利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定靶向成纤维细胞生长因子受体2的小肽

摘要

本文介绍了一种利用噬菌体展示肽库筛选结合FGFR2的小肽的详细实验方案。我们进一步在体外分析了所筛选小肽与FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。

摘要

人类成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族包含四个成员，即 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4，参与多种生物学活动，包括细胞增殖、存活、迁移和分化。在多种癌症中已发现 FGFR 信号通路存在多种异常，这些异常由基因突变或基因扩增事件引起。因此，近期研究集中于开发靶向 FGFR 的治疗策略。目前处于不同临床前和临床开发阶段的 FGFR 抑制剂主要包括酪氨酸激酶小分子抑制剂或单克隆抗体，而基于肽类的抑制剂在研数量较少。本文提供了一种利用噬菌体展示技术筛选 FGFR2 拮抗小肽的实验方案。简言之，将噬菌体展示肽库与包被有 FGFR2 的酶标板共同孵育，随后用 TBST（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20）洗去未结合的噬菌体，并用 0.2 M 盐酸甘氨酸缓冲液（pH 2.2）洗脱结合的噬菌体。洗脱后的噬菌体进一步扩增，并作为下一轮生物淘选的输入材料。经过三轮生物淘选后，通过 DNA 测序鉴定各个噬菌体克隆的肽序列。最后，对筛选出的肽进行合成，并分析其亲和力和生物学活性。

引言

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在体内细胞增殖、伤口愈合和血管生成中发挥关键作用¹。在多种肿瘤中观察到FGFR信号通路的异常激活^2,3,4,5，包括基因扩增、基因突变、染色体异常以及配体过度分泌⁶。许多靶向FGFR的抑制剂在临床试验中显示出良好的治疗效果，主要分为三类：（1）小分子激酶抑制剂，可结合FGFR的胞内结构域；（2）靶向胞外段的拮抗剂；（3）FGF配体捕获剂⁶。尽管部分小分子激酶抑制剂在体外和体内均表现出良好的治疗效果⁷，但大多数药物靶向特异性较差，并可能引起高血压等不良反应⁸。大多数拮抗剂为单克隆抗体^9,10和多肽¹¹。与小分子相比，多肽具有更高的特异性和更低的副作用。与蛋白质类药物相比，多肽还具有细胞通透性良好、不易在特定器官中蓄积的优点

方案

1. 试剂准备

1. LB（溶菌肉汤）培养基：将1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物和0.5 g NaCl溶解于100 mL H₂O中。121°C高压灭菌，4 °C保存。
2. 四环素母液：用体积比1:1的乙醇与H₂O配制20 mg/mL的溶液。-20 °C保存，使用前涡旋混匀。
3. IPTG/X-gal溶液：将0.5 g IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和0.4 g X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）溶于10 mL DMF（二甲基甲酰胺）中。避光保存于-20 °C，可稳定保存一年。
4. LB + 四环素（Tet）平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H₂O中。高压灭菌后冷却至< 70 °C，加入100 μL四环素母液，倒平板。避光，4 °C保存。
5. LB + IPTG/X-gal平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H₂O中。高压灭菌后冷却至< 70°C，加入100 μL IPTG/X-gal溶液，倒平板。避光，4 °C保存。
6. 甘氨酸-HCl缓冲液（0.2 M）：将1.5014 g甘氨酸和100 mg BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL H₂

结果

获得靶向 FGFR2 的高亲和力小肽。

为了筛选靶向FGFR2的噬菌体，本研究使用了Ph.D.-7文库。该实验流程的示意图见图1。在此过程中，噬菌体输入量（PFU）保持不变，而FGFR2蛋白的包被浓度逐步降低。噬菌体滴度结果显示，回收的噬菌体数量逐渐增加，经过3轮筛选后，较第一轮增加了65倍（Table 1）。

接下来，我们在第三轮筛选后随机挑选噬菌体克隆，并提取噬菌体DNA进行测序。通过筛选获得的一个代表性肽段（WRARVPL）被命名为SP1。随后将其合成，并通过质谱法测定其分子量。

SP1 肽对 FGFR2 表现出高结合亲和力。

采用等温滴定量热法（ITC）实验测定小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有较高的亲和力（Kd ≈ 1.4.......

讨论

组合噬菌体文库是一种强大且高效的工具，可用于高通量筛选能够结合靶分子并调控其功能的新型肽段¹³。目前，噬菌体展示肽库具有广泛的应用。例如，可用于筛选与受体蛋白结合的生物活性肽²³、非蛋白靶标^24，25、疾病特异性抗原模拟物¹³、细胞特异性肽段^26，27、或组织/器官特异性肽段^21，28，29，以及用于开发肽介导的药物递送系统^19，30。简而言之，噬菌体展示肽库是在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 滤膜	Merck Millipore	MPGP002A1
35 cm² 小培养皿	Thermo	150460
70% 乙醇	广州化学试剂厂	64-17-5
-96 gIII 测序引物			由生工生物工程（上海）股份有限公司合成
96 孔板	Nest	701001-2
琼脂	碧云天	ST004D
胰蛋白胨	Oxoid	L0037
BALB/c 3T3 细胞	ATCC	CRL-­6587
BSA	百奥龙	BD-M10110
CCK-8 试剂盒	DOJINDO	CK04
DMEM	Hyclone	sh30243.01
DMF	Newprobe	PB10247
EDTA	Invitrogen	15576028
FGF2 蛋白	义翘神州公司	10014-HNAE	纯度 >95%
甘氨酸	Sigma	G8898-1KG
IPTG	碧云天	ST097
ITC200 系统	MicroCal Omega
NaCl	Sigma	S6191
NaHCO3	广州化学试剂厂	144-55-8
NaI	毕得医药	BD40879
NaOH	广州化学试剂厂	1310-73-2
PEG–8000	Sigma	P2139-250
Ph.D.-7 噬菌体展示肽库试剂盒	New England BioLabs	E8100S	包含 Ph.D.-7 噬菌体文库、E. coli ER2738 宿主菌株和 M13KE 对照噬菌体
重组 FGFR2 胞外域蛋白	义翘神州公司	10824-H08H	纯度 > 97%
小肽			由吉尔生化有限公司（中国上海）合成
四环素	Sigma	S-SHS-5
Tris	Sigma	SLF-T1503
Tween-20	碧云天	ST825
X-gal	碧云天	ST912
酵母提取物	Oxoid	LP0021