需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于体内测试巨噬细胞募集的异位趋化因子表达模型

5.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60161

⸱

2019年9月25日

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

本文内容

摘要

为了检测趋化因子对体内巨噬细胞募集的影响，采用整体原位杂交技术来检测趋化因子的异位表达，并使用免疫染色标记巨噬细胞。通过活体成像技术对巨噬细胞迁移进行实时观察。

摘要

斑马鱼被广泛应用于基础和生物医学研究。目前已有多种斑马鱼转基因品系可用于标记不同类型的细胞。由于斑马鱼胚胎身体透明，便于我们在体内研究某种趋化因子对特定细胞行为的影响。本文提供了一种研究趋化因子在体内对巨噬细胞迁移功能作用的工作流程。我们构建了一种组织特异性过表达质粒以过表达IL-34，并将该质粒注射到单细胞期的转基因鱼胚胎中，这些胚胎的巨噬细胞已被荧光蛋白特异性标记。随后，我们采用整体荧光原位杂交和免疫染色技术检测趋化因子的表达模式以及巨噬细胞的数量或定位。将注射后的野生型胚胎培育至成鱼，以建立稳定的转基因品系。最后，我们利用共聚焦活体成像技术直接观察稳定转基因鱼中巨噬细胞的行为，从而在体内研究IL-34对巨噬细胞的功能作用。

引言

斑马鱼是一种原产于印度的小型热带硬骨淡水鱼。在基因保守性方面，斑马鱼与人类基因组的相似度高达87%1。通过研究斑马鱼中的基因调控、蛋白质功能以及细胞行为（如迁移、增殖等），可为我们理解人类相关生物学问题提供重要启示。通过抑制色素生成，可利用斑马鱼胚胎在不同发育阶段观察早期胚胎的发育过程。此外，斑马鱼仅需三个月即可发育至性成熟，并且每4天可产卵数百枚。体型小、繁殖简便、繁殖能力强等优势使得斑马鱼养殖极为节省空间，有利于大规模培养。相比之下，传统哺乳动物模型小鼠的维持成本较高，限制了其饲养规模。在早期胚胎发育研究方面，由于小鼠胚胎在母体子宫内发育，难以进行活体观察。相反，斑马鱼胚胎在体外发育且具有透明特性，因此易于在显微镜下观察。此外，斑马鱼非常易于构建多种转基因品系，用于相关基因功能的研究。目前已有多种斑马鱼转基因品系可用于标记不同类型的细胞。如今，构建在特定部位过表达趋化因子的转基因品系并研究趋化因子对斑马鱼细胞行为的影响已十分便捷。

本文提供了一种利用斑马鱼转基因品系在体内研究IL-34对巨噬细胞行为功能的工作流程2,3,4,5,6,7。首先，我们构建了基因il34的肝脏特异性过表达质粒，并将该质粒注射到单细胞期的Tg (mpeg1: GFP)斑马鱼胚胎中，该转基因品系可通过荧光蛋白GFP特异性地标记巨噬细胞。随后，我们采用整体荧光原位杂交和免疫染色技术，检测il34的表达模式以及巨噬细胞的数量或定位情况。将注射后的野生型胚胎培育以建立稳定的转基因品系。通过上述步骤，我们建立并验证了细胞因子表达品系，并直观评估了其对巨噬细胞分布的影响。最后，为了研究巨噬细胞对细胞因子的响应行为，我们利用共聚焦活体成像技术直接观察巨噬细胞的迁移过程，从而在体内确认il34对巨噬细胞迁移的功能作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有样品均用苯硫脲（PTU）卵水处理以抑制色素形成。

1. 生成 Tg (fabp10a:il34) 转基因构建体并进行鱼类显微注射

  1. 将斑马鱼的 2.8 kb fabp10a 启动子8 和 IL-34 编码区（ENSDART00000126460.3）克隆至 pTol2 载体中，构建 fabp10a-il34 重组质粒。将该构建体与转座酶 mRNA 共同注射到单细胞期的 Tg(mpeg1: GFP) 和野生型（WT）鱼胚胎中。将注射了 fabp10a-il34 的野生型胚胎培育至成鱼9，并通过原位杂交鉴定转基因 founder 鱼。
    注意： 若待注射的转基因鱼系本身也是利用相同的转座子系统构建的，则直接将 Tol2 构建体注射到该转基因鱼中可能会出现问题。通常的做法是先独立建立一个新的转基因品系，再将该品系与另一个报告基因品系进行杂交。这样可确保新插入的转基因不会对先前已整合的转基因产生影响。

2. 荧光整体原位杂交（WISH）联合免疫染色

  1. 样品固定
    1. 收集在所需发育阶段的瞬时注射样品或稳定 IL-34 转基因系与Tg (mpeg1: GFP)杂交得到的胚胎。
      注意：本实验中，胚胎在受精后 4 天（dpf）收集。（如需要）可用注射器去除卵膜。
    2. 用 4% 多聚甲醛（PFA）在 4 °C 下固定胚胎过夜，或在室温（RT，约 25 °C）固定 2 小时。
    3. 用含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤胚胎，每次 5 分钟，共 3 次。
    4. 分别用 PBST 中的 50% 甲醇（50% 甲醇/PBST）和 100% 甲醇对胚胎进行脱水处理，每次 5 分钟。然后更换为新鲜的 100% 甲醇，并在 -20 °C 下保存（至少 2 小时）。
      注意：本步骤可暂停实验流程。
  2. 探针杂交（第一天）
    1. 用 PBST 中的 50% 甲醇（50% 甲醇/PBST）将上一步的胚胎重新水化，然后用 PBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    2. 在室温（RT）下用蛋白酶 K 的 PBST 溶液消化胚胎（终浓度：10 µg/mL；在 PBST 中按 1:2000 稀释）。
      注意：消化时间取决于胚胎发育阶段：受精后 36 小时（hpf）以内无需消化；36 hpf 至 2 dpf 胚胎，消化 3–5 分钟；2–3 dpf 胚胎，消化 10 分钟；3–4 dpf 胚胎，消化 15 分钟；4–5 dpf 胚胎，消化 15–20 分钟；5–6 dpf 胚胎，消化 20–27 分钟；>6 dpf 胚胎，在室温（约 25 °C）下消化 25–30 分钟。
    3. 弃去消化液，用 4% PFA 在室温下再次固定 20 分钟。
    4. 用 PBST 洗涤胚胎 2 次，每次 10 分钟。
    5. 弃去 PBST，加入预热的杂交缓冲液（HB 缓冲液），在 65 °C 下预杂交 5 分钟，然后将 HB 缓冲液回收至原管中。
    6. 使用新的预热 HB 缓冲液，在 65 °C 下继续预杂交至少 1 小时。
    7. 将探针9（本实验使用的是il34探针，浓度为 1 ng/mL）在 65 °C 下预热至少 10 分钟。然后将 HB 缓冲液回收至原管中，加入预热的探针，在 65 °C 下杂交过夜。
  3. 抗体处理（第二天）
    1. 将 50% 甲酰胺/2× 柠檬酸钠-氯化钠缓冲液（含 Tween 20，SSCT）、2× SSCT 和 0.2× SSCT 预热至 65 °C。
    2. 将探针回收至原管，并在 -20 °C 下保存。
    3. 分别用 50% 甲酰胺/2× SSCT、2× SSCT 和 0.2× SSCT 在 65 °C 下洗涤胚胎，每种溶液洗涤 3 次，每次 20 分钟，或 2 次，每次 30 分钟。
    4. 用 PBST 洗涤胚胎 3 次，每次 5 分钟。
    5. 用 600 µL 封闭缓冲液（含 5% 过滤胎牛血清（FBS）的 PBST）在室温下封闭样品 1 小时。
    6. 加入 400 µL 抗地高辛-辣根过氧化物酶（Anti-digoxigenin-HRP）抗体溶液（用封闭缓冲液按 1:1,000–1:2,000 稀释），在 4 °C 下孵育胚胎过夜。若信号较弱，可使用 1:500 的抗体稀释比例。
  4. 显色与一抗孵育（第三天）
    1. 弃去抗体溶液，用 PBST 在室温下洗涤胚胎 6 次，每次 20 分钟。
    2. 用 30 µL 1× Plus 扩增稀释液在室温下冲洗样品 5 分钟。
    3. 用移液器吸弃稀释液；将荧光素酪胺储备液（Cy3 Plus 扩增试剂或 Cy5 Plus 扩增试剂，本实验使用 Cy3）按 1:50 比例稀释于 1× Plus 扩增稀释液中，配制荧光素酪胺工作液。每个样品准备 50–100 µL 工作液。
    4. 在室温避光条件下，将样品在荧光素酪胺工作液中孵育 5–15 分钟。若信号较弱，可将孵育时间延长至 30 分钟。
    5. 用 PBST 更换工作液以终止反应，并观察信号。
    6. 用 PBST 在室温下洗涤胚胎 3 次，每次 10 分钟。
    7. 在 4 °C 下用一抗孵育样品过夜。本实验使用 Goat-Anti-GFP 抗体作为一抗。
  5. 二抗染色（第四天）
    1. 用 PBST 洗涤胚胎 4 次，每次 30 分钟。
    2. 在 4 °C 下用二抗孵育胚胎过夜。本实验使用 Alexa 488-Anti-Goat 抗体作为二抗。
  6. 拍照（第五天）
    1. 用 PBST 在室温下洗涤胚胎 3 次，每次 10 分钟。
    2. 将胚胎置于 70% 甘油中，避光保存于 4 °C 过夜，或 -20 °C 长期保存。

3. 活体成像

  1. 样本选择
    注意：    利用活体成像直接观察在3至3.5天（dpf）期间，经IL-34诱导后，Tg（fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP）转基因鱼的巨噬细胞是否会迁移至肝脏。此处使用Tg（fabp10a-DsRed）转基因品系标记肝脏区域并使其可见，以方便定位肝脏，并判断巨噬细胞是否迁移进入肝脏。成像前，使用荧光显微镜筛选DsRed和GFP双阳性胚胎。
  2. 鱼类固定
    1. 使用金属浴将1 mL的1%低熔点琼脂糖加热至90 °C以上，使其完全融化。
    2. 待低熔点琼脂糖冷却至体温后，加入50 µL的0.2%三卡因（tricaine），并将三卡因与琼脂糖均匀混合。
    3. 将麻醉后的胚胎转移至底部固定有盖玻片的小培养皿中，去除周围水分，缓慢将低熔点琼脂糖滴加至胚胎上，在琼脂糖凝固前仔细调整鱼体位置，使肝脏区域靠近培养皿底部的盖玻片。
    4. 待低熔点琼脂糖完全凝固后，小心地在其上方再覆盖一层琼脂糖以加固固定。
    5. 将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台，用含三卡因的E2溶液10覆盖鱼体，开始成像。
  3. 共聚焦显微镜软件操作
    1. 打开 ZEN black 2.3 软件，将活细胞培养工作站安装至显微镜载物台上。
    2. 点击 Locate | Incubation | Temperature，将温度设置为29 °C。
    3. 将培养皿置于活细胞工作站中央，用含三卡因的E2溶液10覆盖鱼体。
    4. 点击 Acquisition 菜单，在 Smart Setup 菜单中选择所需的扫描模式和激光器，然后选择 Z-Stack 和 Position。
    5. 点击 Experiment Designer 菜单，选择 Enable Multi Block Experiment；在第一个模块中，先用低倍镜找到样本，然后切换至高倍镜，使观察区域位于视野中央。
    6. 设置位置和Z-Stack参数，选择合适的激光强度、扫描层数和成像速度。
    7. 新建一个模块并重复上述步骤。完成所有模块设置后，设定适当的循环次数并开始记录（图1）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

斑马鱼实验方案的步骤如图2所示。首先，我们构建了pBLK-fabp10a-il34-sv40载体，其中il34基因由fabp10a启动子驱动（图2）。将该载体显微注射至单细胞期的Tg（mpeg1: GFP）斑马鱼胚胎以及野生型（WT）胚胎中，前者可利用GFP标记巨噬细胞，后者则培养至成鱼以建立稳定的转基因品系（图2）。通过整体荧光原位杂交法检测il34的表达情况（图2和图3）。利用免疫染色法分析GFP标记的巨噬细胞（图2和图3）。我们采用活体成像技术直接观察在il...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案可用于研究趋化因子在体内对巨噬细胞行为的功能影响，该操作流程需要一定的技术经验。简而言之，为避免实验过程中出现复杂问题，需注意以下几个关键步骤：1）选择一个合适的转基因品系，该品系应能对目标细胞产生特异且强烈的转基因信号；2）选择适合成像且便于进行转基因过表达的组织；3）制备高灵敏度和高特异性的RNA探针；4）选择合适的时间观察窗口，以准确捕捉细胞行为。

在整体荧光原位杂交结合免疫染色的实验过程中，用于检测基因表达的RNA探针应具有较高的灵敏度，且信号需足够强。为了捕捉基因功能对细胞行为的影响，应设置一系列时间点进行检测。例如，在观察il34对巨噬细胞迁移的影响时，尽管fabp10a启动子在2-3天时已开始表达，但此时肝脏中巨噬细胞的聚集尚不明显，直到4天时肝脏内巨噬细胞的富集才变得显著。此外，经过原位杂交后，后续免疫染色的信号强度会受到影响。例如，与GFP相比，DsRed在原位杂交后的免疫荧光染色中较难显色，这可能与其蛋白结构差异有关。总体而言，整体荧光原位杂交后的免疫染色信号强度通常低于单独进行的免疫染色。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢彭金荣博士分享Tg (fabp10a: DsRed)转基因品系；感谢温子龙博士分享Tg (mpeg1: GFP)转基因品系；感谢河上公一博士提供pTol2载体。本研究得到国家自然科学基金（31771594）、广东省科技计划项目（2019A030317001）和中央高校基本科研业务费专项资金（D2191450）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
Alexa 488-抗山羊抗体InvitrogenA11055
抗地高辛-HRP PerkinelmerNEF832001EA
山羊抗GFP抗体Abcamab6658
试剂
CaCl2· 2H2OSigma21097
氰基3 Plus扩增试剂PerkinelmerNEL745001KT
E2溶液15 mM  NaCl + 0.5 mM KCl + 1.0 mM MgSO4 + 150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 + 1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
胎牛血清（FBS）Life10099-133
甲酰胺DiamondA100314
甘油 SigmaV900860
肝素钠SigmaH3149
杂交缓冲液（HB）50% 甲酰胺 + 5×SSC + 9 mM 柠檬酸钠 + 50 μg/ml 肝素钠 + 500 μg/mL tRNA + 0.1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
低熔点琼脂糖SigmaA9414
甲醇GHTECH1.17112.023
亚甲蓝 SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
多聚甲醛（PFA）Sigma158127将16 g PFA悬浮于400 ml 1×PBS中，60 °C 加热约30分钟以溶解。该溶液可预先配制并储存于-4 °C。注意：操作时需佩戴口罩。
10×PBS14.2 g Na2HPO4 + 80 g NaCl + 2 g KCl + 2.4 g KH2PO4 溶于1 L ddH2O
苯硫脲（PTU）SigmaP7629
1×Plus扩增稀释液PerkinelmerNEL745001KT
蛋白酶K FermentasE00492
20×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）175.3 g NaCl + 88.2 g 柠檬酸钠溶于1 L ddH2O，pH 7.0
柠檬酸钠SigmaA5040
三卡因SigmaE10521
tRNA SigmaR6625
Tween20SigmaP2287
质粒
pBLK-fabp10a-il34-sv40用于Tg (fab10a:il34) 转基因品系构建
pBSK-il34用于il34 探针制备
鱼类
Tg (mpeg1: GFP)用GFP标记巨噬细胞
Tg (fabp10a: DsRed)用DsRed标记肝细胞
Tg (fab10a:il34)在肝细胞中过表达IL-34

参考文献

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045(2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: a practical approach. , Oxford University Press. New York. (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

IL 34 GFP
一种用于体内测试巨噬细胞募集的异位趋化因子表达模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。