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方法文章

通过化学计量学方法解析皮肤角质层活体共聚焦拉曼光谱中的水、蛋白质和脂质

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DOI：

10.3791/60186

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2019年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Procter and Gamble, Beijing Innovative center, 2Procter and Gamble, Mason Business Center, 3Department of Dermatology, Beijing Children's Hospital, 4Chinese Academy of Inspection and Quarantine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在临床研究中从人体受试者采集共聚焦拉曼光谱的实验方案，并结合化学计量学方法去除光谱异常值，进而提取关键特征。

摘要

体内共聚焦拉曼光谱法的开发使得能够对人体样本中的水、蛋白质和脂质进行具有深度分辨率的直接测量。这些信息对于皮肤相关疾病的研究以及表征护肤品功效具有重要意义。本方案阐述了共聚焦拉曼光谱的采集方法，以及利用化学计量学对光谱数据集进行后续分析的方法。该方法的目标是建立标准化的数据采集流程，并为数据分析提供通用指导。在处理来自临床研究的大规模数据集时，预处理（例如剔除异常光谱）是一个关键步骤。作为示例，我们基于已有数据集的知识，提供识别异常光谱类型的方法，并制定针对性的剔除策略。随后进行主成分分析，并将载荷光谱与参考物质的光谱进行比对，以确定最终多元曲线分辨（MCR）分析中所使用的组分数目。该方法在从大规模光谱数据集中提取有意义信息方面具有良好的效果。

引言

在临床研究中，活体共聚焦拉曼光谱技术已展现出其在测定角质层厚度和水分含量1,2,3,4，以及追踪外用活性成分在皮肤中渗透过程方面的独特能力5,6。作为一种非侵入性方法，共聚焦拉曼光谱基于分子振动模式检测分子信号，因此无需标记7。活体共聚焦拉曼光谱利用该技术的共聚焦特性，提供具有深度分辨能力的化学信息。这种依赖深度的信息在研究护肤品的作用4,8、皮肤老化9,10、季节变化3以及皮肤屏障功能相关疾病（如特应性皮炎）11,12等方面具有重要价值。在共聚焦拉曼光谱的高频区域（2,500–4,000 cm-1）包含大量信息，其中水分子在3,250–3,550 cm-1范围内产生明显的特征峰。然而，蛋白质和脂质的拉曼峰主要集中在约2,800–3,000 cm-1范围内，由于这些信号主要来源于亚甲基（-CH2-）和甲基（-CH3）基团13，导致两者信号相互重叠。这种重叠给获取各分子组分相对含量带来了技术挑战。已有研究采用峰拟合14,15和选择性特征峰位置分析12,16等方法来应对这一问题。然而，由于同一组分的多个拉曼峰会同时发生变化，基于单一特征峰的方法难以提取出纯净的组分信息17。在我们近期发表的研究中18，提出了一种MCR方法以解析纯净组分信息。利用该方法，从大规模的活体共聚焦拉曼光谱数据集中成功提取出三种组分（水、蛋白质和脂质）。

开展大规模临床研究时，采集体内光谱数据的人员可能面临较大工作负担。在某些情况下，光谱采集可能需要每天连续操作设备数小时，且研究持续时间可长达数周甚至数月。在此类条件下，光谱数据可能由缺乏足够技术专长的操作人员采集，难以识别、排除和纠正所有来源的光谱伪影。最终的数据集可能包含少量需要在分析前识别并剔除的光谱异常值。本文详细阐述了一种化学计量学分析流程，用于在使用MCR分析数据之前对临床拉曼数据集进行"清理”。为了成功剔除异常值，需首先识别异常值的类型及其产生的潜在原因，进而制定特定策略以去除目标异常值。这要求对数据集具有先验知识，包括对数据生成过程和研究设计的深入理解。在本数据集中，大多数异常值为信噪比较低的光谱，主要来源于两种情况：1）在皮肤表面之上采集的光谱（共30,862条光谱中的6,208条）；2）荧光室内光源对光谱产生显著干扰的光谱（共30,862条光谱中的67条）。在皮肤表面之上采集的光谱会产生微弱的拉曼信号，因为激光焦点接近皮肤表面，且大部分位于皮肤下方的仪器窗口内。受荧光室内光源显著干扰的光谱则通常由仪器操作失误或受试者移动引起，导致共聚焦拉曼采集窗口未能被受试者身体部位完全覆盖。尽管这些类型的光谱伪影可在数据采集过程中由光谱学专家实时识别并纠正，但本研究所使用的经过培训的仪器操作人员被明确指示：除非发生严重故障，否则应采集所有数据。因此，识别和剔除异常值的任务被纳入数据分析流程中。本文提出的分析流程正是为解决这一挑战而设计。针对皮肤表面之上的低信噪比光谱问题，需首先确定皮肤表面的位置，以便剔除在皮肤表面之上采集的光谱。皮肤表面位置被定义为拉曼激光焦点一半在皮肤内、一半在皮肤外的深度，如补充图1所示。在剔除低信噪比光谱后，采用主成分分析（PCA）提取主要由荧光室内光源峰主导的因子，并根据该因子对应的得分值剔除相应的异常光谱。

本方案详细介绍了在MCR过程中如何确定六个主成分。该过程通过主成分分析（PCA），随后对采用不同主成分数目所构建模型的载荷谱图形状进行比较来实现。本文还详细说明了参考物质以及人体受试者数据采集的实验过程。 

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方案

本研究经北京儿童医院机构审查委员会批准，符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并依照人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）的良好临床实践指南进行。研究于2015年5月至7月期间开展。

1. 收集特应性皮炎患者体内的共聚焦拉曼光谱

  1. 纳入符合以下标准的受试者。
    1. 纳入年龄在4–18岁之间的受试者。
    2. 纳入患有轻度至中度特应性皮炎（根据医生整体评估评分为2或3分）且体表5%–30%区域存在活动性病变症状的受试者，且至少在双臂上有两处病灶。
    3. 纳入总体健康状况良好、除特应性皮炎相关症状外无其他明显疾病的受试者。
    4. 纳入已签署书面知情同意书的受试者。
    5. 纳入在检测部位个体肤色角度（ITA）值高于40的受试者。
  2. 排除符合以下任一标准的受试者。
    1. 排除在过去4周内曾在任何试验机构参与或曾参与过临床研究的受试者。
    2. 排除患有癌症或在研究开始前5年内被诊断或接受过癌症治疗的受试者。
    3. 排除糖尿病患者。
    4. 排除患有免疫性或传染性疾病，可能使受试者处于风险之中或干扰研究结果准确性的受试者（例如乙型肝炎、结核病、HIV、艾滋病、系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎）。
    5. 排除患有可能干扰仪器测量或妨碍仅针对特应性皮炎进行清晰皮肤评估的皮肤状况的受试者。示例包括极度干燥的皮肤、受损皮肤、伤口、抓痕、晒伤、胎记、纹身、广泛瘢痕、皮疹、毛发过度生长或痤疮。
    6. 排除在过去一个月内使用过口服免疫抑制剂、抗生素或其他全身性治疗的受试者，但轻微镇静剂除外。
    7. 排除经研究者判断因其他任何医学状况而不适合参与本研究的受试者。
    8. 排除在检测区域皮肤色素沉着较高的受试者。
  3. 标记特应性皮炎研究受试者的病灶区域，并在病灶部位或其附近用3 cm × 4 cm的范围进行标记，如图1A所示。
  4. 在对应的身体部位（例如左前臂与右前臂）使用相同标记方式标记非病灶区域，如图1B所示。
  5. 将标记的身体部位紧贴活体共聚焦拉曼仪器的窗口放置，如图2A和图2B所示。覆盖整个窗口以避免室内光线对检测部位的影响。
  6. 进行拉曼数据采集。
    注：该仪器光谱分辨率为2 cm-1，配备50倍显微物镜（NA = 0.9油浸），使用波长为671 nm、功率为17 mW的激光。波长校准通过内置的氖-氩灯光谱完成，强度校准通过测量美国国家标准与技术研究院（NIST）玻璃校准标准品的光谱完成。
    1. 调节焦距，直至观察到如图2C所示的光谱，然后将焦点从皮肤表面移开10 μm。
    2. 在2,510 cm-1–4,000 cm-1频率范围内，以2 μm步长进行26步的数据采集。每步曝光时间为1 s，每个区域测量8次重复，总时长约10–15分钟。

2. 参考材料的共聚焦拉曼光谱采集

  1. 将人皮肤角质层中的主要组分（参见材料表：牛血清白蛋白（BSA）、去离子水（DI water）、神经酰胺、胆固醇、游离脂肪酸和角鲨烯）作为参考物质，放置于共聚焦拉曼仪器的窗口上19。
  2. 使用与上述相同的采集参数，从参考物质的外侧至中心连续采集其拉曼光谱。
  3. 对每条拉曼光谱在2,510–4,000 cm-1范围内的谱峰面积进行积分，并在26次测量结果中确定信号最强的三个点。取这三个点的拉曼光谱进行平均，得到最终的参考物质光谱。

3. 通过化学计量学分析去除离群光谱

  1. 确定皮肤表面并去除皮肤外的光谱。
    1. 将文件扩展名从“.ric”更改为“.mat”，然后将该 .mat 文件加载到 MATLAB 软件平台中。
    2. 在 PLS_Toolbox 软件中，右键单击 分析 | 其他工具 | 预处理 下的导入数据集，使用基线（自动加权最小二乘法）进行基线校正，参数采用默认设置。
    3. 使用 MATLAB 中的sum函数，对 2,910–2,965 cm-1 范围内的数值进行求和，获得连续 26 步测量中每条拉曼光谱下的强度值，如图 3A 所示。
    4. 使用 MATLAB 中的linspace函数，将仪器偏移值（图 3B 中 X 轴的值）从 26 个点插值至 260 个点。
    5. 利用新生成的 260 个位置值，使用 MATLAB 中的spline方法将强度值从 26 个点插值至 260 个点。
    6. 使用 MATLAB 的polyfit和polyval函数，获得包含 260 个点的新强度值集合。首先，分别将 260 个位置值和强度值作为 X 和 Y 输入传递给polyfit函数，并将多项式阶数设为 20；然后，将输出的系数和 260 个扩展后的位置值作为输入传递给polyval函数，以获得最终的 260 个强度值。
    7. 使用 MATLAB 的max和min函数，从新插值得到的 260 个强度值中识别出最大值和最小值对应的位置。
    8. 将最大强度值与最小强度值之和除以 2，计算平均强度值。
    9. 从 260 个强度值（由步骤 3.1.6 计算得到）中找出最接近平均强度值的点，并将其对应的位置值设定为皮肤表面。将该位置值设为 X 轴的零点，如图 3B 所示。
    10. 根据该零点以及已知的 2 μm 步长，重新调整所有其他位置值。
    11. 根据其位置值，去除所有在皮肤表面以上采集的光谱。
    12. 将剩余数据导入 PLS_Toolbox 以创建数据集，并将其重命名为 "RamanData.mat"。
  2. 去除受环境光影响的异常光谱。
    1. 在去除皮肤外光谱后，加载拉曼光谱数据集（RamanData.mat），并执行主成分分析（PCA）。
    2. 将数据集加载至 MATLAB 平台中的 PLS_Toolbox 软件，右键单击数据集并选择 分析 | PCA。
    3. 选择归一化 作为预处理方法，并选择无进行交叉验证。
    4. 采用三个主成分进行 PCA 分解分析，如补充图 2所示。
    5. 移除活体拉曼仪器采集窗口上的盖子，使用与参考材料数据采集相同的参数，在高频区域采集环境光光谱。
    6. 通过与环境光背景光谱进行比较，识别出环境光影响因子，如补充图 3所示。
    7. 去除对应得分值显著高于正常水平的光谱（即高于整个数据集 99.8% 的得分值，本研究中为 0.16）。

4. MCR 分解分析中组分数目的选择

  1. 使用上述相同方法（第 3.1.2 节）校正拉曼光谱基线。
  2. 对预处理后的数据集进行主成分分析（PCA），方法如上所述（第 3.2 节），但选择“PQN”–“均值中心化”（Mean Center），而非“归一化”（Normalize）。点击选择组分按钮，并将 Y 轴值设为log(特征值)，以对数尺度绘制特征值，并以 20 作为分解分析中的默认组分数。选择三到八个组分用于MCR分析。
  3. 执行MCR分析。
    1. 通过数据选择按钮将数据集载入MCR_main软件20。
    2. 点击组分数目的确定按钮，选择组分数（三到八个）。
    3. 在初始估计选项卡下点击纯组分按钮，在变量选择方向选项卡中选择浓度，然后点击执行按钮。
    4. 点击确定按钮，然后点击继续按钮进入下一页。
    5. 在下一页点击继续，然后分别在实现方式和具有非负性谱图的物种数量选项卡下选择fnnls和6，再点击继续按钮。
    6. 本页参数设置与第 4.3.5 节相同，设置完成后点击继续。

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结果

在本项临床研究中，从28名4至18岁的受试者体内采集了活体共聚焦拉曼光谱。根据上述数据采集方案，共收集了30,862条拉曼光谱。该大型光谱数据集中包含20%的光谱异常值，如图4A所示。在确定皮肤表面后，去除了信噪比较低的异常光谱，随后通过主成分分析（PCA）识别出具有室内光源特征的光谱。该PCA模型中的第三个因子被确认为室内光源峰。这一点通过将因子3的载荷光谱与在研究现场使用相同共聚焦拉曼仪器单独采集的荧光室内光源光谱进行比对得以证实（见补充 图3）。图4B表明，经过此处理后，大部分异常光谱已被去除。

对预处理后的共聚焦拉曼数据集进行主成分分析（PCA），特征值及所用因子数量如图5所示。根据先前的研究12,

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讨论

在数据采集过程中，如方案第2和第3节所述，通过在显微图像中寻找被红色圆圈标出的较暗区域（见图2C），确定仪器窗口与皮肤接触的区域，并在此处采集每个深度剖面。一旦定位到这些区域，必须从皮肤表面以上开始采集深度剖面，以便在数据分析过程中准确确定皮肤表面的位置。随后，该皮肤表面位置将用于确定对应深度剖面中每条光谱的相对深度。如方案第1节所述，在皮肤表面以上10 μm处开始深度剖面，可在皮肤外部获得五个数据点，从而成功确定皮肤表面两侧信号强度最大值和最小值的位置。此外，应避免测量含有笔迹标记或色素较多的区域（例如雀斑），因为这些区域会产生较强的荧光背景信号。曝光时间的选择需在光谱质量和测量时长之间取得平衡：较长的曝光时间可改善信噪比，但会显著增加整体测量时间。然而，许多受试者难以在较长时间内保持静止不动，这对儿童而言尤其困难。提高激光功率可增强信噪比，但过高的功率可能因能量吸收而损伤皮肤。激光功率不得超过中国国家标准（GB 7247.1-2012）规定的最大允许暴露限值（17 mW），以及国际激光安全标准（IEC 60285-1:2007；671 nm...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们非常感谢公司分析与个人清洁护理部门提供的财务支持。我们谨向分析部门的联合总监 Jasmine Wang 女士和 Robb Gardner 博士致以诚挚的谢意，感谢他们的指导与支持；同时感谢 Li Yang 女士在数据收集方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich
胆固醇Sigma-Aldrich
胆固醇-3-硫酸钠Sigma-Aldrich
D-赤式-二氢鞘氨醇Sigma-Aldrich
去离子水使用 Milipore 系统纯化（18.2MΩ）
Gen2-SCA 皮肤分析仪River Diagnostics, 中国台湾, 荷兰Gen2
Matlab 2018bMathwork2018b
N-山嵛酰基-D-赤式-鞘氨醇Avanti Polar Lipids, Inc.
N-木质酰基-D-赤式-鞘氨烷（神经酰胺）Avanti Polar Lipids, Inc.
油酸Sigma-Aldrich
棕榈酸Sigma-Aldrich
棕榈油酸Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox 版本 8.2Eigenvector Research Inc.8.2
RiverIConRiver Diagnostics, 中国台湾, 荷兰版本 3.2
角鲨烯Sigma-Aldrich
硬脂酸Sigma-Aldrich

参考文献

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