从人乳汁中分离白细胞用于针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

摘要

母乳可传播人类免疫缺陷病毒（HIV），但仅有约15%的HIV感染母亲所哺乳的婴儿会因此感染。哺乳婴儿每日摄入约10⁵−10⁸个母源白细胞，然而这些细胞的研究尚不充分。本文介绍了从母乳中分离白细胞的方法，并对其吞噬能力进行了分析。

摘要

即使在未使用抗逆转录病毒药物的情况下，由感染HIV的母亲进行母乳喂养的婴儿中，仅有约15%会感染，这表明母乳（BM）具有显著的保护作用。除非能够稳定获得清洁水源和合适的婴儿配方奶粉，否则世界卫生组织（WHO）不建议感染HIV的母亲停止母乳喂养。多种因素可能协同作用以降低母乳传播HIV的风险。母乳喂养的婴儿每日摄入约10⁵−10⁸个母体白细胞，但这些细胞对母乳抗病毒特性所起的作用仍尚不明确。本研究旨在从人乳母乳中分离细胞，以检测抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）——这是最重要且最普遍的先天免疫反应之一——即母乳吞噬细胞针对HIV靶标的ADCP活性。实验从5份处于不同哺乳阶段的人乳母乳样本中分离细胞。通过温和离心，随后仔细去除乳脂并反复洗涤细胞沉淀，完成细胞分离。使用包被HIV包膜（Env）表位的荧光微球作为靶标，用于ADCP分析。细胞用CD45表面标志物染色以鉴定白细胞。结果发现，在使用HIV特异性抗体830A的条件下，ADCP活性显著高于对照实验，并可重复检测。

引言

人乳（BM）中含有母体细胞，其中>90% 具有活性¹。细胞组成受泌乳阶段、母亲与婴儿健康状况以及个体差异的显著影响，而个体差异目前仍了解甚少^1,2,3,4。鉴于人乳中含有约 10³−10⁵ 个白细胞/mL，可估算出母乳喂养的婴儿每日摄入约 10⁵−10⁸ 个母源性白细胞⁵。多项体内研究表明，母源性白细胞为婴儿提供关键免疫力，并且其功能作用远超出最初摄入部位^{5,6,7,8,9,10,11}。婴儿摄入的所有母源性细胞均有可能与其自身白细....

方案

本研究中的每位参与者均根据西奈山人类受试者保护项目（PPHS）的指导和授权，在获得伦理与机构审查委员会（IRB）批准的情况下，采用经IRB批准的方案采集母乳样本并进行招募和访谈。

1. 靶向微球的制备

1. 选择一个相关的靶抗原。
   注意：在本示例中使用了重组蛋白 V1V2-2F5K，该蛋白设计用于模拟天然 HIV 包膜的三聚体顶端结构³⁰。
2. 根据制造商的说明书，使用商用试剂盒（材料表）进行生物素标记。
   1. 使用以下公式计算为实现5倍摩尔过量所需加入反应体系的生物素试剂毫摩尔数：mmol 生物素 = 蛋白液体积（mL）×（蛋白质量（mg）/蛋白液体积（mL））×（生物素毫摩尔数（mmol）/蛋白质量（mg））×（5 mmol 生物素/mmol 蛋白）。然后使用以下公式计算需加入的生物素试剂体积（µL）：µL 生物素 = mmol 生物素 ×（1,000,000 µL/L）×（L/10 mmol）^30,31。
   2. 打开前将生物素试剂平衡至室温。根据上述计算结果，将蛋白溶解于 0.5−2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。

结果

乳汁可保存在室温或较低温度下（但不可冷冻）；然而，由于我们观察到乳汁在极低温保存时细胞活力下降（数据未显示），且在常温下收集、短期储存和运输更为简便，因此建议不要将样本冷藏，以减少样本间的差异性。产后7−183天获取的乳汁中，通过自动细胞计数仪测定的细胞浓度范围为16,083−222,857个细胞/mL。图1展示了排除双联体、碎片和死细胞的设门策略。细胞活力约为90−99%。总活细胞中约有1.6−12.3%为CD45⁺白细胞（表1）。根据侧向散射光（SSC）与CD45设门结果提示，大多数所谓的单核细胞表现为前体细胞/未成熟细胞，与既往研究描述一致³⁴。这些所谓的单核细胞被定义为SSC^低-中等/CD45^低，仅有少数表现出较典型的血液单核细胞特征，即CD45染色强度更高，可与所谓的淋巴细胞群体（SSC^低/CD45^低）相区分（

讨论

本文所述基于流式细胞术的ADCP活性检测技术最初于2011年报道³⁰，此后已被证实具有良好的稳健性，并在80多项研究中被引用。此处描述的实验方案首次将该技术改进并应用于原代骨髓（BM）细胞。以往关于骨髓细胞Fc介导功能的研究主要局限于检测氧化爆发，或利用出生后0−4天内初乳中分离的细胞进行基于组织学的吞噬作用检测。几乎没有任何研究探讨人类骨髓中超过初乳阶段后的细胞功能。利用初乳细胞开展的研究普遍认为，初乳中的粒细胞活性低于从血液中分离的粒细胞，其行为类似于已迁移至血管外间隙的“渗出细胞”³⁵，尽管也有研究报道其吞噬和杀菌能力与血液细胞相似³⁶。

几十年来，传统显微镜技术被用于鉴定母乳中的白细胞，而这种视觉识别方法可能导致细胞误判¹。很少有研究对泌乳第一个月之后的母乳白细胞组成进行比较，大多数研究集中于初乳。使用流式细胞术鉴定细胞可能更准确地识别细胞类型，但目前采用该方法的母乳研究数量较少，且通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin标记微球	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE小鼠抗人CD45抗体	BD	560975
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	8810025
Corning V型底聚苯乙烯96孔板	Corning	3894
细胞松弛素D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-生物素试剂盒	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL圆锥形离心管	Corning	352196
Falcon 50 mL圆锥形离心管	Corning	352070
可固定的活力染料450	BD	562247
甲醛溶液	Sigma	252549
不含钙、镁和酚红的HBSS	Life Technologies	14175-095
人BD Fc阻断剂	BD	564219
人血清白蛋白	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes精细操作擦拭纸	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
聚苯乙烯10 mL刻度移液管	Corning	4488
蛋白浓缩管PES，3K截留分子量，0.5 mL	Pierce	88512