本文介绍一种用于检测支气管肺泡灌洗液或血清等生物液体中几丁质酶活性的简单方法。
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本文内容
摘要
摘要
几丁质酶是一类能够切割几丁质的酶。即使在没有几丁质存在的情况下，哺乳动物体内仍含有大量几丁质酶，包括基础水平的表达。几丁质酶的确切功能尚不明确，但人们认为其在消化过程以及宿主防御含几丁质的食物和病原体方面分别发挥重要作用。近期的研究（包括我们的研究）表明，几丁质酶及类几丁质酶蛋白在宿主免疫和过敏性疾病中具有重要作用。尤为重要的是，几丁质酶活性可作为多种疾病严重程度的重要生物标志物，涵盖哮喘和肺纤维化等2型炎症性疾病。同样，戈谢病等遗传性疾病患者体内的几丁质酶水平显著升高，不仅与疾病严重程度相关，还可作为评估治疗效果的可靠生物标志物。本文所述方案介绍了一种简单、快速且直接的方法，用于检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）或血清样本中的几丁质酶活性。由于该类酶具有高度保守性，该方法可广泛适用于人类及其他模式生物。
引言
几丁质是地球上仅次于纤维素的第二丰富的多糖，作为多种生物体的主要结构成分，存在于昆虫、真菌、酵母和藻类的外骨骼中；某些脊椎动物体内也含有几丁质1。几丁质酶是一类能够降解几丁质的酶，在从细菌到哺乳动物的多种物种中高度保守2,3。除了几丁质酶外，哺乳动物还具有几丁质酶样蛋白，这类蛋白与几丁质酶相似，能够结合几丁质，但缺乏水解几丁质的酶活性4。
尽管对几丁质和几丁质酶的研究已有百年历史，最早可追溯到20世纪初，但研究重点主要集中在其于昆虫及其他无脊椎动物中的作用。事实上，直到20世纪60年代，人们才首次发现脊椎动物体内也存在几丁质酶。通过基于壳二糖酶的检测方法，已在多种脊椎动物的消化道中检测到几丁质酶的存在，包括蜥蜴和乌鸫；这一现象被认为可能与摄食含几丁质的生物（如昆虫）有关5。
哺乳动物有两种具有酶活性的几丁质酶：酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase；也称为 CHIT2 和 CHIA）和几丁质酶-1（CHIT1）4。这两种蛋白质均能够水解几丁质。然而，在人类中，CHIT1 的酶活性更强，几乎所有的几丁质酶活性均来源于 CH....
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方案
所有动物实验均在耶鲁大学医学院经IACUC批准的方案下进行。
1. 小鼠样本采集
- 麻醉
- 使用氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行麻醉（氯胺酮剂量为100 mg/kg，赛拉嗪剂量为10 mg/kg）。
- 血液样本采集
- 通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度。
- 手术打开胸腔以暴露心脏。
- 将26.5 G针头插入左心室，并用注射器收集血液。
注意：通常，一只健康的20–25 g小鼠可采集约0.5–1 mL血液。 - 将血液收集至肝素化试管中用于血浆制备，或收集至非肝素化试管中用于血清制备。
- 支气管肺泡灌洗液（BAL）的采集
- 为采集BAL，在颈部做垂直切口以暴露气管。
- 使用22 G导管对气管进行插管，并用线绳固定以防止液体从小鼠鼻部泄漏。
- 通过气管缓慢注入两份无菌磷酸盐缓冲液（PBS，每份0.75 mL）至肺部，随后回收液体。
- 合并收集的灌洗液并置于冰上，以备后续分析。
- 生物样本处....
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结果
此处展示的结果来自一项研究，该研究检测了野生型（C57BL/6）和Chit1转基因小鼠（背景为C57BL/6）在饮用含多西环素的水后，其血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本中的几丁质酶活性。我们的数据显示，野生型小鼠在基线水平时，血清和BAL样本中均可检测到几丁质酶活性，分别为698.2 ± 189.9 nmol/mL·h和485.7 ± 114 nmol/mL·h。在饮用含多西环素的水诱导Chit1基因过表达4周后，与基线水平相比，BAL中的几丁质酶活性显著升高至4,575 ± 673.8 nmol/mL·h（p = 0.003），血清中也升高至1,556 ± 251.2 nmol/mL·h（p = 0.0272）。
利用本方案所述方法，该检测证实小鼠中Chit1基因的过表达会导致几丁质酶活性升高。采用t检验对两组均值进行比较。每组包含5只小鼠。
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讨论
几丁质酶活性已成为预测疾病严重程度、疾病进展、治疗效果以及特定病原体存在的一个重要生物标志物18。尽管关于几丁质酶作用的许多长期假说尚未通过实验验证19，但新近的研究已为几丁质酶及类几丁质酶蛋白在多种疾病中的作用提供了重要见解2,9,20。
本文所述方案是一种简单、快速且有效的测定生物样品中几丁质酶活性的方法。由于几丁质酶具有高度保守性，因此在测定多种生物样品和物种中的几丁质酶活性时，几乎无需对本方法进行修改。本方案列出了两种底物，其中一种指定用于小鼠样品，另一种用于人源样品；然而，这两种底物均可用于任一物种，其指定依据来自先前文献中关于酶切割该底物效率的验证结果。
与先前存在的方法（如 Schales 法和 DNS 法）相比，此处所述的检测方法无.......
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致谢
本研究得到了美国肺脏协会和美国胸科学会向LS提供的资助。作者诚挚感谢Jack Elias博士和Chun Geun Lee博士提供转基因小鼠品系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-甲基伞形酮 | Sigma | M1381 | 标准品：常用于荧光测定法中检测酶活性 |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | 用于小鼠样本的荧光几丁质酶底物 |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | 用于人样本的荧光几丁质酶底物 |
| 柠檬酸一水合物 | 用于McIlvain缓冲液 | ||
| 甘氨酸 | 用于终止缓冲液，浓度为0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | 用于McIlvain缓冲液 | ||
| NaOH | 用于终止缓冲液，浓度为12 g/L | ||
| Vision板：非无菌、未处理黑色96孔板 | 4titude | 4ti-0224 |
参考文献
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology....
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重印与许可
