从人乳汁中分离白细胞用于针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

摘要

母乳可传播人类免疫缺陷病毒（HIV），但仅有约15%的HIV感染母亲所哺乳的婴儿会因此感染。哺乳婴儿每日摄入约10⁵−10⁸个母源白细胞，然而这些细胞的研究尚不充分。本文介绍了从母乳中分离白细胞的方法，并对其吞噬能力进行了分析。

摘要

即使在未使用抗逆转录病毒药物的情况下，由感染HIV的母亲进行母乳喂养的婴儿中，仅有约15%会感染，这表明母乳（BM）具有显著的保护作用。除非能够稳定获得清洁水源和合适的婴儿配方奶粉，否则世界卫生组织（WHO）不建议感染HIV的母亲停止母乳喂养。多种因素可能协同作用以降低母乳传播HIV的风险。母乳喂养的婴儿每日摄入约10⁵−10⁸个母体白细胞，但这些细胞对母乳抗病毒特性所起的作用仍尚不明确。本研究旨在从人乳母乳中分离细胞，以检测抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）——这是最重要且最普遍的先天免疫反应之一——即母乳吞噬细胞针对HIV靶标的ADCP活性。实验从5份处于不同哺乳阶段的人乳母乳样本中分离细胞。通过温和离心，随后仔细去除乳脂并反复洗涤细胞沉淀，完成细胞分离。使用包被HIV包膜（Env）表位的荧光微球作为靶标，用于ADCP分析。细胞用CD45表面标志物染色以鉴定白细胞。结果发现，在使用HIV特异性抗体830A的条件下，ADCP活性显著高于对照实验，并可重复检测。

引言

人乳（BM）中含有母体细胞，其中>90% 具有活性¹。细胞组成受泌乳阶段、母亲与婴儿健康状况以及个体差异的显著影响，而个体差异目前仍了解甚少^1,2,3,4。鉴于人乳中含有约 10³−10⁵ 个白细胞/mL，可估算出母乳喂养的婴儿每日摄入约 10⁵−10⁸ 个母源性白细胞⁵。多项体内研究表明，母源性白细胞为婴儿提供关键免疫力，并且其功能作用远超出最初摄入部位^{5,6,7,8,9,10,11}。婴儿摄入的所有母源性细胞均有可能与其自身白细胞协同发挥免疫功能，或弥补其免疫功能的不足¹²。

人类免疫缺陷病毒（HIV）的母婴传播（MTCT）在资源有限的国家仍是一场危机。由于腹泻和呼吸道疾病在这些国家的婴儿中导致了较高的死亡率，而纯母乳喂养可显著降低这些疾病的发生，因此对HIV感染的母亲而言，母乳喂养的益处远大于风险^13,14,15。除非能够稳定获得清洁水源和合适的婴儿配方奶粉，否则世界卫生组织（WHO）不建议HIV感染的母亲停止母乳喂养¹⁶。每年约有10万名婴儿通过母乳（BM）感染HIV；然而，仅有约15%的由HIV感染母亲哺乳的婴儿会感染病毒，这表明母乳具有显著的保护作用^{17,18,19,20,21}。多种因素可能协同作用以阻止病毒传播。重要的是，母乳中针对HIV的特异性抗体（Abs）已被证实与降低母婴传播风险和/或降低婴儿因HIV感染导致的死亡率相关^22,23。目前尚不明确的是，母乳中细胞组分对其抗病毒特性所起的作用。

许多抗体通过其免疫球蛋白分子的“恒定区”——可结晶片段（Fc）与几乎所有人先天免疫细胞表面的Fc受体（FcRs）相互作用，从而介导多种抗病毒活性，而这些免疫细胞几乎均可在人骨髓（BM）中找到²⁴。抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）已被证明对清除病毒感染至关重要，但在预防HIV母婴传播（MTCT）中的作用却研究较少^{25,26,27,28,29}。鉴于目前关于骨髓吞噬细胞介导的ADCP活性在预防HIV母婴传播中潜在作用的知识极为有限，本研究旨在建立一种严谨的方法，用于分离人骨髓细胞，以便对不同哺乳阶段获取的骨髓来源细胞所介导的ADCP进行研究。

方案

本研究中的每位参与者均根据西奈山人类受试者保护项目（PPHS）的指导和授权，在获得伦理与机构审查委员会（IRB）批准的情况下，采用经IRB批准的方案采集母乳样本并进行招募和访谈。

1. 靶向微球的制备

1. 选择一个相关的靶抗原。
   注意：在本示例中使用了重组蛋白 V1V2-2F5K，该蛋白设计用于模拟天然 HIV 包膜的三聚体顶端结构³⁰。
2. 根据制造商的说明书，使用商用试剂盒（材料表）进行生物素标记。
   1. 使用以下公式计算为实现5倍摩尔过量所需加入反应体系的生物素试剂毫摩尔数：mmol 生物素 = 蛋白液体积（mL）×（蛋白质量（mg）/蛋白液体积（mL））×（生物素毫摩尔数（mmol）/蛋白质量（mg））×（5 mmol 生物素/mmol 蛋白）。然后使用以下公式计算需加入的生物素试剂体积（µL）：µL 生物素 = mmol 生物素 ×（1,000,000 µL/L）×（L/10 mmol）^30,31。
   2. 打开前将生物素试剂平衡至室温。根据上述计算结果，将蛋白溶解于 0.5−2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制 10 mM 的生物素试剂溶液，并将适当体积的 10 mM 生物素试剂加入蛋白溶液中，冰上孵育 2 小时，或室温孵育 30 分钟。
3. 使用蛋白浓缩装置（聚醚砜 [PES] 膜，3 kDa 分子量截留值 [MWCO]，0.5 mL；材料表）按照制造商说明去除未反应的游离生物素。
   1. 将样品加入离心柱的上层腔室，加入 PBS 至总体积达 400 µL。盖紧盖子，将该样品腔室插入收集管中。在室温下以 12,000 × g 离心 30 分钟。
   2. 弃去滤过液，再加入 PBS 至 400 µL，重复离心步骤。再次弃去滤过液，加入 PBS 至 100 µL。使用分光光度计测定蛋白浓度。
      注意：蛋白可分装后于 -80 °C 冻存，待后续使用。

2. 抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）检测板的制备

1. 根据制造商说明书，将生物素标记的蛋白质与1 µm微球（“微珠”；材料表）进行偶联。
   1. 每孔偶联微珠，将6 µg蛋白质与12 µL储存液中的微珠在200 µL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中室温孵育1小时，每20分钟轻轻涡旋混匀一次。
   2. 在13,000 × g离心5分钟。弃上清液，轻轻涡旋并重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS缓冲液中。重复离心和洗涤步骤两次。最后重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS缓冲液中。
2. 在圆底96孔板中，每孔加入10 µL 微珠溶液。用12 µL含2%人血清白蛋白（HSA）的HBSS缓冲液配制待测抗体或免疫血清的系列稀释液，通常起始浓度为50 µg/mL抗体或1/100血清稀释度。
   注：在示例数据中，使用了单克隆抗体（mAb）830A。
3. 向微珠板每孔加入10 µL梯度稀释的抗体/血清，37 °C孵育2小时。每孔加入200 µL含2% HSA的HBSS缓冲液，将板在2,000 × g离心10分钟。
4. 迅速翻转板子并将孔中液体倾倒至水槽中，小心移除上清液，避免扰动不可见的微珠沉淀。

3. 乳腺细胞的分离

1. 使用双头电动或手动吸奶器，从健康的哺乳期女性获取人乳。在挤奶后约4小时内分离细胞，并将乳汁置于室温保存。
2. 将50 mL乳汁加入50 mL离心管中，在800 × g 条件下离心15分钟。小心倾去脱脂乳和脂肪层，避免扰动管底的细胞沉淀。使用无尘纸擦拭管内壁，以去除管壁上残留的所有脂肪。
3. 加入10 mL含2%人血清白蛋白的Hank’s平衡盐溶液（2% HSA HBSS [不含Ca²⁺或Mg⁺]）。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，以避免细胞活化和凋亡。将悬液转移至15 mL离心管中，在450 × g条件下离心10分钟。
4. 倾去上清液，并重复步骤1.3。随后根据预期细胞数量，用1−2 mL的2% HSA HBSS轻柔重悬细胞，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，并记录细胞活力。

4. ADCP 检测

注意：此处描述的方法改编自 Ackerman 等人³²。

1. 在 200 µL 的 2% HSA-HBSS 中加入 50,000 个 freshly isolated BM 细胞至每个 ADCP 检测板孔中。在 37 °C 下孵育 2 小时。
   1. 对于对照实验，在将细胞加入板孔前，先在 37 °C 下与 10 µg/mL 的肌动蛋白抑制剂（cytochalasin-D）、50 µg/mL 的 FcR 封闭剂（FcBlock）或两者联合孵育。
2. 在 930 × g 下离心 10 分钟。加入 200 µL 的 2% HSA HBSS 并重复离心。小心移除上清液（如步骤 2.7 所述），并重复洗涤一次。
3. 小心移除上清液，并使用 50 µL 的 2% HSA HBSS 中含 0.5 µg/mL（终浓度）的可固定活率染料 450 对细胞进行活率染色。室温避光孵育 20 分钟。在 930 × g 下离心 10 分钟，移除上清液（如步骤 2.7 所述）。加入 200 µL 的 2% HSA HBSS，再次离心后按步骤 2.7 所述移除上清液。
4. 完成活率染色后，对细胞进行白细胞标志物染色，至少包括针对 CD45 的特异性染色，例如在示例数据中使用优化浓度的 PE-小鼠抗人 CD45（克隆 HI30）（1 µg/µL，溶于 50 µL 的 1% BSA HBSS 中）。
   注意：可根据需要加入任何感兴趣的谱系特异性标志物。
5. 室温避光孵育 20 分钟。在 930 × g 下离心 10 分钟，移除上清液（如步骤 2.7 所述）。加入 200 µL 的 1% BSA HBSS 并重复离心。移除上清液。在室温避光条件下，用 200 µL 的 0.5% 甲醛固定细胞 30 分钟，或在 4 °C 下过夜。避光冷藏保存直至分析。

5.  流式细胞术分析

1. 在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图上进行初步设门，以排除双联体及碎片（尺寸小于 FSC = 5000 的物质）（见图1）。使用 SSC 与活率染料（本例中为 V450）图排除死细胞（活率染料阳性细胞）。
2. 利用 SSC 与 CD45 图区分主要的白细胞类别（粒细胞、单核细胞、淋巴细胞），具体方法已有广泛描述^33,34。
   注：此分类仅为初步提示，需借助谱系特异性标记物确认细胞类型。
3. 针对所有 CD45+ 细胞，或感兴趣的各个白细胞亚群，通过在荧光素异硫氰酸酯（FITC）通道的直方图中设门标记 bead 阳性细胞，以测定 ADCP 活性，其中荧光微球信号在此通道被检测。
   注：未添加微球的阴性对照孔可指示直方图中 bead 阳性细胞的位置，从而确定设门标记的位置。
4. 将 ADCP 评分计算为（bead 阳性细胞的中位荧光强度 [MFI]）×（bead 阳性群体中占总 CD45+ 细胞的百分比）。使用图形软件绘制各抗体/血清浓度下的评分曲线，并进行曲线下面积（AUC）分析。
   注：若 ADCP 评分的 AUC 超过非特异性阴性对照单克隆抗体（本例中为 3865）AUC 的 3 倍标准差，则判定为 ADCP 阳性。

结果

乳汁可保存在室温或较低温度下（但不可冷冻）；然而，由于我们观察到乳汁在极低温保存时细胞活力下降（数据未显示），且在常温下收集、短期储存和运输更为简便，因此建议不要将样本冷藏，以减少样本间的差异性。产后7−183天获取的乳汁中，通过自动细胞计数仪测定的细胞浓度范围为16,083−222,857个细胞/mL。图1展示了排除双联体、碎片和死细胞的设门策略。细胞活力约为90−99%。总活细胞中约有1.6−12.3%为CD45⁺白细胞（表1）。根据侧向散射光（SSC）与CD45设门结果提示，大多数所谓的单核细胞表现为前体细胞/未成熟细胞，与既往研究描述一致³⁴。这些所谓的单核细胞被定义为SSC^低-中等/CD45^低，仅有少数表现出较典型的血液单核细胞特征，即CD45染色强度更高，可与所谓的淋巴细胞群体（SSC^低/CD45^低）相区分（

讨论

本文所述基于流式细胞术的ADCP活性检测技术最初于2011年报道³⁰，此后已被证实具有良好的稳健性，并在80多项研究中被引用。此处描述的实验方案首次将该技术改进并应用于原代骨髓（BM）细胞。以往关于骨髓细胞Fc介导功能的研究主要局限于检测氧化爆发，或利用出生后0−4天内初乳中分离的细胞进行基于组织学的吞噬作用检测。几乎没有任何研究探讨人类骨髓中超过初乳阶段后的细胞功能。利用初乳细胞开展的研究普遍认为，初乳中的粒细胞活性低于从血液中分离的粒细胞，其行为类似于已迁移至血管外间隙的“渗出细胞”³⁵，尽管也有研究报道其吞噬和杀菌能力与血液细胞相似³⁶。

几十年来，传统显微镜技术被用于鉴定母乳中的白细胞，而这种视觉识别方法可能导致细胞误判¹。很少有研究对泌乳第一个月之后的母乳白细胞组成进行比较，大多数研究集中于初乳。使用流式细胞术鉴定细胞可能更准确地识别细胞类型，但目前采用该方法的母乳研究数量较少，且通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin标记微球	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE小鼠抗人CD45抗体	BD	560975
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	8810025
Corning V型底聚苯乙烯96孔板	Corning	3894
细胞松弛素D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-生物素试剂盒	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL圆锥形离心管	Corning	352196
Falcon 50 mL圆锥形离心管	Corning	352070
可固定的活力染料450	BD	562247
甲醛溶液	Sigma	252549
不含钙、镁和酚红的HBSS	Life Technologies	14175-095
人BD Fc阻断剂	BD	564219
人血清白蛋白	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes精细操作擦拭纸	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
聚苯乙烯10 mL刻度移液管	Corning	4488
蛋白浓缩管PES，3K截留分子量，0.5 mL	Pierce	88512