严格厌氧/无氧条件下微生物培养的培养基制备

摘要

由于专性厌氧生物在接触氧气时无法生长，因此必须采用厌氧培养技术。本文展示了一种简单有效的方法，用于培养来自沼气厂的混合菌群，内容涵盖从培养基制备到气体和挥发性脂肪酸定量的全过程。

摘要

与好氧生物不同，严格厌氧微生物需要在无氧环境及通常较低的氧化还原电位下才能启动生长。由于氧气在空气中无处不在，维持培养体系中氧气的缺失₂在整个培养过程的所有步骤中维持无氧条件具有挑战性，但这是厌氧培养的先决条件。本文所述方案展示了一种利用简单且低成本的方法，成功培养源自沼气厂的厌氧混合菌群的技术。方案详细描述了整个无氧培养流程，包括培养基制备、培养瓶的灌装、添加氧化还原指示剂和还原剂以实现低氧化还原电位，以及更换顶空气体以确保培养基不含氧气。此外，还提供了无菌接种气密性血清瓶（使用无菌注射器和针头）及适宜培养条件的详细说明。本方案还涵盖了气体和液体取样方法，用于后续通过气相色谱法（GC）分析气体组成，以及通过高效液相色谱法（HPLC）测定挥发性脂肪酸浓度，并结合理想气体定律计算沼气和甲烷产量。

引言

在地球上，分子氧在与大气直接接触的区域或在产氧光合生物存在的环境中以显著浓度存在。缺乏氧气的环境称为厌氧环境。然而，在厌氧条件下仍可通过两种不同的代谢过程实现能量转换，即发酵和厌氧呼吸¹。

在进行有氧呼吸的生物体中，氧气作为末端电子受体，而无氧呼吸则需要硝酸盐或硫酸盐等替代性电子受体²。在所谓的“电子塔”中，氧化还原电对按照其氧化还原电位排列，电位最负的位于顶部（电子供体），而具有正氧化还原电位的最强氧化剂则位于底部（电子受体）。电子在供体与受体之间的传递通过所谓的呼吸链实现能量守恒，电子可被不同层级的电子受体“捕获”——沿用该比喻——即电子塔的不同“楼层”。因此，电子在电子塔中下落的高度越高，相应反应所能守恒的能量就越多。因此，即使在无氧环境中，呼吸作用仍可进行，例如利用包含NO₃^-/NO₂^-、延胡索酸/琥珀酸、SO₃^2-/H₂S、S°/H₂S、Mn(IV)/Mn(II)、Fe(III)/Fe(II)等氧化还原电对的系统^2,3。首先，所产生的能量以膜电位形式储存，随后通过电子传递磷酸化过程，由膜结合的ATP合酶用于合成三磷酸腺苷（ATP）。与有氧呼吸相比，无氧呼吸所能守恒的能量可能显著减少；然而，大多数无氧呼吸的能量产出仍高于发酵——后者是在缺乏氧气及其他末端电子受体的生境中进行的一种无氧能量守恒途径²。

在发酵过程中，富含能量的有机底物被降解为多种发酵产物，这些产物通常决定了整个过程的名称，例如酒精发酵。与呼吸过程不同，发酵过程中的ATP生成仅限于底物水平磷酸化，即从富含能量的磷酸化底物向二磷酸腺苷（ADP）转移一个磷酸基团²。发酵微生物在有机物的厌氧降解中起着核心作用，是底物分解的关键参与者。初级发酵产物（如有机酸、醇类、CO₂ 和 H₂）可被次级发酵微生物进一步利用，生成乙酸、CO₂ 和 H₂。常见的发酵产物包括乳酸、多种挥发性脂肪酸（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸）、正丁醇、2,3-丁二醇、丙酮和乙醇。

在严格厌氧条件下培养微生物所需的方法和设备与好氧微生物的培养截然不同。尽管耐氧微生物通常可在琼脂平板上进行培养，即所谓的表面培养，但严格厌氧微生物几乎无法采用这种方法（仅少数例外）。因此，严格厌氧微生物的富集培养主要在液体培养基中进行，使用带有气密隔膜密封的培养容器，以确保顶空环境无氧^4,6,7。

本实验方案将提供从厌氧沼气池中获得的混合微生物群落中目标微生物的适宜培养方法。纯培养物的分离与培养更具挑战性，但不在本研究范围之内。

本文展示了一种基于厌氧消化含蛋白质底物过程中苯基酸形成研究的厌氧微生物群落培养方法⁸。该微生物群落包含厌氧消化四个阶段的成员：水解、酸化、产乙酸和产甲烷阶段。采用添加碳源、氧化还原指示剂、维生素和微量元素溶液以及还原剂的矿物盐培养基⁹，并在培养基中加入相应的含蛋白质的苯基酸前体底物⁸。

方案

1. 培养基的制备

1. 制备氧化还原指示剂储备液（0.1 g刃天青/100 mL水溶液）。
2. 制备维生素溶液（表1）。
3. 制备微量元素溶液（表2）。
   注意：添加顺序至关重要；请参考表2及相关实验方案。
4. 制备还原剂储备液（60 g Na₂S/L水溶液）。
5. 在合适的烧瓶中称取培养基成分（矿物盐培养基，表3）（例如，1 L螺口实验室烧瓶）。
   注意：根据实验设置，可能需要额外添加碳源。
6. 加入一半体积的蒸馏水（表3），并溶解各成分。
7. 根据表3加入1 mL氧化还原指示剂溶液。
8. 根据表3加入维生素溶液和微量元素溶液。
9. 根据表3中培养基/生物体的要求调节pH值。
   注意：氧化还原指示剂的颜色受pH影响，可能需要一定时间才能稳定。
10. 用蒸馏水定容至最终体积1 L。
    注意：维生素溶液和微量元素溶液也可在高压灭菌后，通过无菌操作将经滤膜除菌的等分试样（稀释溶液，滤膜孔径 < 0.2 µm）加入已预先封口并灭菌的血清瓶中。但此方法污染风险较高。

2. 培养瓶的灌装

1. 彻底清洁并干燥 120 mL 血清瓶。
   注意：血清瓶有不同体积规格（例如 20、60、120、250 mL）。
2. 彻底清洁并干燥丁基橡胶隔垫。
3. 在培养瓶中称量额外的培养基组分（例如苯酸前体底物）。
   注意：额外组分取决于实验设计和假设。
4. 向血清瓶中加入 50 mL 培养基。

3. 液相中氧气的还原/去除

1. 准备一个约 100 °C 的水浴。
2. 将装满的血清瓶放入水浴中，孵育约 20–30 分钟，以降低液相中 O₂ 的溶解度。
3. 立即用 N₂ 气体或其它气体（如 N₂/CO₂ 混合气体）冲洗顶空部分。
   警告：注意确保房间具有适当的通风。
4. 用丁基橡胶隔垫密封瓶口，并用铝盖固定。
   注意：在插入隔垫时，滴加一滴水或培养基可使其更贴合瓶口颈部。
5. 向每瓶含 50 mL 培养基的血清瓶中加入 0.1 mL 还原剂（储备液），以进一步降低氧化还原电位（每 50 mL 培养基加 0.1 mL 还原剂）。
6. 在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   警告：必须使用经认证可用于密闭容器灭菌的高压灭菌器。否则，因温度升高产生的过压可能导致血清瓶爆炸。

4. 培养基接种

1. 从厌氧消化器中制备接种物。
   1. 将 400 mL 蒸馏水加入一个烧瓶中并煮沸。
   2. 持续用 N₂ 冲洗顶空，冷却至（< 30 °C）。
   3. 加入约 100 g 来自厌氧消化器的污泥。
      注意：避免污泥与氧气过度接触。
   4. 记录所加污泥的精确质量，以准确计算稀释倍数。
   5. 用 N₂ 置换烧瓶顶空，并用丁基橡胶隔垫密封。
   6. 在 120 rpm 条件下振荡 30 分钟。
2. 使用注射器和套管吸取 5 mL 接种物，并注入按步骤 1–3 准备好的血清瓶中。

5. 培养、取样与分析

1. 将接种后的血清瓶在适合相应实验的温度下进行培养。
   注意：培养温度取决于实验设置和所使用的接种物。
   1. 当血清瓶中的液体达到培养温度并平衡后（约 15 – 30 分钟，具体时间取决于培养温度），使用注射器+套管针释放因温度升高产生的过压。
      警告：根据所用底物及其浓度、温度、培养时间、接种物类型和浓度的不同，瓶内过压可能升高至> 2 bar，可能导致血清瓶爆炸。因此，必须使用压力计监测过压，并通过套管针及时释放过压。
2. 在培养期间评估沼气产量及组分。
   注意：培养周期可持续数天至数周。
   1. 记录当前大气压。
   2. 准备压力计，并测定由微生物活性引起的瓶内压力。
   3. 轻轻摇动血清瓶。
   4. 使用注射器+套管针抽取 1 mL 顶空气体，并通过气相色谱法测定 H₂、O₂、CH₄ 和/或 CO₂ 的浓度。
      注意：为定性和定量检测 H₂、O₂、CH₄ 和 CO₂，采用气相色谱仪，操作温度分别为 160 °C（柱温箱）、100 °C（进样器）和 180 °C（热导检测器，TCD），以 N₂ 作为载气。具体细节请参见先前研究¹⁰。
3. 监测挥发性脂肪酸（VFA）和苯基酸的浓度。进行 VFA 和苯基酸分析时，使用配备紫外检测器（220 nm）的高效液相色谱系统（HPLC），以 5 mM H₂SO₄ 作为流动相。有关方法细节及样品保存的附加信息，请参见先前研究¹¹。
   注意：VFA 分析可作为许多其他理化分析或显微观察的代表性示例。此外，也可采用针对特定微生物丰度和/或实验某一时间点微生物群落组成的分子生物学方法，使用本描述的流程进行操作。
   1. 使用注射器+套管针取出 1 mL 液体。
      注意：样品可在取样后立即冷冻（-20 °C），并在实验结束时统一分析¹¹。
   2. 在 15,000–20,000 x g 条件下离心，并通过 0.2 µm RC（再生纤维素）滤膜过滤。
   3. 将 5–20 µL 样品注入 HPLC 系统，分析 VFA 组成及苯基酸浓度。
4. 使用套管针释放血清瓶内的过压。
   注意：在测定压力、气体组成并完成必要取样后，将培养瓶重新放回相应培养温度下，且在液体未达到培养温度前不得释放过压。
5. 根据理想气体定律，使用公式 1–3 计算标准化甲烷产量 V_CH4N。同时请参考 表 4。
   公式 1：
   其中
   公式 2：
   以及
   公式 3：
   注意：计算总沼气产量时，公式 2 和 3 中的 CH_4% 和 CH_4%X 应设为 100。NmL：标准条件（0 °C，1 atm）下的标准化气体体积，此时摩尔气体体积为 22.414 NmL/mmol。

结果

根据上述方案，在厌氧条件下向培养瓶中加入培养基，并检查其颜色是否合适（图1），随后将其用作进行厌氧消化的小型分批式生物反应器。向其中添加可能引起苯酸生成的底物，并以厌氧消化池污泥作为接种物进行培养（图2）。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，以及复杂的蛋白前体——肉浸膏和酪蛋白，分别以两种和三种不同浓度添加。对照组未额外添加底物。不同底物浓度旨在模拟不同程度的超负荷状态。培养瓶在37 °C（中温条件）下培养4周。

通过气相色谱法（GC TCD）¹⁰ 和顶空气压测定，定期监测沼气产量及成分（H₂、CH₄、CO₂）。图3 展示了在4周厌氧培养期间，不同浓度底物消化后累积甲烷产量的差异。此外，通过照射产甲烷过程中的电子载体辅酶F₄₂₀，可对产甲烷菌进行可视化观察，该辅酶在420 nm处具有吸收峰，并呈现蓝绿色荧光（图4）。

在进行气体分析的同时，采集样品用于通过高效液相色谱法（HPLC）测定挥发性脂肪酸（VFA）和苯基酸浓度¹¹，样品采集后冷冻保存，待后续处理。 图5 显示了不同过载阶段的影响，以乙酸为例，表现出在严重过载样品中该物质的积累情况。图6 描述了在培养期间苯基乙酸浓度的动态变化。

图1：氧化还原指示剂。 通过添加氧化还原指示剂，可控制培养烧瓶中的正确氧化还原电位。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：小型分批式生物反应器。 在120 mL培养烧瓶中制备的小型分批式生物反应器，用于厌氧消化实验。烧瓶中加入培养基，并接种稀释后的消化池污泥。反应器使用丁基橡胶塞和铝盖进行气密密封。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：甲烷产量。 在28天的中温培养期间，反映不同过载条件（低、中、高）的反应器中的累积甲烷产量。Cont：对照组；Tryp：色氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；ME：肉浸膏；Cas：酪蛋白。此图为改编自早期研究的示意图⁸。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：发出荧光的产甲烷菌。 当用紫外光激发时，产甲烷菌会发出蓝光。此处，产甲烷菌附着在植物颗粒（浅绿色）上。样品取自批次反应器，经稀释后立即用于显微镜观察和分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：乙酸浓度。 在反映不同过载条件（低、中、高）的反应器中，28 天中温培养期间的乙酸浓度变化。Cont：对照组；Tryp：色氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；ME：肉浸膏；Cas：酪蛋白。此图为改编自先前研究的示意图⁸。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：苯乙酸浓度。 在不同过载条件（低、中、高）的反应器中，经过 28 天中温培养期间苯乙酸的浓度变化。Cont：对照组；Tryp：色氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；ME：肉浸膏；Cas：酪蛋白。此图为改编自先前研究的图表⁸。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：刃天青反应。 蓝色的刃天青根据Uzarski等人的研究发生不可逆还原反应生成试卤灵（粉红色），并进一步发生可逆还原反应生成无色的二氢试卤灵¹²。 请点击此处查看此图的放大版本。

氰钴胺	0.050 g
4-氨基苯甲酸	0.050 g
D-生物素	0.010 g
烟酸	0.100 g
吡哆醇	0.250 g
D-泛酸	0.025 g
硫胺素盐酸盐 HCl	0.18 g
蒸馏水	1000 mL

表1：维生素溶液。

25% (w/v) HCl	10.0 mL
FeCl2 x 4 H2O	1.50 g
ZnCl2	0.070 g
MnCl2 x 4 H2O	0.100 g
H3BO3	0.006 g
CoCl2 x 6 H2O	0.190 g
CuCl2 x 2 H2O	0.002 g
NiCl2 x 6 H2O	0.024 g
Na2MoO4 x 2 H2O	0.036 g
蒸馏水	990.0 mL
配制建议	加入 HCl 并溶解 FeCl2，加入 100 mL 蒸馏水，溶解其余成分，最后定容至 1000 mL。

表2：微量元素溶液。

NaCl	1.0 g
MgCl2 x 6 H2O	0.4 g
KH2PO4	0.2 g
KCl	0.5 g
CaCl2 x 2 H2O	0.15 g
L-半胱氨酸	0.5 g
酵母提取物	1.0 g
刃天青溶液	1 mL
维生素溶液	1 mL
微量元素溶液	1 mL
蒸馏水	1000 mL
pH	7.2

表3：最低盐培养基。

变量	单位	描述
tY	[d]	测量时间点
tX	[d]	前一次测量的时间点
pM	[mbar]	在 tY 时刻测得的过压
pA	[mbar]	在 tY 时刻的环境压力
pAX	[mbar]	在 tX 时刻的环境压力
pS	[mbar]	标准压力，1013.25 mbar，依据 DIN 1343
TI	[K]	培养温度
TS	[K]	标准温度，273.15 K（相当于 0°C），依据 DIN 1343
VH	[ml]	在 tY 时刻的顶空体积
VHX	[ml]	在 tX 时刻的顶空体积
CH4%	[vol%]	根据气相色谱法在 tY 时刻测得的甲烷浓度
CH4%X	[vol%]	根据气相色谱法在 tX 时刻测得的甲烷浓度
VCH4T	[Nml]	在 tY 时刻血清瓶中的甲烷总量
VCH4R	[Nml]	在 tX 时刻顶空中残留的甲烷量
VCH4N	[Nml]	从 tX 到 tY 新生成的甲烷量

表4：方程1-3中变量的说明。

讨论

培养厌氧微生物最重要且最关键的步骤是确保培养基和培养瓶顶空中无氧气。可以使用刃天青等指示剂间接检测培养瓶内厌氧环境是否正确建立。刃天青是一种常用的氧化还原染料，因其价格低廉、无毒，且在低剂量和短时间孵育条件下即有效而被广泛使用¹²。当加入培养基后，蓝色的刃天青首先经历不可逆的还原反应生成粉红色的试卤灵（在中性pH值下呈粉红色）。该第一步反应可能在培养基加热过程中即发生 ¹³。随后，试卤灵通过可逆的第二步反应被还原为无色的二氢试卤灵（图7）¹²。试卤灵/二氢试卤灵氧化还原体系在标准氧化还原电位约为E_h = -110 mV时完全变为无色，当氧化还原电位高于-51 mV时则转变为粉红色¹³。

为了进一步降低氧化还原电位，例如促进已知需要低于 -200 mV¹⁴ 条件的产甲烷微生物的生长，可添加 Na₂S 溶液。此外，也可常用半胱氨酸盐酸盐（cysteine-HCl）、硫代乙醇酸钠（sodium-thioglycolate）或连二亚硫酸钠（sodium dithionite）。然而，具体应选用哪种还原剂取决于相应的实验条件，可能需要特别注意。例如，硫代乙醇酸钠需要通过温度激活（如高压灭菌）。

通过气相色谱法测定培养瓶顶空气体的组成，可进一步评估由多种细菌和古菌属组成的结构良好的微生物群落以及高效运行的厌氧降解级联过程。在处理来自不同前体的苯基酸类化合物时，对顶空气体的分析是快速检测产甲烷过程的一种有效方法⁸。在培养结束时，对照组中顶空气体的CH₄浓度约为50–60%，表明所添加的营养物质得到了有效利用，从而证实了在厌氧条件下有机物的 矿化作用。根据底物的元素分析结果，或通过估算底物中碳水化合物、蛋白质和脂肪的含量，可依据Buswell-Boyle方程在消化过程开始前（ex ante）计算出理论甲烷产量及预期的甲烷浓度。根据VDI 4630 ¹⁵，碳水化合物的理论沼气产量可达750 L kg^-1 VSS（50% CH₄ 和 50% CO₂），蛋白质为800 L kg^-1 VSS（72% CH₄ 和 28% CO₂），而脂肪则可达1,390 L kg^-1 VSS（60% CH₄ 和 40% CO₂）。

此外，还监测了挥发性脂肪酸（VFAs）和苯基酸的形成及其可能的后续降解过程。通过分析不同时间点的VFA浓度（如乙酸、丙酸），可评估降解过程。短链脂肪酸（如乙酸和/或丙酸）的积累可能表明产甲烷菌群组成出现紊乱以及反应器整体超负荷。然而，一个平衡良好的微生物降解级联过程甚至能够耐受极高的VFA和乙酸浓度⁹。此外，乙酸/丙酸比例可能进一步反映反应器的整体运行状况¹⁶。然而，有许多可用于过程监测的参数，需根据拟定的实验假设进行选择。在本示例中，目标变量为苯基酸浓度（图6）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养瓶（120 mL，N20）	Ochs, 德国	102046
丁基橡胶隔垫（N20）	Ochs, 德国	102049
铝盖（N20）	Ochs, 德国	102050
N2 气体	Messer, 奥地利		纯度 5.0
注射器 + 套管	多种品牌
压盖器	Ochs, 德国	102051
去盖器	Ochs, 德国	102052
GC2010	Shimadzu
Shin-carbon GC 色谱柱	Restek		用于 H2、O2、CH4 和 CO2 的色谱分离
HPLC Prominence	Shimadzu
Fast Fruit HPLC 色谱柱	Phenomenex		用于挥发性脂肪酸、苯基酸等的色谱分离