本文介绍一种用于检测支气管肺泡灌洗液或血清等生物液体中几丁质酶活性的简单方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
几丁质酶是一类能够切割几丁质的酶。即使在没有几丁质存在的情况下，哺乳动物体内仍含有大量几丁质酶，包括基础水平的表达。几丁质酶的确切功能尚不明确，但人们认为其在消化过程以及宿主防御含几丁质的食物和病原体方面分别发挥重要作用。近期的研究（包括我们的研究）表明，几丁质酶及类几丁质酶蛋白在宿主免疫和过敏性疾病中具有重要作用。尤为重要的是，几丁质酶活性可作为多种疾病严重程度的重要生物标志物，涵盖哮喘和肺纤维化等2型炎症性疾病。同样，戈谢病等遗传性疾病患者体内的几丁质酶水平显著升高，不仅与疾病严重程度相关，还可作为评估治疗效果的可靠生物标志物。本文所述方案介绍了一种简单、快速且直接的方法，用于检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）或血清样本中的几丁质酶活性。由于该类酶具有高度保守性，该方法可广泛适用于人类及其他模式生物。
引言
几丁质是地球上仅次于纤维素的第二丰富的多糖，作为多种生物体的主要结构成分，存在于昆虫、真菌、酵母和藻类的外骨骼中；某些脊椎动物体内也含有几丁质1。几丁质酶是一类能够降解几丁质的酶，在从细菌到哺乳动物的多种物种中高度保守2,3。除了几丁质酶外，哺乳动物还具有几丁质酶样蛋白，这类蛋白与几丁质酶相似，能够结合几丁质，但缺乏水解几丁质的酶活性4。
尽管对几丁质和几丁质酶的研究已有百年历史，最早可追溯到20世纪初，但研究重点主要集中在其于昆虫及其他无脊椎动物中的作用。事实上，直到20世纪60年代，人们才首次发现脊椎动物体内也存在几丁质酶。通过基于壳二糖酶的检测方法，已在多种脊椎动物的消化道中检测到几丁质酶的存在，包括蜥蜴和乌鸫；这一现象被认为可能与摄食含几丁质的生物（如昆虫）有关5。
哺乳动物有两种具有酶活性的几丁质酶：酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase；也称为 CHIT2 和 CHIA）和几丁质酶-1（CHIT1）4。这两种蛋白质均能够水解几丁质。然而，在人类中，CHIT1 的酶活性更强，几乎所有的几丁质酶活性均来源于 CHIT14。在小鼠中，Chit1 和 AMCase 对总体几丁质酶活性的贡献几乎相等6。另一方面，几丁质酶样蛋白则缺乏几丁质酶活性。
几丁质酶1（Chit1）主要由巨噬细胞分泌，通常被认为是针对含几丁质病原体的免疫应答7。研究表明，即使在没有底物几丁质存在的情况下，该酶也参与单核细胞向M1和M2两种巨噬细胞亚型的成熟过程8。此外，它还可能参与其他免疫细胞的成熟，包括辅助性T细胞2型（Th2）细胞和嗜酸性粒细胞——这一点在隐球菌肺部感染的研究中已得到证实9。这些研究提示几丁质酶在免疫系统中具有复杂的作用。
近年来，Chit1 水平已被发现可作为超过 40 种不同人类疾病进展的重要生物标志物，包括溶酶体贮积病、感染性疾病、呼吸系统疾病、内分泌疾病、心血管疾病、神经系统疾病及其他疾病（综述见10）。在许多此类疾病中，Chit1 水平是疾病严重程度和治疗效果的强有力预测指标10。
由于几丁质酶已被认为是包括戈谢病在内的多种医学状况的生物标志物，因此已开发出多种工具和检测方法以促进对几丁质酶存在的检测。传统方法包括Schales法（一种源自血糖检测的改良方案）以及3,5-二硝基水杨酸（DNS）法。然而，这些方法通常对时间敏感且技术操作难度较高11。这两种检测均需还原无机氧化剂（例如Schales法中的铁氰化物），从而产生颜色变化，但该变化只能通过分光光度法进行测定。此外，两种方法均包含加热或煮沸步骤，这一过程既耗时，又是显色反应所必需的12,13。
本文介绍了一种快速、简单的荧光测定法，用于检测哺乳动物样本中的几丁质酶水平14,15。本文所用的两种样本包括血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）；该方法也可用于检测母乳和尿液样本中的几丁质酶活性，并可应用于其他任何生物体液16,17。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均在耶鲁大学医学院经IACUC批准的方案下进行。
1. 小鼠样本采集
- 麻醉
- 使用氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行麻醉（氯胺酮剂量为100 mg/kg，赛拉嗪剂量为10 mg/kg）。
- 血液样本采集
- 通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度。
- 手术打开胸腔以暴露心脏。
- 将26.5 G针头插入左心室，并用注射器收集血液。
注意：通常，一只健康的20–25 g小鼠可采集约0.5–1 mL血液。 - 将血液收集至肝素化试管中用于血浆制备，或收集至非肝素化试管中用于血清制备。
- 支气管肺泡灌洗液（BAL）的采集
- 为采集BAL，在颈部做垂直切口以暴露气管。
- 使用22 G导管对气管进行插管，并用线绳固定以防止液体从小鼠鼻部泄漏。
- 通过气管缓慢注入两份无菌磷酸盐缓冲液（PBS，每份0.75 mL）至肺部，随后回收液体。
- 合并收集的灌洗液并置于冰上，以备后续分析。
- 生物样本处理
- 血液样本：新鲜样本（血浆）或在室温静置4 h促进凝固后（血清），于600 x g 离心10 min。取上清液，可冷冻保存或直接用于实验。
- BAL样本：于350 x g 离心5 min。取上清液，可冷冻保存或直接用于实验。
2. 几丁质酶活性测定
注意：该检测方法背后的科学原理相对简单。一种非荧光性底物被具有酶活性的几丁质酶切割，生成一种荧光产物，通过测量该产物可间接反映几丁质酶的活性。样品中的几丁质酶可降解1× McIlvain缓冲液中存在的底物4-甲基伞形基-D-N,N’-二乙酰壳二糖。反应中释放出荧光分子4-甲基伞形基。通过测定每个孔的总荧光强度，即可准确获得各样品中活性几丁质酶的含量。由于几丁质酶对几丁质的降解是一种水解反应，因此终止缓冲液（含0.3 M甘氨酸和NaOH的混合液，pH 10.6，NaOH浓度为12.0 g/L）通过创造一个碱性过强的环境使酶失去活性，从而终止几丁质的降解反应。
- 准备底物、标准品和溶液。
- 配制 McIlvain 缓冲液。McIlvain 缓冲液由 0.1 M 柠檬酸和 0.2 M 磷酸盐组成，pH 为 5.2。按 1:1 比例稀释得到 1x McIlvain 缓冲液。
- 将 4-甲基伞形基-D-N,N’-二乙酰壳二糖和 4-甲基伞形基-ß-D-N,N’,N”-三乙酰壳三糖分别溶于 1x McIlvain 缓冲液中，浓度均为 500 µM。
注意：储备液可于 -20 °C 保存以供后续使用；建议分装保存。 - 将标准品 4-甲基伞形酮溶于终止缓冲液（0.3 M 甘氨酸与 NaOH 的混合液，pH 10.6，含 NaOH 12.0 g/L）中，配制成 0.1 mM 的浓度，作为标准曲线储备液。
- 配制并加入工作液。
- 将 1x McIlvain 缓冲液与底物 4-甲基伞形基-D-N,N’-二乙酰壳二糖混合，配制成工作液。每处理 10 个样品，将 100 µL 底物与 2.17 mL 1x McIlvain 缓冲液混合。根据样品数量的其他计算方法参见 表 1。
注意：人源样品应使用 4-甲基伞形基-ß-D-N,N’,N”-三乙酰壳三糖。尽管两种底物均可被人或小鼠酶切割，但根据切割效率的不同，已分别指定用于人或小鼠样品6。 - 用移液器将 95 µL 工作液加入 96 孔板的每个孔中。
- 将 1x McIlvain 缓冲液与底物 4-甲基伞形基-D-N,N’-二乙酰壳二糖混合，配制成工作液。每处理 10 个样品，将 100 µL 底物与 2.17 mL 1x McIlvain 缓冲液混合。根据样品数量的其他计算方法参见 表 1。
- 向工作液中加入生物样本。
- 随后，向每孔加入 5 µL 待测样本（血液/BAL/组织裂解液/其他生物液体）。
- 将样本与工作液充分混匀，以获得最准确可靠的结果。
注意：样本应设置复孔或三复孔，并特别注意可能的边缘效应。所有样本应预先温育以尽量减少边缘效应。由于该检测涉及样本中几丁质酶与工作液中底物的反应，建议操作尽可能迅速，以最小化第一个样本与最后一个样本加样之间的时间差异。推荐使用多通道移液器。
- 在 37 °C 下孵育。
- 盖好板后短暂振荡（5 秒）。
- 在 37 °C 下孵育 15 分钟，使酶促反应充分进行。
- 制备标准曲线。
- 在样本孵育的同时，对常用作荧光法测定酶活性的标准品 4-甲基伞形酮进行系列稀释。
- 用终止缓冲液将标准品储备液稀释至 5 µM 的浓度。
- 按照 表 2 所示进行一系列稀释，加入指定体积的组分并充分混匀。
注意：标准曲线有助于确保所测样本的信号值落在标准曲线的线性范围内。
- 用终止缓冲液终止反应。
- 向每孔加入 200 µL 终止缓冲液以终止反应。
- 加入标准品。
- 在同一块板上，每孔加入 300 µL 各浓度标准品，设置复孔。
- 使用荧光读板仪读取结果。
- 在激发波长 360 nm、发射波长 455 nm 条件下读取板。
3. 数据分析
- 扣除空白值
- 对不含4-甲基伞形酮的各标准品稀释液的重复测定值取平均值，并从所有其他记录的数值中减去该平均值。
- 取技术重复样的平均值并绘制标准曲线。
- 对每个浓度的两个读数取平均值，并以平均读数对浓度作图。
注意：所得曲线应呈线性，且R2值接近1。若不符合此情况，可能需要重新制备标准品并重新读板，以确保数据分析的质量。
- 对每个浓度的两个读数取平均值，并以平均读数对浓度作图。
- 标准化读数结果。
- 对绘制的标准品数据拟合一条最佳直线，将样品的读数除以该最佳拟合直线的斜率。
- 比较对照组与实验组的数值。
- 使用t检验（两组间）或方差分析（ANOVA，适用于两组以上）判断组间差异是否具有统计学意义。结果的单位为nmol/mL·h。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处展示的结果来自一项研究，该研究检测了野生型（C57BL/6）和Chit1转基因小鼠（背景为C57BL/6）在饮用含多西环素的水后，其血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本中的几丁质酶活性。我们的数据显示，野生型小鼠在基线水平时，血清和BAL样本中均可检测到几丁质酶活性，分别为698.2 ± 189.9 nmol/mL·h和485.7 ± 114 nmol/mL·h。在饮用含多西环素的水诱导Chit1基因过表达4周后，与基线水平相比，BAL中的几丁质酶活性显著升高至4,575 ± 673.8 nmol/mL·h（p = 0.003），血清中也升高至1,556 ± 251.2 nmol/mL·h（p = 0.0272）。
利用本方案所述方法，该检测证实小鼠中Chit1基因的过表达会导致几丁质酶活性升高。采用t检验对两组均值进行比较。每组包含5只小鼠。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
几丁质酶活性已成为预测疾病严重程度、疾病进展、治疗效果以及特定病原体存在的一个重要生物标志物18。尽管关于几丁质酶作用的许多长期假说尚未通过实验验证19，但新近的研究已为几丁质酶及类几丁质酶蛋白在多种疾病中的作用提供了重要见解2,9,20。
本文所述方案是一种简单、快速且有效的测定生物样品中几丁质酶活性的方法。由于几丁质酶具有高度保守性，因此在测定多种生物样品和物种中的几丁质酶活性时，几乎无需对本方法进行修改。本方案列出了两种底物，其中一种指定用于小鼠样品，另一种用于人源样品；然而，这两种底物均可用于任一物种，其指定依据来自先前文献中关于酶切割该底物效率的验证结果。
与先前存在的方法（如 Schales 法和 DNS 法）相比，此处所述的检测方法无...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究得到了美国肺脏协会和美国胸科学会向LS提供的资助。作者诚挚感谢Jack Elias博士和Chun Geun Lee博士提供转基因小鼠品系。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-甲基伞形酮 | Sigma | M1381 | 标准品：常用于荧光测定法中检测酶活性 |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | 用于小鼠样本的荧光几丁质酶底物 |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | 用于人样本的荧光几丁质酶底物 |
| 柠檬酸一水合物 | 用于McIlvain缓冲液 | ||
| 甘氨酸 | 用于终止缓冲液，浓度为0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | 用于McIlvain缓冲液 | ||
| NaOH | 用于终止缓冲液，浓度为12 g/L | ||
| Vision板：非无菌、未处理黑色96孔板 | 4titude | 4ti-0224 |
参考文献
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78(1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
