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方法文章

评估小鼠中等热量 2:1 间歇性禁食的代谢效应

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DOI：

10.3791/60174

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2019年11月27日

 ,  ,  ,  , 
1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细的等热量2:1间歇性禁食方案，用于保护和治疗野生型及ob/ob小鼠的肥胖以及葡萄糖代谢障碍。

摘要

间歇性禁食（IF）是一种周期性限制能量摄入的饮食干预方式，被认为具有多种益处，并可对抗代谢异常。迄今为止，已有多种不同禁食和进食周期时长的IF模型被报道。然而，由于许多模型同时涉及时间限制和热量限制的多重因素，其结果的解读存在挑战。例如，常用于啮齿类动物的隔日禁食模型可能导致进食不足，提示该干预措施的健康益处可能通过热量限制和禁食-再进食循环共同介导。最近的研究成功表明，2:1间歇性禁食（即1天禁食后接2天进食）可在不减少总热量摄入的情况下，有效预防饮食诱导的肥胖并改善代谢。本文介绍了一种在小鼠中实施等热量2:1 IF干预的实验方案。同时描述了一种配对喂养（PF）方案，用于研究摄食行为改变的小鼠模型（如摄食过多）。通过采用2:1 IF方案，证明了等热量间歇性禁食可减少体重增加、改善葡萄糖稳态，并提高能量消耗。因此，该方案可用于研究间歇性禁食对多种疾病状态的健康影响。

引言

现代生活方式与较长的每日进食时间及较短的禁食期相关1。这导致了当前全球肥胖流行，并对人类代谢产生不利影响。禁食在人类历史上已有长期实践，其多种健康益处包括延长寿命、减少氧化损伤以及优化能量稳态2,3。在多种禁食方式中，一种称为间歇性禁食（intermittent fasting, IF）的周期性能量剥夺方式因其简便易行，已成为普通人群中广泛采用的一种饮食方法。近期在临床前和临床模型中的研究表明，IF 可提供与长期禁食和热量限制相当的健康益处，提示 IF 可能成为治疗肥胖和代谢性疾病的一种潜在策略2,3,4,5。

不同间歇性禁食方案在禁食持续时间和频率上有所差异。隔日禁食（即1天进食/1天禁食；1:1 IF）是啮齿类动物研究中最常用的间歇性禁食方案，用于探讨其对肥胖、心血管疾病、神经退行性疾病等健康益处的影响2,3。然而，如先前研究6,7所示，并在我们的能量摄入分析中进一步从机制上证实8，由于缺乏足够的进食时间来补偿能量损失，1:1 IF会导致进食不足（约80%）。这使得目前尚不清楚1:1 IF所带来的健康益处是由热量限制还是进食模式改变所介导的。因此，本文介绍了一种新开发的间歇性禁食方案，即2天进食/1天禁食（2:1 IF）模式，该模式使小鼠有足够时间补偿食物摄入量（约99%）和体重。随后将这些小鼠与自由进食（ad libitum，AL）组进行比较。该方案可在不减少热量摄入的情况下，用于研究等热量间歇性禁食对野生型小鼠的影响。

相比之下，在表现出摄食行为改变的小鼠模型中，随意进食（AL feeding）可能不是用于比较和考察2:1间歇性禁食（2:1 IF）效果的合适对照条件。例如，由于 ob/ob 小鼠（一种常用的肥胖遗传模型）由于缺乏调节食欲和饱腹感的瘦素，会表现出多食症，而采用2:1间歇性禁食（IF）的小鼠，其热量摄入量相比对照组减少约20% ob/ob AL喂养的小鼠。因此，为了恰当地检验和比较间歇性禁食（IF）的效果 ob/ob 小鼠实验中，应采用配对喂养组作为合适的对照。

总体而言，本文提供了一项全面的等热量2:1间歇性禁食（IF）实验方案，包括使用配对喂养作为对照。进一步证明，等热量2:1间歇性禁食可在野生型和ob/ob小鼠中保护其免受高脂饮食诱导的肥胖和/或代谢功能障碍。该方案可用于研究2:1间歇性禁食在多种病理状态下的有益健康影响，包括神经系统疾病、心血管疾病和癌症。

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方案

所有方法和实验方案均已获得渥太华大学动物护理与兽医服务中心（ACVS）以及表型基因组学中心（TCP）动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理委员会的标准。需要注意的是，此处描述的所有操作均应在机构和政府许可下，由具备专业技术能力的人员执行。所有小鼠均饲养在标准通风笼中，环境温度和湿度受控，光照周期为12小时光照/12小时黑暗（正常饲养条件为21–22 °C，湿度30%–60%），并可自由饮水。雄性C57BL/6J和ob/ob小鼠购自杰克逊实验室。

1. 2:1 等热量间歇性禁食方案

  1. 对于瘦型和饮食诱导肥胖小鼠模型，分别准备普通饮食（17% 脂肪，ND）或高脂饮食（45% 脂肪，HFD）。
    注意： 60% 高脂饮食可用于诱导严重的饮食诱导型肥胖；然而，由于饲料颗粒较软，每日摄食量的准确测量相对困难。自动化连续监测系统可提高对多种饮食类型的适用性。
  2. 在7周龄时，分别使用电子秤和EchoMRI测量每只小鼠的基线体重和体成分。
    注意： 请参见第3节的身体成分测量。
  3. 根据体重和体成分结果，将7周龄雄性C57BL/6J小鼠随机均分为两组：随意进食（AL）组和间歇性禁食（IF）组。
  4. 每笼放置两到三只小鼠，并确保自由饮水。
    注意： 每笼小鼠数量可能影响其摄食行为。建议在研究期间各组小鼠每笼数量保持一致。
  5. 在开始间歇性禁食（IF）方案前，提供1周时间以适应新的笼具环境和饮食。
  6. 禁食期：中午12:00将小鼠转移至带有新鲜垫料的清洁笼具中，IF组不提供食物，AL组则提供已称重的定量饲料。
    注意： 每个禁食周期中，需为随意进食组和间歇性禁食组更换笼具，以确保两组经历相同的操作时间。
  7. 24小时后，测量两组小鼠的体重以及AL组笼具中剩余的食物重量。
    注意： 务必计入食槽及笼底食物碎屑的重量，尤其是在使用高脂饮食（HFD）时，因为小鼠常会将小颗粒或食物碎片从食槽中移出并储存在巢穴附近。每个2:1周期（3天）结束时，每只小鼠的平均能量摄入量约为35 kcal，相当于普通饮食（3.3 kcal/g）约10 g，或高脂饮食（4.73 kcal/g）约7 g。
  8. 进食周期：在中午12:00为自由进食组（AL）和间歇性禁食组（IF）提供称重定量的食物。
  9. 在提供食物48小时后，测量剩余食物的重量和小鼠的体重。
  10. 在研究期间重复执行步骤 1.6–1.10（例如., 16 周。

2. 配对喂养（PF）对照组

注意：在观察到小鼠模型摄食行为改变的间歇性禁食（IF）实验中（例如，ob/ob 小鼠出现摄食过度），必须设置配对喂养组作为对照，以便与IF进行适当的热量无关比较。

  1. 对于配对喂养（PF）对照组，调整实验时间表，使PF组获得的食物量与间歇性禁食（IF）组消耗的食物量相同（图2）。
  2. 测量IF组在2天重新喂养期间所消耗的食物总量。
  3. 将IF组消耗的该食物总量平均分为三份，每天中午12:00提供给PF组。
    注意：每日提供等量食物至关重要。对于暴食的小鼠，如果配对喂养小鼠单次获得的食物量少于其自由摄食量，它们可能会吃完所有提供的食物而实际上处于禁食状态。这可能导致无法与接受IF处理的小鼠进行恰当比较，从而干扰实验结果。
  4. 在研究期间重复步骤2.1–2.3。

3. 身体成分分析

注意：由于长期间歇性禁食（IF）会影响小鼠的体重，可在适当的周期（例如每3或4个周期）使用体成分分析仪测量活体、非麻醉小鼠的脂肪质量和瘦体重，以评估其身体组成。

  1. 打开体成分分析仪。
    注意：在启动程序前，需让仪器开机预热至少 2–3 小时。
  2. 对体成分分析仪运行系统测试，以检测其测量准确性。如有必要，使用菜籽油和水样进行系统校准。
  3. 测量每只小鼠的体重。
  4. 将小鼠放入小型动物圆柱形固定器中。
  5. 插入分隔装置以限制小鼠在测量过程中的身体活动，并将固定器放入体成分分析仪中。
  6. 运行扫描程序。
    注意：分析过程大约需要 90–120 秒。
  7. 测量结束后，从仪器中取出固定器，并将小鼠放回笼中。
    注意：更详细的实验方案可参见之前发表的文章9。

4. 葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验

  1. 进行葡萄糖耐量试验（GTT）时，需在对小鼠实施禁食前测量每只小鼠的体重和体成分，并用永久性记号笔标记其尾部，以便快速、简便地识别编号。
  2. 将小鼠于晚上7:00放入新笼中，禁食过夜。
    注意： 过夜禁食是标准方案，但由于小鼠生理特性（如长时间禁食后葡萄糖利用增加）10,11），较短时间的禁食（约6 h）可参照胰岛素耐量试验（ITT）所述方法进行。
  3. 在禁食14–16小时（次日上午9:00）后，测量每只小鼠的体重和体成分，并根据体重计算葡萄糖给药剂量。
    注意： 为避免对肥胖小鼠的葡萄糖耐受不良程度进行高估，可利用体成分分析获得的瘦体重来计算葡萄糖给药剂量12,13.
  4. 每只小鼠使用洁净的手术剪剪去尾尖（0.5–1.0 mm）。拭去第一滴血液后，采集新鲜血滴，用血糖仪测定空腹基础血糖水平。
    注意： 在进行葡萄糖耐量试验（GTT）或胰岛素耐量试验（ITT）期间，每次测量血糖时无需额外剪切尾部。可用纱布摩擦伤口以更新创面，从而获取一滴血液。
  5. 对小鼠进行腹腔内（i.p.）注射葡萄糖（1 mg/g 体重）。
    注意： 根据实验目的（例如., 检测肠促胰岛素效应）可通过口服灌胃给予葡萄糖。口服葡萄糖耐量试验（OGTT）的方案可参见另一项研究。14.
  6. 在葡萄糖注射后0、5、15、30、60和120分钟时，从尾部采集血液测定血糖水平。
  7. 完成葡萄糖耐量试验后，提供充足的食物。
  8. 进行胰岛素耐受试验（ITT）时，于上午9:00移除食物。
    注意： 由于葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐受试验（ITT）均会对小鼠造成应激，可能导致血糖水平升高并改变生理状态，因此建议在GTT实验后至少给予2–3天的恢复期，再进行ITT实验。
  9. 在禁食6小时后（15:00），按照步骤4.4所述方法从小鼠尾部采集基线血糖样本。
  10. 对小鼠进行腹腔注射胰岛素（0.65 mU/g 体重）。
  11. 在胰岛素注射后0、15、30、60、90和120分钟时，从小鼠尾部采集血液测定血糖水平。
  12. 完成ITT后，提供充足的食物。

5. 间接测热法

注意：可通过在单个间歇性禁食周期内进行间接热量测定，进一步评估间歇性禁食处理小鼠的能量代谢。该方法将测量耗氧量（VO2）、二氧化碳产生量（VCO2）、呼吸交换比（RER）以及产热量（kcal/h）。

  1. 在开始实验前至少 2 小时打开间接测热系统的电源。
    注意：系统预热对于获得准确测量结果至关重要。
  2. 准备垫料清洁的笼具，灌满水瓶，并将预先称重的饲料加入食槽中。
  3. 检查 Drierite 和石灰苏打的状况。如果 Drierite 的颜色指示剂变为粉红色，表明其已吸收大量水分，需更换或补充新的 Drierite。
  4. 使用特定成分的气体（0.5% CO2, 20.5% O2）对系统进行校准。
  5. 测量每只小鼠的体重和体成分，用于对 VO2 和 VCO2 数据进行标准化处理。
  6. 将每只小鼠轻柔地放入单独的笼具中。
  7. 组装代谢笼，将其置于温度可控的环境舱内，并连接气体管路和活动传感器电缆。
  8. 通过软件设置实验方案，输入相应的实验参数后开始运行程序。第一天的测量旨在提供适应期，并获取基础能量代谢数据。
  9. 次日中午 12:00，通过移除食槽及笼底的饲料和碎屑，对小鼠实施 24 小时禁食处理。如有必要，更换清洁的垫料。
  10. 禁食 24 小时后，将预先称重的饲料重新加入食槽，开始再进食阶段。
  11. 继续测量后续 48 小时，并定期检查系统是否正常运行，无硬件或软件中断。
  12. 测量结束后终止程序，将小鼠转移回原有笼具。称量剩余饲料量，以评估摄食量。
  13. 间接测热法的详细实验方案可参见先前的研究9。

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结果

图1展示了禁食24小时后的摄食分析，以及1:1与2:1间歇性禁食模式的比较。24小时禁食导致体重下降约10%，但在恢复进食2天后体重完全恢复（图1A）。24小时禁食在随后2天的恢复进食期间诱发了摄食过多现象（图1B）。然而，对1:1隔日禁食与2:1间歇性禁食的能量摄入进行比较发现，在1:1间歇性禁食中，恢复进食1天的能量摄入仅达到约80%，不足以补偿禁食所损失的热量，与随意进食组（AL）相比存在差异（图1C）。相比之下，在2:1间歇性禁食中，恢复进食2天期间的能量摄入可达到99%，基本完全补偿了禁食期间的热量损失。该方案可用于研究等热量间歇性禁食的影响，且这些影响独立于热量摄入差异。

图2

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讨论

已有充分文献记载，间歇性禁食（IF）对人类和动物的多种疾病具有有益的健康效应8,15,16,17,18,19。其潜在机制（如自噬和肠道微生物组）近年来已逐步阐明。本方案描述了一种在小鼠中实施的等热量2:1间歇性禁食 regimen，用于研究间歇性禁食在对抗饮食诱导肥胖及相关代谢功能障碍中独立于热量摄入的代谢益处。与导致总体热量摄入减少的隔日禁食（1:1 IF）方案6,7不同，2:1 IF方案中增加一天的再喂食，可在野生型小鼠中维持等热量状态。

此外，与1:1间歇性禁食（IF）...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

K.-H.K 获得了加拿大心脏与中风基金会拨款（G-18-0022213）、J. P. Bickell 基金会以及渥太华心脏研究所启动资金的支持；H.-K.S. 获得了加拿大卫生研究院资助（PJT-162083）、Banting & Best 糖尿病研究中心（BBDC）的 Reuben 和 Helene Dennis 学者奖与 Sun Life Financial 糖尿病研究新研究者奖，以及加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助（RGPIN-2016-06610）的支持；R.Y.K. 获得了渥太华大学心脏病学研究捐赠基金博士后奖学金的支持；J.H.L. 获得了加拿大自然科学与工程研究委员会博士奖学金和安大略省研究生奖学金的支持；Y.O. 获得了渥太华大学心脏研究所捐赠研究生奖以及科学与技术领域的伊丽莎白二世女王研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
综合动物实验室监测系统（CLAMS）Columbus Instruments间接热量测定仪
D-(+)-葡萄糖溶液Sigma-AldrichG8769用于葡萄糖耐量试验（GTT）
EchoMRI 3-in-1EchoMRIEchoMRI 3-in-1体成分分析
血糖仪及试纸BayerContour NEXT用于葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）
高脂饮食（45% 千卡来自脂肪）Research Diets Inc.#D124513.3 千卡/克
高脂饮食（60% 千卡来自脂肪）Research Diets Inc.#D124524.73 千卡/克
胰岛素El LillyHumulin R用于胰岛素耐量试验（ITT）
小鼠品系：B6.Cg-Lepob/JThe Jackson Laboratory#000632Ob/Ob 小鼠
小鼠品系：C57BL/6JThe Jackson Laboratory#000664
普通饲料（17% 千卡来自脂肪）Harlan#2918
电子天平Mettler Toledo体重和摄食量测量

参考文献

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