通过化学计量学方法解析皮肤角质层活体共聚焦拉曼光谱中的水、蛋白质和脂质

摘要

本文介绍了一种在临床研究中从人体受试者采集共聚焦拉曼光谱的实验方案，并结合化学计量学方法去除光谱异常值，进而提取关键特征。

摘要

体内共聚焦拉曼光谱法的开发使得能够对人体样本中的水、蛋白质和脂质进行具有深度分辨率的直接测量。这些信息对于皮肤相关疾病的研究以及表征护肤品功效具有重要意义。本方案阐述了共聚焦拉曼光谱的采集方法，以及利用化学计量学对光谱数据集进行后续分析的方法。该方法的目标是建立标准化的数据采集流程，并为数据分析提供通用指导。在处理来自临床研究的大规模数据集时，预处理（例如剔除异常光谱）是一个关键步骤。作为示例，我们基于已有数据集的知识，提供识别异常光谱类型的方法，并制定针对性的剔除策略。随后进行主成分分析，并将载荷光谱与参考物质的光谱进行比对，以确定最终多元曲线分辨（MCR）分析中所使用的组分数目。该方法在从大规模光谱数据集中提取有意义信息方面具有良好的效果。

引言

在临床研究中，活体共聚焦拉曼光谱技术已展现出其在测定角质层厚度和水分含量^1,2,3,4，以及追踪外用活性成分在皮肤中渗透过程方面的独特能力^5,6。作为一种非侵入性方法，共聚焦拉曼光谱基于分子振动模式检测分子信号，因此无需标记⁷。活体共聚焦拉曼光谱利用该技术的共聚焦特性，提供具有深度分辨能力的化学信息。这种依赖深度的信息在研究护肤品的作用^4,8、皮肤老化^9,10、季节变化³以及皮肤屏障功能相关疾病（如特应性皮炎）^11,12等方面具有重要价值。在共聚焦拉曼光谱的高频区域（2,500–4,000 cm^-1....

方案

本研究经北京儿童医院机构审查委员会批准，符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并依照人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）的良好临床实践指南进行。研究于2015年5月至7月期间开展。

1. 收集特应性皮炎患者体内的共聚焦拉曼光谱

1. 纳入符合以下标准的受试者。
   1. 纳入年龄在4–18岁之间的受试者。
   2. 纳入患有轻度至中度特应性皮炎（根据医生整体评估评分为2或3分）且体表5%–30%区域存在活动性病变症状的受试者，且至少在双臂上有两处病灶。
   3. 纳入总体健康状况良好、除特应性皮炎相关症状外无其他明显疾病的受试者。
   4. 纳入已签署书面知情同意书的受试者。
   5. 纳入在检测部位个体肤色角度（ITA）值高于40的受试者。
2. 排除符合以下任一标准的受试者。
   1. 排除在过去4周内曾在任何试验机构参与或曾参与过临床研究的受试者。
   2. 排除患有癌症或在研究开始前5年内被诊断或接受过癌症治疗的受试者。
   3. 排除糖尿病患者。
   4. 排除患有免疫性或传染性疾病，可能使受试者处于风险之中或干扰研究结果准确性的受试者（例如乙型肝炎、结核病、HIV、艾滋病、系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎）。
   5. 排除患有可能干扰仪器测量或妨碍仅针对特应性皮炎进行清晰皮肤....

结果

在本项临床研究中，从28名4至18岁的受试者体内采集了活体共聚焦拉曼光谱。根据上述数据采集方案，共收集了30,862条拉曼光谱。该大型光谱数据集中包含20%的光谱异常值，如图4A所示。在确定皮肤表面后，去除了信噪比较低的异常光谱，随后通过主成分分析（PCA）识别出具有室内光源特征的光谱。该PCA模型中的第三个因子被确认为室内光源峰。这一点通过将因子3的载荷光谱与在研究现场使用相同共聚焦拉曼仪器单独采集的荧光室内光源光谱进行比对得以证实（见补充 图3）。图4B表明，经过此处理后，大部分异常光谱已被去除。

对预处理后的共聚焦拉曼数据集进行主成分分析（PCA），特征值及所用因子数量如图5所示。根据先前的研究^12,

讨论

在数据采集过程中，如方案第2和第3节所述，通过在显微图像中寻找被红色圆圈标出的较暗区域（见图2C），确定仪器窗口与皮肤接触的区域，并在此处采集每个深度剖面。一旦定位到这些区域，必须从皮肤表面以上开始采集深度剖面，以便在数据分析过程中准确确定皮肤表面的位置。随后，该皮肤表面位置将用于确定对应深度剖面中每条光谱的相对深度。如方案第1节所述，在皮肤表面以上10 μm处开始深度剖面，可在皮肤外部获得五个数据点，从而成功确定皮肤表面两侧信号强度最大值和最小值的位置。此外，应避免测量含有笔迹标记或色素较多的区域（例如雀斑），因为这些区域会产生较强的荧光背景信号。曝光时间的选择需在光谱质量和测量时长之间取得平衡：较长的曝光时间可改善信噪比，但会显著增加整体测量时间。然而，许多受试者难以在较长时间内保持静止不动，这对儿童而言尤其困难。提高激光功率可增强信噪比，但过高的功率可能因能量吸收而损伤皮肤。激光功率不得超过中国国家标准（GB 7247.1-2012）规定的最大允许暴露限值（17 mW），以及国际激光安全标准（IEC 60285-1:2007；671 nm.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich
胆固醇	Sigma-Aldrich
胆固醇-3-硫酸钠	Sigma-Aldrich
D-赤式-二氢鞘氨醇	Sigma-Aldrich
去离子水			使用 Milipore 系统纯化（18.2MΩ）
Gen2-SCA 皮肤分析仪	River Diagnostics, 中国台湾, 荷兰	Gen2
Matlab 2018b	Mathwork	2018b
N-山嵛酰基-D-赤式-鞘氨醇	Avanti Polar Lipids, Inc.
N-木质酰基-D-赤式-鞘氨烷（神经酰胺）	Avanti Polar Lipids, Inc.
油酸	Sigma-Aldrich
棕榈酸	Sigma-Aldrich
棕榈油酸	Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox 版本 8.2	Eigenvector Research Inc.	8.2
RiverICon	River Diagnostics, 中国台湾, 荷兰	版本 3.2
角鲨烯	Sigma-Aldrich
硬脂酸	Sigma-Aldrich