准备15个面积为145 cm2的烧瓶，每瓶加入40 mL饥饿培养基中的Vermamoeba vermiformis以及5 mL已从培养皿转移至小烧瓶的分离病毒液。
  3. 使用与步骤4.1相同的抗生素和抗真菌剂混合物处理。
  4. 在30 °C条件下培养，每天使用倒置光学显微镜观察。
  5. 待完全感染后，合并所有烧瓶中的培养物，使用0.45 µm滤膜去除碎片。
  6. 将所有上清液在 50,000 x g条件下超速离心 45分钟。
  7. 离心后，通过抽吸去除每根离心管中的上清液，并将沉淀重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  8. 使用25%蔗糖溶液（将27.5 g蔗糖溶于100 mL PBS中，过滤除菌）纯化产生的病毒。
  9. 将8 mL蔗糖溶液与2 mL病毒悬液混合，在 80,000 x g条件下离心 30分钟，将病毒沉淀重悬于1 mL PBS中，于-80 °C保存。

7. 负染色法与透射电子显微镜观察

注意：Bou Khalil 等人此前已发表过该实验方案27。

  1. 将5 μL裂解上清液滴加到辉光放电处理的载网上，在室温下静置约20分钟。
    注意：辉光放电通过等离子体处理使载网具有亲水性。
  2. 小心吸干载网，滴加一滴1%磷钨酸铵溶液，染色10秒，然后让载网干燥5分钟。
  3. 在200 keV条件下进行透射电子显微镜观察。

8. 隐病毒ST1和篡位病毒LCD7的表征

  1. 利用基因组测序、基因组组装、生物信息学分析以及复制周期研究，对隐秘病毒ST1（Clandestinovirus ST1）和篡位病毒LCD7（Usurpativirus LCD7）的纯种群进行表征，方法与我们此前对其他病毒的研究一致10,20,29。

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结果

单细胞微吸管技术是一种在本文中优化的微操作方法（图1）。该技术能够捕获一个呈圆形的感染性阿米巴（图2A），并将其释放到含有未感染阿米巴的新培养板中（图2）。这是一种适用于共培养系统的功能型原型技术，已成功分离出非裂解型巨病毒。该方法首次应用于巨病毒研究领域，并成功分离出两种丰度较低的新型巨病毒。我们将这些新病毒命名为Clandestinovirus ST1和Usurpativirus LCD7，其丰度相较于高丰度的Faustovirus更低。为了在微吸管操作后分析每块培养板中的病毒存在情况，我们对15次微吸管操作样本进行了PCR检测。结果显示，仅在第7克隆中检测到纯的Usurpativirus（Usurpativirus LCD7为[+]，Faustovirus为[–]）（图3）。通过针对Clandestinovirus ST1和Usurpativirus LCD7的...

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讨论

单细胞微吸管操作的持续时间及其操作效果取决于操作者的熟练程度。实验的各个步骤均需要精确操作。使用工作站的显微操作组件时，必须通过观察微吸管吸取和释放细胞的过程进行持续控制。显微观察对于捕获和转移细胞至关重要。一位经验丰富的操作者可能需要1至2小时来分离10个细胞，并根据待分离病毒的丰度逐个进行重新转移。操作次数可能有所不同。我们建议初次尝试时从10次操作开始。根据定义，我们并不了解未知病毒的内在特性，因此有必要采用并发展多种分离策略，以优化成功分离这些病毒的几率。

微吸管操作过程在非无菌条件下进行（在生物安全柜外的实验台上操作），因此限制了其应用范围，并阻止了其在人类病原体研究中的使用。因此，必须使用抗生素和抗真菌剂的混合物以限制污染。该方法的另一个局限性在于，它仅能用于可通过光学显微镜观察到的微生物，且微操作组件必须安装在这些微生物上，这在概念上排除了对无法通过光学显微镜观察的微生物进行任何操作。然而，我们通过采用一种间接策略——分离和克隆被感染的宿主——成功分离了直径约200 nm的巨型病毒，这些病毒在光学显微镜下仍不可见。

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披露

所有作者均无披露事项。

致谢

作者谨向 Jean-Pierre Baudoin 和 Olivier Mbarek 表示感谢，感谢他们提供的建议，同时感谢 Claire Andréani 在英文校对与修改方面的帮助。本研究工作由法国国家科研署管理的法国政府资助项目支持，项目编号为 "未来投资计划" 由参考号ANR-10-IAHU-03（Méditerranée Infection）项目、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区及欧洲区域发展基金FEDER PRIMI资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖标准品Euromedex未知标准PCR
AmpliTaq Gold 360 Master MixApplied Biosystems4398876标准PCR
CellTram 4r OilEppendorf5196000030在显微吸管操作过程中控制细胞
Corning 细胞培养瓶 150 cm2Sigma-aldrichCLS430825培养
Corning 细胞培养瓶 25 cm2Sigma-aldrichCLS430639培养
Corning 细胞培养瓶 75 cm2Sigma-aldrichCLS430641培养
DFC 425C 相机LEICA未知观察/监测
Eclipse TE2000-S 倒置显微镜Nikon未知观察/监测
EZ1 advanced XLQuiagen9001874DNA提取
Glasstic Slide 10 计数板（带计数网格）Kova International87144E细胞计数
Mastercycler nexusEppendorf6331000017标准PCR
Microcapillary 20 µmEppendorf5175 107.004细胞显微吸管吸取与释放
Micromanipulator InjectMan NI2Eppendorf631-0210显微毛细管定位
无核酸酶水ThermoFischerAM9920标准PCR
Optima XPN 超速离心机BECKMAN COULTERA94469病毒纯化
35 mm 培养皿Ibidi81158培养/观察
无菌注射器滤器 5 µmSigma-aldrichSLSV025LS过滤
SYBR green Type IInvitrogen未知荧光分子探针/流式细胞术
SYBR SafeInvitrogenS33102标准PCR；DNA凝胶染色
Tecnai G20FEI未知电子显微镜
Type 70 Ti 固定角钛转子BECKMAN COULTER337922病毒纯化
Ultra-Clear 离心管，25 x 89 mm2BECKMAN COULTER344058病毒纯化

参考文献

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PCR Vermamoeba vermiformis Faustovirus

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