方法文章

用于测试 Vivo 中巨噬菌体招募的异位化学表达模型

DOI：

10.3791/60161

⸱

2019年9月25日

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1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

本文内容

摘要

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为了测试化学金对体内巨噬细胞招募的影响，使用整个原位杂交检测化学体异位表达，免疫染色用于标记巨噬细胞。实时成像用于实时观察巨噬菌体迁移。

摘要

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斑马鱼在基础和生物医学研究中被广泛使用。许多斑马鱼转基因线目前可用于标记各种类型的细胞。由于斑马鱼的胚胎体透明，研究一种化学素对体内某类细胞行为的影响是很方便的。在这里，我们提供了一个工作流程，以调查化学体内巨噬菌体迁移的功能。我们构建了一个组织特异性过度表达质粒，以过度表达IL-34，并将质粒注入单细胞级转基因鱼胚胎中，其巨噬细胞被荧光蛋白专门标记。然后，我们使用全安装荧光原位杂交和免疫染色来检测化学体表达的模式以及巨噬细胞的数量或位置。注射的WT胚胎被培养成稳定的转基因线。最后，利用共聚焦活成像直接观察稳定转基因鱼的巨噬行为，研究IL-34对体内巨噬细胞的功能。

引言

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斑马鱼是一种原产于印度的热带硬骨淡水鱼。在基因保护方面，斑马鱼与人类1的相似度为87%。通过研究斑马鱼的基因调节、蛋白质功能和细胞行为，如迁徙、增殖et.al等，我们可以对人类的相关课题进行见解。斑马鱼胚胎可用于观察抑制色素后不同阶段早期胚胎的发育。同时，斑马鱼只需三个月就能发育成性成熟，斑马鱼每4天就能产下数百个卵。体积小，繁殖简单，繁殖能力强，这些优势使斑马鱼养殖非常节省空间，有利于大规模养殖。传统的哺乳动物模型小鼠的维护成本比斑马鱼高，因此限制了小鼠饲养的规模。在早期胚胎发育方面，由于母子宫小鼠胚胎发育的特点，小鼠胚胎在活体条件下难以观察。相反，斑马鱼胚胎在外部发育和透明，因此在显微镜下很容易观察。此外，斑马鱼很容易为相关基因功能研究构建各种转基因线。目前，各种斑马鱼转基因线可用于标记不同类型的细胞。现在，在特定位置构造转基因线来过度表达化学素，并研究化学素对斑马鱼细胞行为的作用是非常方便的。

在这里，我们提供了一个工作流程，使用斑马鱼转基因线来研究IL-34对体内巨噬细胞行为2，3，4，5，6，7的功能。

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方案

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注:所有样品均通过苯基尿酸（PTU）蛋水处理，以抑制色素。

1. Tg的生成 （fabp10a: il34） 转基因构造和鱼类注射

  1. 将斑马鱼的 2.8 kb fabp10a启动子8和 IL-34 编码区域 （ENSDART00000126460.3） 克隆到 pTol2 矢量中，以生成 fabp10a-il34 构造。将结构与转座酶mRNA一起注入单细胞阶段Tg（mpeg1:GFP）和WT鱼胚胎。 将fabp10a-il34注射WT胚胎注射到成人9，并通过原位杂交识别转基因创始人。
    注:如果另一条转基因线是使用相同的转波系统，则将Tol2结构直接注入另一个转基因物可能会有问题。一般的做法是建立一个独立的转基因线，然后与另一个记者线跨越新的线。这可确保新的转因对先前插入的转基因不会产生影响。

2. 荧光全山原位杂交 （WISH） 与免疫染色相结合

  1. 样品固定
    1. 收集瞬态注射或稳定的IL-34转基因线的胚胎，在所需阶段与Tg（mpeg1:GFP）交叉....

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结果

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斑马鱼协议中涉及的步骤如图2所示。首先，我们生成了 pBLK-fabp10a-il34-sv40 构造，其中il34由fabp10a启动子驱动（图 2）。该结构被微注入单细胞阶段Tg （mpeg1:GFP）斑马鱼胚胎，可以标记巨噬细胞与GFP和WT胚胎，这些胚胎被培养成人，以产生转基因稳定线（图2）。il34的表达通过全支装荧原位杂交进行分析（图2和图3）。通过免疫染色对GFP标记的巨噬细胞进行分析（图2和图3）。我们使用活成像直接观察巨噬细胞是否会在3-3.5 dpf期.......

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讨论

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这里描述的协议允许我们研究化学对宏噬菌体体内行为的功能，并且该过程需要一些技术专长。总之，在协议中有几个关键步骤可以避免并发症:1） 选择一条合适的转基因线，显示特定且强的转基因信号，为感兴趣的细胞贴上标签;2） 选择适合成像和转基因基因过度表达的组织;3） 进行敏感和特异性的RNA探针;4） 选择适当的观察时间窗口，以准确捕获细胞行为。

在全坐式荧光原位杂交与免疫染色相结合过程中，用于检测基因表达的RNA探针应敏感，信号需要足够强。为了捕捉细胞行为的基因功能，应测试一系列时间点。例如，在观察il34对巨噬细胞迁移的影响时，虽然fabp10a启动子开始在2-3 dpf时表达，但当时肝脏中的巨噬细胞积累并不明显。只有4 dpf，肝脏巨噬菌体的富集才变得明显。此外，原位杂交后，后续免疫染色的信号强度将受到影响。例如，与GFP相比，DsRed在原位杂交后免疫荧光染色中很难着色，这可能是因为蛋白质结构不同。一般来说，全坐式荧光原位杂交后免疫染色的信号强度小于单免疫染色。

在使用共聚焦显微镜的活成像步.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢彭景荣博士分享Tg（fabp10a:DsRed）转基因线;温子龙博士分享Tg（mpeg1:GFP）转基因线;川口孝一博士提供pTol2向量。这项工作得到了国家自然科学基金（31771594）、广东省科技计划项目（2019A030317001）和中央高校基础研究基金（D2191450）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
Alexa 488-抗山羊抗体InvitrogenA11055
抗地高辛-HRP 珀金埃尔默NEF832001EA
山羊抗 GFP 抗体Abcamab6658
Reagent
CaCl2· 2H2OSigma21097
花青素 3 Plus 扩增试剂perkinelmerNEL745001KT
E2溶液15 mM 氯化钠 +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &微量;M KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
胎牛血清 （FBS）Life10099-133
甲酰胺钻石A100314
甘油 SigmaV900860
肝素钠SigmaH3149
杂交缓冲液（HB）50% 甲酰胺 + 5&次;SSC + 9 mM 柠檬酸钠 + 50 μg/ml 肝素钠 + 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
低熔点琼脂糖SigmaA9414
甲醇GHTECH1.17112.023
亚甲蓝 SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
多聚甲醛 （PFA）Sigma158127将 16 g PFA 悬浮在 400 ml 1x PBS 中，在 60 °C 下加热;C 溶解约 30 分钟。该溶液可提前制备并储存在 -4 °C。使用蒙版进行作。
10&次;PBS14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl + 2.4 g KH2PO4 在 1L ddH2O
苯硫脲 （PTU）SigmaP7629
1&次中;Plus 扩增稀释剂perkinelmerNEL745001KT
蛋白酶 K 发酵剂E00492
20&次;盐水柠檬酸钠 （SSC）175.3 g NaCl + 88.2 g 柠檬酸钠溶于 1 L ddH2O 中，PH 7.0
柠檬酸钠SigmaA5040
三卡因SigmaE10521
tRNA SigmaR6625
吐温20SigmaP2287
质粒
pBLK-fabp10a-il34-sv40用于 Tg （fab10a：il34）转基因品系生成
pBSK-il34用于 il34 探针制备
Fish
Tg （mpeg1： GFP）用 GFP
Tg （fabp10a： DsRed）标记巨噬细胞DsRed
Tg （fab10a：il34） 标记肝细胞在肝细胞中过表达 IL-34
用

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the....

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标签

IL 34 GFP

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