需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于评估大鼠急性中风后脑功能恢复的临床前模型

8.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60166

⸱

2019年11月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Ltd., 2Hulunbuir People's Hospital, 3Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co. Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该 本研究旨在通过检测大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）后1至90天的脑梗死及感觉运动功能，建立并验证一种用于脑缺血恢复期及后遗症期研究的动物模型。

摘要

本研究旨在建立并验证一种适用于脑缺血恢复期及后遗症期的动物脑缺血模型。选用雄性Sprague-Dawley大鼠建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型。通过调整大鼠体重（260−330 g）、线栓型号（2636/2838/3040/3043）以及脑梗死时间（2−3 h），结合Longa评分和TTC染色法，筛选出Longa评分更高、梗死体积更大且模型成功率更高的条件。最终确定最佳模型条件为：300 g大鼠，使用3040型线栓，脑梗死时间3 h，并在再灌注后1−90天内通过感觉运动功能评估和梗死体积检测进行观察。在该条件下，双侧不对称性测试在1至90天均显示显著差异，网格行走测试在1至60天均显示显著差异；这两种测试均可作为合适的感觉运动功能评估方法。因此，本研究确定了适用于脑缺血恢复期及后遗症期的新型大鼠模型最适条件：300 g大鼠采用3040型线栓进行3 h脑梗死的MCAO手术，随后进行再灌注。合适的感觉运动功能检测方法为双侧不对称性测试和网格行走测试。

引言

脑缺血根据卒中后的不同指标分为三个阶段：急性期（1周内）、恢复期（1周至6个月）和后遗症期（6个月以上）。目前，大多数研究集中于脑缺血的急性期，因其效应显著且具有多种相关的研究模型1,2,3。然而，由于脑缺血的恢复期和后遗症期可导致长期残疾等并发症，这些阶段同样不容忽视。因此，本研究旨在探索一种稳定、可靠且相对简便的动物模型，用于脑缺血恢复期及后遗症期的研究。

在众多实验性脑缺血模型中，我们采用经线栓插入右侧大脑中动脉（MCA）以阻塞该动脉的方法，即大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。该模型类似于人类脑卒中，可产生较大的梗死体积，引发多种与脑卒中相关的功能障碍，并可通过移除线栓实现血液再灌注（R）4,5,6。MCAO/R模型也被认为是脑缺血研究的金标准动物模型7。此外，脑损伤的严重程度取决于线栓的直径和插入长度、脑缺血持续时间以及动物体重（较大的大鼠具有更大的脑体积和更粗的脑血管）8。因此，通过调整线栓类型、梗死时间及大鼠体重，可以为MCAO/R大鼠脑缺血的恢复期和后遗症阶段建立合适的模型。为验证该大鼠模型的有效性，我们对MCAO/R模型进行了1天、35天、60天和90天的系列研究，采用TTC染色法及感觉运动功能实验（包括双侧不对称性测试、网格行走测试、转棒实验和提绳实验）进行评估。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

动物实验程序及动物受试者的使用已获得美国国立卫生研究院（National Institute of Health）关于实验动物护理和使用的批准。本方案已针对大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）和感觉运动功能测试进行了专门调整。

1. 实验设计与分组

  1. 采用大鼠MCAO/R模型，通过Longa评分和TTC染色筛选脑损伤更严重、模型成功率更高的大鼠脑缺血模型方法。
    1. 实验使用7−9周龄、体重为260−330 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。实际体重分别为：275 g组为275 ± 15 g，300 g组为300 ± 10 g，320 g组为320 ± 10 g。
    2. 采用以下七组分组（体重、线栓类型、梗死时间）：第1组15只大鼠（275 g，2636，2 h）；第2组15只大鼠（275 g，2636，3 h）；第3组15只大鼠（275 g，2838，2 h）；第4组15只大鼠（275 g，2838，3 h）；第5组13只大鼠（300 g，3040，3 h）；第6组10只大鼠（320 g，3040，3 h）；第7组13只大鼠（300 g，3043，3 h）。
  2. 通过TTC染色研究脑组织恢复情况，并在MCAO/R术后第1、35、60、90天采用双侧不对称试验、网格行走试验、转棒试验和提尾试验等适当的传感器运动功能检测，评估长期功能缺陷。
    1. 使用8−9周龄、体重为300 ± 10 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。
    2. 采用以下五组分组：对照（正常）组20只大鼠；第1天组16只大鼠；第35天组16只大鼠；第60天组17只大鼠；第90天组19只大鼠。
  3. 在完成步骤1.1的Longa评分或步骤1.2的传感器运动功能测试后，对所有大鼠进行麻醉并断头，用于TTC染色。

2. 建立大鼠单侧大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型9

注意：操作过程中应轻柔使用显微镊子，以防血管破裂。分离血管时，避免损伤大鼠颈部的神经及其他血管。所有可存活的外科手术操作均须采取适当的无菌技术。视频中展示的技术应在整个操作流程中反复练习。

  1. 手术过程中，使用小型动物恒温仪将大鼠体温维持在 37.0 ± 0.5 °C。准备四根 6 cm 长的 5-0 缝线。
  2. 将小型动物麻醉机（配备废气处理装置）的氧气流速设置为 0.4−0.6 L/min，异氟烷浓度设为 5%。将大鼠放入麻醉机中。
  3. 动物失去意识后，将其置于手术固定台上。将大鼠口腔连接至麻醉机面罩（氧气流速保持不变；将异氟烷浓度调整为 3%）。通过观察肢体无张力、角膜反射消失及无痛觉反应，确认动物已进入深度麻醉状态。
  4. 使用纸胶带（或其他工具）将大鼠四肢固定于手术台上。
  5. 使用电动剃毛器去除颈部毛发，并用 75% 酒精消毒（碘伏效果更佳）。用挂钩固定大鼠口腔。
  6. 使用眼科剪沿颈部中线纵向切开 2−3 cm。
  7. 分离颈总动脉。使用眼科镊分离皮下肌肉组织，使用自制拉钩充分暴露术野。先用眼科镊分离气管前方肌肉，再沿右侧胸锁乳突肌腱向内侧分离，直至暴露颈总动脉。
  8. 使用眼科镊分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用 5-0 缝线结扎颈总动脉（打死结）、远离心脏端的颈外动脉（打死后结）以及颈内动脉（打松结）。在靠近心脏端的颈外动脉处预留一根 5-0 缝线（不打结）。
  9. 插入线栓。使用眼科剪在颈外动脉上剪开一小口，轻柔插入线栓。结扎已预留的颈外动脉缝线（收紧松结），并剪断颈外动脉残端。
    1. 松开颈内动脉的松结，继续将线栓向大脑中动脉起始部推进（线栓上有标记），直至到达预定位置。然后剪除外露的线栓部分。
  10. 达到缺血时间（2–3 小时）后，用一把显微镊夹住颈外动脉残端，另一把显微镊轻柔地将线栓抽出。当线栓前端完全退出颈内动脉时，结扎之前预留的颈外动脉缝线，随后完全拔出线栓。
  11. 松开颈总动脉的结扎线，在创面涂抹约 50,000 U 的青霉素钠粉末以预防感染。使用 4 针缝合皮下肌肉和皮肤。
  12. 将大鼠放回笼中后，使用 1 mL 注射器经皮下注射约 0.2 mL 无菌生理盐水（SQ-PEN 注射更佳），以预防术后脱水。
  13. 再灌注 24 小时后，根据 Longa 评分10筛选动物。选择 Longa 评分为 1−3 分的动物用于下一步 1.1 节的 TTC 染色实验，选择评分为 2−3 分的动物用于下一步 1.2 节的 1、35、60、90 天研究。
    注意：Longa 评分10：0 分，无神经功能缺损；1 分，左侧前爪伸展不能；2 分，向左侧转圈；3 分，向左侧倾倒；4 分，无法自主行走且意识抑制。
  14. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对 Longa 评分进行统计分析。数据以均值 ± 标准差（S.D.）表示。P < 0.05 表示差异具有统计学意义。

3. TTC 染色

注意：使用前需将大鼠脑切片模具和刀片在 -20 °C 冰箱中预冷，以防止因温差过大导致粘连。染色过程中应避免脑切片与培养板之间发生粘连，以免造成染色不充分。

  1. 在步骤1.1中的Longa评分或步骤1.2中的感觉运动功能测试后，通过腹腔注射400 mg/kg水合氯醛对大鼠进行麻醉。
  2. 使用手术剪或大鼠断头器将大鼠断头，随后用手术剪和止血钳取出脑组织。
  3. 将脑组织置于-20 °C冰箱中30分钟，以便后续切片。
  4. 从冰箱中取出脑组织，放入预冷的大鼠脑切片模具中，使用预冷刀片将脑组织连续切成六个2 mm厚的切片。
  5. 在6孔培养板中用2% 5-三苯基-2H-四氮唑氯化物（TTC）对切片进行染色。
  6. 将切片置于37 °C摇床中孵育30−60分钟，每10分钟翻动一次，直至脑缺血区域与正常区域分别清晰呈现白色和红色。
  7. 将脑切片按从后到前的顺序垂直排列，使用直尺确保每行总长度一致，用数码相机拍照。
  8. 分析梗死体积。
    1. 使用Photoshop软件预处理照片
      1. 使用Photoshop CS6导入照片。00:00-00:14
      2. 点击选择以选中脑切片，再点击选择 | 反向。00:15-00:36
      3. 点击前景色选择黑色，然后点击确定。00:37-00:42
      4. 按Alt + Delete填充背景色，再按Ctrl + D取消选区。00:43-00:46
      5. 点击文件 | 保存至桌面。00:47-01:08
    2. 使用Image Pro Plus软件预处理照片。
      1. 打开Image Pro Plus 6.0软件并导入照片。01:09-01:24
      2. 进行缺陷修正，使用对比度增强工具调节亮度，使背景呈黑色。01:25-01:37
      3. 在滤镜中使用中值工具去除高光区域。01:38-01:46
    3. 使用Image Pro Plus软件计算左侧（正常）脑区面积
      1. 使用分割功能选择颜色，并调节H/S/I值，使脑切片与黑色背景分离。01:47-02:12
      2. 返回到计数 | 大小。02:13-02:16
      3. 在编辑中点击计数 | 分割对象，将脑组织与中线分离。软件将自动区分左右脑区面积。02:17-02:49
    4. 使用Image Pro Plus软件计算右侧梗死脑区面积
      1. 执行步骤3.8.1–3.8.2。02:50-03:14
      2. 选择计数 | 大小。03:15-03:21
      3. 在编辑中点击绘制 | 合并对象工具，手动选择缺血区域，点击计数以计算缺血面积。03:16-05:31
    5. 使用Image Pro Plus软件计算健康脑区面积
      1. 执行步骤3.8.1–3.8.2。05:32-06:44
      2. 使用分割功能选择颜色，并调节H/S/I值，使脑切片的正常部分与黑色背景分离。06:45-07:10
      3. 返回到计数 | 大小，点击计数以计算该区域面积。07:11-07:21
      4. 在编辑中点击分割对象，将脑组织与中线分离。软件将自动区分左右脑区面积。07:22-08:08 ​
  9. 计算梗死体积（%）和梗死与萎缩体积（%）：

    梗死体积（%） = [右侧梗死面积 / (2 × 左侧脑面积)] × 100。
    梗死与萎缩体积（%） = [(左侧脑面积 - 右侧健康脑面积) / (2 × 左侧脑面积)] × 100。

    注：右侧脑为损伤部位。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。结果以均值 ± 标准差表示。P < 0.05 表示差异具有统计学意义。

4. 感觉运动功能评估

注意：选择具有2−3分Longa评分的大鼠（300 g，3040型螺栓，脑梗死时间3 h）进行1至90天的感运动功能实验。研究期间应保持环境安静，避免干扰动物。数据采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析。图中数值以均值±标准差（mean ± S.D.）表示。P < 0.05 表示差异具有统计学意义。

  1. 双侧不对称性测试11
    1. 用纸胶带（5 cm 长，0.8 cm 宽）以相同压力缠绕大鼠每只前爪的隐静脉部位三圈。
    2. 对每只大鼠，使用摄像机记录在 5 分钟内每只前爪接触并移除胶带的次数，包括未受影响爪子的次数和受影响爪子的次数。
    3. 30 分钟后，重复步骤 4.1.1 和 4.1.2。
    4. 计算感觉运动偏倚的平均值（%）：
      感觉运动偏倚（%）=（未受影响爪子次数 - 受影响爪子次数）/（未受影响爪子次数 + 受影响爪子次数）× 100
  2. 网格行走测试
    1. 将大鼠置于一个抬高的网格平台中央（面积：1 m2；高度：90 cm），网格孔径为 2.5 cm2。
    2. 轻轻推动大鼠臀部，促使其在网格表面行走。
    3. 使用摄像机记录在 1 分钟内未受影响（右侧）和受影响（左侧）肢体发生的踏空次数以及总步数。
    4. 计算错误次数：
      错误次数（%）= [未受影响（右侧）肢体踏空次数 - 受影响（左侧）肢体踏空次数] / 总步数 × 100。
      注：剔除总步数少于 20 步的数据。
  3. 转棒疲劳测试12,13
    1. 通过配套软件在计算机上设置大鼠转棒疲劳仪（直径 90 mm），在 5 分钟内将转速调至 13 rpm。
    2. 启动计算机程序的同时将大鼠放置于转棒的踏杆上。
    3. 当大鼠从踏杆上掉落或持续行走满 5 分钟时结束试验，并记录旋转时间。
    4. 让大鼠休息 30 分钟。
    5. 再重复步骤 4.3.2−4.3.4 两次，取最大值作为最终旋转时间。
  4. 悬吊绳测试14
    1. 将悬吊绳装置（高 70 cm；绳子直径 0.2 cm，长 40 cm）放置在桌面上。
    2. 让大鼠用前肢抓住绳子并使其悬吊。
    3. 记录悬吊时间并计算评分。
      注：评分 3 分：在绳上 0−2 秒；评分 2 分：在绳上 3−4 秒；评分 1 分：在绳上 5−6 秒；评分 0 分：在绳上超过 7 秒。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用上述MCAO/R模型建立方法并结合Longa评分和TTC染色，通过使用不同处理条件，包括大鼠平均体重（275/300/320 g）、线栓型号（2636/2838/3040/3043；表1）、缺血时间（2-3 h）以及1天再灌注，筛选出最适合的大鼠脑缺血模型。结果显示，以300 g体重、3040型线栓、3 h脑梗死时间作为模型参数时，脑梗死范围最大，Longa评分最高，模型成功率也最高。该方案相较于传统的275 g体重、2636型线栓、2 h脑梗死时间处理具有显著改善（图1）。

此外，选取体重为300 g的大鼠，采用3040型螺栓，脑梗死时间为3 h，Longa评分在2−3分之间，对其进行感觉运动功能测试（包括双侧不对称性测试、网格行走测试、转棒测试和悬吊绳测试）以及TTC染色，以研究脑缺血后1-90天的恢复情况。在MCAO/R术后1、35、60和90天时，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

许多用于建立急性脑缺血研究的方法和行为学指标的模型，在脑缺血的恢复期和后遗症期可能并无显著变化16,17。然而，处于脑缺血恢复期和后遗症期的患者数量最多。因此，为缺血性脑卒中的恢复期和后遗症期选择合适的动物模型至关重要。

我们采用大鼠MCAO/R模型，筛选出适合的体重范围（260−330 g）、线栓类型（2636/2838/3040/3043）以及脑梗死时间（2-3 h），以获得最严重的梗死损伤、较高的模型成功率和明显的行为学指标，适用于脑缺血的恢复期及后遗症阶段研究。

体重为300 g、使用3040螺纹螺栓且脑梗死时间为3 h的大鼠具有更大的梗死体积、更严重的行为缺陷以及更高的模型成功率（图1）。此外，我们通过TTC染色和感觉运动功能测试（双侧不对称性测试、网格行走测试、转棒测试和提绳测试）对大鼠模型进行了再灌注后1–90天的验证。研究发现，双侧不对...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金（81603315，81603316）、重点研发计划 &中国江西省#38; D计划（20171ACH80001），中国福建省高校产学合作项目（2018Y41010011）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖显微镜Leica (德国)S8显微手术仪器
刀片Gellette/切割脑组织切片
恒温振荡床太仓实验设备厂THZ-C使脑切片染色均匀并保持恒温
数码相机Canon700D用于拍摄TTC染色图像
电动剃毛器上海宇言科学仪器有限公司3000#去除大鼠颈部毛发
止血镊上海医疗器械有限公司14 cm用于取出脑组织
Image Pro Plus 软件Media Cybernetics Inc.6.0分析梗死体积
异氟烷RWD生命科学217170702麻醉气体
显微镊上海金钟医疗器械有限公司10 cm血管微操作
显微剪上海金钟医疗器械有限公司10 cm血管微操作
眼科镊上海金钟医疗器械有限公司10 cm辅助皮肤和肌肉解剖
眼科剪上海金钟医疗器械有限公司10 cm用于剪开颈部皮肤
大鼠脑切片模具上海宇言科学仪器有限公司400 g用于标准、均匀地切割脑组织
大鼠转棒疲劳仪安徽正华生物仪器设备有限公司ZH-300B检测感觉运动功能
小动物麻醉机上海宇言科学仪器有限公司ABM3000气体麻醉机
小动物恒温仪北京大迈达科技有限公司DM.7-YLS-20A手术过程中维持动物体温恒定
手术剪上海医疗器械有限公司16 cm用于断头及取出脑组织
缝合线上海金环医疗器械有限公司4-0 / 5-0用于皮肤和肌肉缝合 / 用于血管结扎
线栓北京辛诺科技有限公司2636/2838/3040/3043-A4大鼠大脑中动脉阻塞
5-三苯基-2H-四氮唑氯化物 (TTC)SigmaLOT#BCBP3272V脑切片染色试剂

参考文献

  1. Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112(2014).
  2. Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167(2014).
  3. Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243(2017).
  4. Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  5. Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
  6. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  7. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
  8. Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
  9. Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  11. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
  12. Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
  13. Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19(2016).
  14. DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
  15. Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
  16. Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
  17. Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

大脑中动脉闭塞大鼠脑缺血模型感觉运动功能测试TTC染色分析双侧不对称性测试网格行走测试螺纹栓插入脑梗死体积术后脱水预防外科无菌技术
一种用于评估大鼠急性中风后脑功能恢复的临床前模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。