人类肠道器官脂滴形成特征化和定量的荧光测定

Summary

该协议描述了在脂肪酸刺激下人体肠道器官中脂液滴（LD）形成的表征测定。我们讨论了这种测定如何用于LD形成定量，以及如何用于影响LD形成的药物的高通量筛选。

Abstract

膳食脂质被肠道上皮作为游离脂肪酸（FAs）。这些FA在细胞内转化为甘油三酯（TG）分子，然后被包装成胆小微子，以输送到淋巴或细胞体脂液滴（LDs），用于细胞内储存。在TG合成的最后一步中，二乙二醇丙酸酶（DGAT）的催化活性是LD的形成的关键步骤。LD对缓冲有毒脂质物种和调节不同细胞类型的细胞代谢非常重要。由于人类肠道上皮经常面临高浓度的脂质，LD形成对于调节平衡非常重要。在这里，我们描述了一个简单的测定，在人类肠道有机体中最常见的不饱和脂肪酸（油酸）刺激时，对LD形成（LDF）的表征和定量。LDF 测定基于 LD 特异性荧光染料 LD540，它允许通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞测定对 LD 进行定量。LDF测定可用于表征人类肠道上皮细胞的LD形成，或研究影响LD代谢的人类（遗传）疾病，如DGAT1缺乏症。此外，这种测定也可用于高通量管道，以测试新的治疗化合物，恢复肠道或其他类型的有机体LD形成的缺陷。

Introduction

脂质是人类饮食的重要组成部分，在系统能量储存和代谢中起着重要的作用。摄入时，膳食脂质通过胰腺脂肪酶降解为游离脂肪酸（FFA）和单甘油酯（MGs）。这些基质然后由肠道上皮的肠细胞吸收，它们首先通过单甘油酯丙酸酶（MGAT）酶重新酯化为二甘油酯（DG），然后通过二乙醇对甘油三酯（TG）进行再酯化乙酰转移酶 1 （DGAT1）¹.最后，这些TG被集成到用于出口到淋巴系统的奇洛微米或细胞体脂滴（LDs）用于细胞内^{存储2，3。}虽然需要血小微子将膳食脂质分给其他器官，但细胞内脂肪储存在LD中的重要性并不完全清楚。然而，LDs已被证明在肠道中执行调节功能，因为它们在^餐4后缓慢释放脂质到循环16小时。此外，LD已被证明可以防止有毒脂肪酸浓度，如在脂肪^条件5小鼠脂肪细胞中。

DGAT1蛋白位于内质视网膜（ER）膜上，在肠道上皮的LD形成中起着至关重要的作用。DGAT1 中的同源突变导致早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或（致命）蛋白质损失的肠病，在脂肪摄入时出现肠道衰竭，说明 DGAT1 在人体脂质平衡中的重要性肠道上皮6，7，8，9，10。由于DGAT1缺乏症很少发生在人类身上，因此很少获得原发性患者衍生的细胞。此外，肠道上皮细胞的长期培养长期仅限于肿瘤衍生的细胞系，这些细胞系只代表正常生理。因此，DGAT1介导LD的形成主要研究在成纤维细胞或动物源细胞系7，10，11，12。因此，最近显示，DGAT1缺乏患者衍生成纤维细胞积累较少的LD与健康控制细胞在刺激后用油酸（OA）8。

以前，建立协议，培养从任何胃肠道器官的上皮干细胞的形式三维（3D）有机^体13。这些肠道器官可以长期保存在培养^中13，并允许功能研究患者和肠道位置特异性上皮^特征14。它们是遗传和表观稳定的，可以储存，允许长期扩张和生物^库13。

我们最近证明，LD形成可以很容易地在人体肠道器官在LD形成（LDF）^测定6中测量。当暴露于OA16小时，有机体产生LD，以保护细胞免受脂质引起的毒性。当OA浓度过高时，细胞通过卡巴塞介导凋^亡6死亡。LDF测定先前证明主要依赖于DGAT1，如从DGAT1突变患者中提取的有机体以及使用DGAT1特异性^抑制剂6所指示的。

对于此处详细描述的 LDF 测定，3D 有机体通过肠道活检培养，每周通过中断进入容易形成新有机物的单细胞。为了运行LDF测定，在24孔板的每个孔中镀有7，500个有机物衍生的单细胞。有机体在几天内形成，用1mM OA孵育过夜，并沾染LD540，一种荧光细胞渗透LD特异性染料，便于成像。然后，通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞仪对 LD 形成进行量化。

通过将此 LD 形成测定扩展至 96 井格式，该测定还可用于 LD 结型的高通量分析，以筛选影响人类肠道器官培养中 LD 形成的新药物，或研究影响 （人类遗传） 疾病LD 代谢。

Protocol

本文描述的所有使用人体组织的实验均获得乌得勒支大学医学中心（UMCU）伦理委员会的批准。在威廉米纳儿童医院（WKZ）-UMCU，获得患者对组织收集、生成、储存和使用组织的知情同意。

1. 文化媒体的筹备

注:此协议应在生物安全柜内执行。器官应按照标准细胞培养指南进行处理。

1. 准备基础培养基。
   注:没有生长因子的培养基被称为基础介质（BM）。
   1. 将 5 mL 的 HEPES （1 M）、5 mL L-谷氨酰胺 （100x） 和 5 mL 的青霉素-链霉素 （5，000 U/mL） 添加到 500 mL 的先进 Dulbecco 的改性 Eagle 介质中，使用 Ham 的营养混合物 F-12 制备 BM 介质。
   2. 将制备的BM介质储存在4°C下，最多使用2个月。
2. 根据制造商的协议准备R-spondin和Noggin调节介质（CM）。
   1. 简单地说，在555 mL培养基中，在没有选择性抗生素的情况下，用5 x 10⁷细胞在高烧瓶中将细胞生长到所需数量。
   2. 生长细胞4天，直到汇入。
   3. 将介质替换为 BM 和培养工具，再延长 8 天。
   4. 在37°C下培养8天后，在450 x g下收集培养基和离心机5分钟，以颗粒任何剩余的细胞。
   5. 过滤上清液，并将R-spondin或Noggin CM的等分在-20°C下储存，最长6个月。
3. 准备Wnt3A-CM根据Boj^等人15。
   1. 简单地说，在20 mL培养基中，用2 x 10⁶细胞在20 mL培养中，无需每盘选择性抗生素，在145 mm的培养皿中将细胞生长到所需数量。用塑料箔包裹每道菜，以避免培养基蒸发。
   2. 在37°C下培养8天后，在450 x g下收集培养基和离心机5分钟，以颗粒任何剩余的细胞。
   3. 过滤上清液，并将Wnt3A-CM的等分在4°C下储存最多2个月。
4. 准备有机体膨胀介质。
   注:人小肠器官扩张介质（见补充表1中的配方）称为hSI-EM。以下步骤将生成 1 L hSI-EM 的最终卷，并可根据需要向上或缩小。
   1. 将1.46克烟酰胺溶解在12 mL的细胞培养级磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，最终稀释1M。
   2. 在3 mL细胞培养等级PBS中溶解245毫克的n-乙酰半胱氨酸，最终稀释500mM。
      注:为了加速溶液的形成，烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸可以在37°C的水浴中孵育。两种解决方案都可以批量制备、无用，并储存在-20°C，以供将来使用。
   3. 过滤器通过0.22 μm过滤器将两种溶液消毒成无菌的15 mL管。
   4. 将 167 mL 的 BM 添加到无菌的 500 mL 培养基瓶中。将200 mL的R-Spondin-CM、100 mL的诺金-CM和100 μL的重组mEGF（500 μg/mL）添加到50纳克/mL的最终浓度。
   5. 加入10 mL的灭菌性烟酰胺溶液和2.5 mL的灭菌n-乙酰半胱氨酸溶液。加入20 mL的B27补充剂（50倍）。
      注:在此阶段，该介质称为 hSI-EM，无 WAS（Wnt3A-CM、A83-01 和 SB202190），可在 -20°C 中加引称和存储。如果介质被少量引用，则相应地调整以下步骤的浓度。
   6. 在 500 mL 的 hSI-EM 中，添加最后一批新鲜制备的 Wnt3A-CM 的 10 mL 和第二批 Wnt3A-CM 的 10 mL，以尽量减少 Wnt3A-CM 条件的变异性变化。
   7. 将 A83-01 添加到 500 nM 的最终浓度中，将 SB202190 添加到 10 μM 的最终浓度中。
   8. 将准备好的 hSI-EM（带 WAS）储存在 4°C 下，最多使用 2 周。
      注:当培养密码或单个细胞或从冷冻保存开始有机物时，在10μM（称为hSI-EM+Y）的最终浓度中加入额外的Y-27632。
5. 准备荧光活细胞分拣（FACS）缓冲液。
   1. 将10 mL的胎儿小牛血清（FCS）加入40 mL的PBS，而不加Ca^2+/Mg2+，最终浓度为10%FCS。
      注:FCS 可防止细胞粘附到实验室软件中。

2. 人类小肠器官的培养程序

注:此协议应在生物安全柜内执行。器官应按照标准细胞培养指南进行处理。在处理有机物或有机物衍生细胞时，应尽可能将细胞保存在冰上。当确保收获后几个小时，细胞将保持活力。有机体应在37°C的标准细胞培养箱中_培养，CO2为5%。这些条件适用于本方案内嵌入基膜基质（BMM;即 Matrigel）的有机体的所有孵育步骤。作者已经使用十二指肠衍生的有机物进行这些测定。

1. 传交有机物
   注意:每个有机体文化都有它自己的倍增时间。通常，小肠器官可以每7~10天通过1:3+1:5。当作为单个细胞通过时，传递效率可以高达1:20，具体取决于细胞密度。对于建立和维护，有机物在24孔板中养殖;在 24 孔或 96 孔板中进行 LDF 测定。
   1. 制备
      1. 在37°C、5%CO₂的培养箱中预温解压缩24孔组织培养板，至少过夜，最好提前5天。
         注:预加热细胞培养箱中的组织培养板，确保BMM含有机物液滴的正确形成和附着。
      2. 为了减少冻融循环的数量，请制备1 mL等分的BMM，并储存在-20°C。在开始有机体通过程序前，至少30分钟在冰上解冻一小瓶BMM。
      3. 在冰上保持一个50 mL的BM管作为洗涤介质。
      4. 按照第 1.4 节所述准备 hSI-EM，并准备适当量的 hSI-EM+Y，例如，对于完整的 24 孔板，为 15 mL。
   2. 收集器官。
      1. 小心吸出培养基，而不会干扰 BMM 的液滴。
      2. 将 500 μL 的冷 BM 添加到第一孔有机物中，并通过用 P1000 移液轻轻上下移液来破坏 BMM 液滴。
      3. 下一步与所需介质使用相同的介质重复此过程，但不要每 500 μL BM 收获超过 2 口井。
      4. 将有机物收集在低结合的1.5 mL微离心管中，在微型台式离心机中旋转15~20秒（最大2，000 x g）。用 P200 移液管完全吸气上清液，并取出介质的最后一位。
         注:当有机物培养物在显微镜下看起来干净且不包含任何死细胞或其他碎屑时，BMM 滴液可以直接在胰蛋白酶中采集，而不是步骤 2.1.2.2 中的 BM。步骤 2.1.2.3 之后，在步骤 2.1.3.1 中直接进行孵育。
   3. 将有机物分离成单个细胞。
      1. 向旋转的有机物添加400 μL的胰蛋白酶。在水浴中在37°C下孵育有机体5分钟。
      2. 用 P200 移液器轻轻上下移液，破坏细胞的剩余聚合体。再次，在37°C下在水浴中孵育5分钟。
      3. 使用 4 倍放大倍率检查显微镜下细胞解散的进度。当大块细胞仍然存在时，重复手动破坏和孵育。
      4. 当仅保留单个细胞时，加入 1 mL 的 BM，并在迷你桌面离心机中旋转细胞 15-20 s。
      5. 完全吸出上清液。使用 P200 移液器在 200 μL 的新鲜 hSI-EM 中重新悬浮单个细胞。再添加 800 μL 的 hSI-EM。
      6. 计算悬浮细胞的数量。
         注:在作者的实验室中，人工计数分离的有机体细胞比自动细胞计数器产生更可靠的结果。当使用自动细胞计数器时，下游应用的细胞密度应在内部进行测试，并在器官生长太少或过多时进行调整。
   4. 用于维持或脂质滴形成测定的种子有机物。
      1. 计算最终细胞密度所需的细胞体积。
         注:大约 250 个细胞/μL 是适当的密度。在 24 孔盘中，30 μL 种子入每个孔，而 5 μL 种子到 96 孔板的每个孔中。
      2. 拿出适当的悬浮液体积，将密度调整到750个单元/μL（或在密度过低时减速和重新悬浮）。
      3. 以 2:1 的比例将 BMM 添加到电池悬架中。这种混合物的最终细胞密度为250细胞/μL。通过移液轻轻混合悬浮液，小心避免任何气泡。
      4. 在预加热组织培养板中，在 24 孔板中每孔播种三个 10 μL 液滴，或在 96 孔板中每孔播种一个 5 μL 液滴。
      5. 将板置于 37°C 的培养箱中，将 CO₂ 5% 以 10-15 分钟固化 BMM 液滴。同时，在37°C的水浴中预温适量的hSI-EM+Y。
      6. 小心地将 500 μL 的预加热 hSI-EM+Y 添加到 24 孔板的每个孔中，或将 100 μL 添加到 96 孔板的每个孔中。在37°C、5%CO2和2⁄3天后将培养基细胞孵育到hSI-EM（不含Y），每周刷新2~3次。
         注:7~10天后，器官的维护培养物应再次通过。

3. 脂质滴形成测定

1. 油酸结合的制备
   注:由于油酸（OA）是疏水性的，不溶于水，它与牛血清白蛋白（BSA）结合。BSA可以结合多种脂肪酸分子，在这种情况下，使用1:8的比例，使油酸进入肠道细胞。游离脂肪酸和BSA都可以与塑料实验室用具结合。为确保最终浓度正确，尽可能使用玻璃瓶和玻璃移液器。
   1. 在室温下称量0.2克液体油酸。加入1.5 mL的培养级无菌PBS，将混合物加热至70°C，间歇1小时涡流。
   2. 重量为5.89克无脂肪酸BSA，溶解在33.9 mL的PBS中。在 37°C 的水浴中加热混合物，直到 BSA 完全溶解。
   3. 再次涡旋 OA 混合物，以创建细液滴的乳液，并使用玻璃移液立即将其添加到 BSA 溶液中。添加 OA 后，使最终溶液接近 37°C。最终混合物由 2.5 mM BSA 中的 20 mM OA 组成。
   4. 将混合物保持在37°C30分钟，直到透明呈黄色溶液。
   5. OA-BSA 偶联体可在-20°C 下加引并冷冻至少 6 个月。解冻等分后，在37°C孵育，直到云量溶解，混合物再次变清。
      注:由于最终溶液的蛋白质和脂质含量高，该混合物不能过滤灭菌或灭菌。当这些成分被小心处理时，尽可能在层流罩中使用无菌PBS时，作者没有经历微生物感染。
2. LDF 共聚焦测定
   1. 样品制备
      1. 第 2.1 节所述的通道有机物。在黑色清底96孔板中播种有机物衍生的单细胞。
      2. 在 hSI-EM 上的培养的第 6 天，用包含 1 mM OA-BSA 偶联的 hSI-EM 替换培养基。
      3. 在存在或不存在0.1μM DGAT1抑制剂的情况下，在37°C下孵育细胞16~17小时（过夜）。包括 2.5 mM BSA 的车辆控制。
      4. 16~17小时后，在不干扰BMM液滴的情况下吸气介质。在室温下，在井中加入100 μL的4%中性缓冲甲醛，固定有机物30分钟。
         注:甲醛将部分溶解BMM，而有机体沉入底部并粘附在板的底部。
      5. 轻轻去除甲醛，用每口井150μL的PBS仔细清洗。
      6. 在PBS中用0.025mg/mL LD540和4°，6-二酰胺-2-苯胺醇（DAPI）在室内温下，在室内温度下染色15分钟。
      7. 用PBS仔细清洗水井。
         注:如有必要，可以在此处暂停该协议。将PBS覆盖的样品在黑暗中保持在4°C。LD540 染色将保持稳定长达一周。这种测定也可以用活细胞进行，以监测一段时间内的LD形成。为此，必须在协议中省略固定，并且 DAPI 应替换为 Hoechst 染色。LD540 可在活细胞中以与所述相同的浓度染色 LD。
   2. 共聚焦成像
      注:成像可以在黑色透明底 96 孔板中制备的有机体样品上进行。
      1. 对于整个有机物的概述图像，请使用适合共聚焦荧光成像的 40x 物镜。
      2. 将显微镜设置为以 405 nm 激发和约 410–535 nm 发射波长对 DAPI 通道进行成像。对于 LD540 染料，请选择 540 nm（543 nm 最佳）的激励激光器，并将发射滤光片设置为 545–700 nm。
         注:在此协议中，使用了具有白光激光、光束分割器（AOBS）、10x/20x物镜和光谱检测系统的激光扫描共聚焦系统。这允许精确调谐到特定的波长。如果没有可比较的系统，请选择接近上述规格的激光线和短/长通滤波器。对于全有机体成像，分辨率为 512 x 512 或 1024 x 1024 足以进行下游图像分析。
      3. 将针孔大小设置为 1 个通风单元 （AU），以提供足够的 z 轴分辨率。
      4. 要对球形有机体的一半进行成像，将 z 堆栈设置为大约 85 μm。
   3. 图像分析
      注:在图像分析方面，斐济/ImageJ^16，17用于生成最大投影。分析可以使用任何图像分析软件包执行，该软件包允许进行最大投影、手动阈值和粒子分析。
      1. 使用 Fiji/ImageJ，将每个有机体的 z 堆栈转换为最大投影:图像|堆栈|Z 项目.
      2. 将最大投影的阈值设置为 BSA 车辆控制样本中看不到 LD540 信号的级别:图像|调整|阈值.使用这些设置来设置每个图像的阈值。
      3. 使用"分析"功能测量每个最大投影的荧光总面积 |分析粒子。
         注:虽然使用共聚焦显微镜的测定分辨率更好，但使用具有类似滤光片的荧光板读取器也可以分析此测定。为了对每口井的有机体计数进行标准化，LD540 信号应除以 DAPI 信号。最后，应减去 BSA 车辆控制的信号，以使测量值标准化。此方法允许将测定扩展到 96 孔板格式。
3. LDF 流式细胞测定
   1. 样品制备
      1. 第 2.1 节所述的通道有机物。在24孔组织培养板中播种有机物衍生的单细胞。每个条件两口井足以进行流式细胞测量。
      2. 在 hSI-EM 上的区域性第 10 天，用包含 1 mM OA-BSA 偶联的 hSI-EM 替换培养基。
         注:与共聚焦分析相比，在流动资金细胞测定中选择10天EM的生长，而不是6天。额外的4天的膨胀将导致光学重叠的有机物，这将使基于显微镜的测定复杂化。然而，更多的细胞有助于流动细胞学分析。
      3. 在存在或不存在0.1μM DGAT1抑制剂的情况下，在37°C下孵育细胞16~17小时（过夜）。包括 2.5 mM BSA 的车辆控制。
      4. 16~17小时后，收集第2.1.2节所述的有机物。
      5. 如第2.1.3节所述，将有机物分离到单个细胞中。
         注:虽然不是严格要求，但建议检查每个样本中的细胞计数。每个样本的总数为 10，000 个细胞是足够分辨率所需的绝对最小值。为了获得最佳效果，使用约 50，000~100，000 个细胞。
      6. 在迷你桌面离心机中旋转细胞15-20s。
      7. 在PBS中用500μL（0.025mg/mL LD540）和1微克/mL Hoechst在PBS中染色15分钟，在黑暗中室温下。
      8. 在迷你桌面离心机中旋转细胞15~20s，用PBS清洗3倍。
      9. 在室温下，将细胞重新悬浮在500μL的4%中性缓冲甲醛中15分钟，从而固定细胞。
      10. 用FACS缓冲液旋转细胞，洗涤3倍。
      11. 预冲洗FACS管与FACS缓冲液，以防止细胞粘在管壁。
      12. 在200 μL的FACS缓冲液中重新悬浮细胞，并将细胞悬浮液转移到预冲洗的FACS管中。
   2. 流式细胞测定分析
      1. 设置浇注参数以排除死细胞和细胞团块（请参阅代表性结果部分）。
      2. 在最终的封闭种群中，测量至少10，000个细胞，以取得可靠的结果。
         注:从这个种群中，LD540的平均荧光强度（MFI）和平均SSC-A信号一起提供了每个细胞LD形成总量的量度。

Results

为了正确分析LD形成，在用OA刺激和随后的染色之前，器官不应播种太密集。这对共聚焦和板读取器读出尤其重要，因为重叠的有机体可能会干扰荧光。显示了适当的有机物播种密度（图1A）和具有重叠有机物的培养物（图1B）。为了尽量减少OA样品刺激的变异性，在一个实验中，有机体大小和播种密度应在样品之间进行比较。这最好通过播种出相同数量的单个细胞来控制。然而，如果某些有机体线条始终表现出更高的重组效率，从而持续增加有机体计数，则可能需要进行一些调整。

在1mM OA过夜刺激后，LD形成可以通过倒置的明场显微镜进行可视化。LD的积累散射光，因此器官看起来更暗，而非刺激性有机物具有半透明外观（图1C）。

Discussion

在这里，我们提供一个协议，以确定在用油酸孵育时人类肠道器官的LD形成。该方法基于LD特异性荧光染料LD540^18，它允许在有机体培养物内对脂液滴的总体积进行表征和定量。建立和维持人类肠道器官培养的程序^已于13日前公布，并可提供该协议的视觉指南^以及15。

该协议的关键步骤是人体肠道器官的培养，以及OA与BSA的适当结合。器官培养需要正确配制培养基，因为干细胞群的维持高度依赖于功能性Wnt3A-CM。当 Wnt3A-CM 内部制造时，我们建议采用高度标准化的工作流程，并基于约 2 个月的过期时间每月生产空调介质。此外，连续 Wnt3A-CM 批次的 1:1 混合可产生更恒定的长期培养，因为它可确保稍微低于最佳的批次不会对有机体生长产生重大影响。

此外，我们的 BM 由先进的 DMEM/F12 介质组成，其中含有富脂 BSA。由于我们的车辆控制（12% BSA/BM）不会诱导有机体的LD形成...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高级 DMEM/F12	Gibco	12634-028
B27 添加剂	Gibco	17504-044
基底膜基质（基质胶）	BD Biosciences	356231
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 抑制剂 （AZD 3988）	Tocris Bioscience	4837/10
不含脂肪酸的 BSA	Sigma-Aldrich	A7030
甲醛	Klinipath	4078-9001
谷氨酰胺 （GlutaMAX， 100x）	Gibco	15630-056
HEPES （1 M）	Gibco	15630-080
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP8X
LD540			由乌得勒支大学 B. Spee 博士友情提供
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-100G
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636-500G
产生 Noggin 的细胞（HEK293-mNoggin-Fc 细胞）			MTA 与 J. den Hertog，Hubrecht 研究所
油酸	Sigma-Aldrich	O1008-5G
p38 MAPK 抑制剂 （p38i） （SB202190）	Sigma-Aldrich	S7067-25MG
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
不含 Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
青霉素-链霉素 （5,000 U/mL）	Gibco	15070-063
产生 R-spondin 的细胞（Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T 细胞）	R&D 系统	3710-001-01
TC 处理的 24 孔板	Greiner-One	662160
TC 处理的黑色透明底 96 孔板	康宁生命科学	353219
TGFb I 型受体抑制剂 （A83-01）	Tocris Bioscience	2939/10
胰蛋白酶 （TrypLE Express）	Life Technologies	12604021
WNT-3A 生成细胞（L-Wnt-3A 细胞）			MTA 与 J. den Hertog，Hubrecht 研究所
Y-27632 二盐酸盐（Rho 激酶抑制剂）	Abcam	ab120129-10