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利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定靶向成纤维细胞生长因子受体2的小肽

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DOI：

10.3791/60189

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2019年9月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine & Department of Cell Biology, Jinan University, National Engineering Research Center of Genetic Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用噬菌体展示肽库筛选结合FGFR2的小肽的详细实验方案。我们进一步在体外分析了所筛选小肽与FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。

摘要

人类成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族包含四个成员，即 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4，参与多种生物学活动，包括细胞增殖、存活、迁移和分化。在多种癌症中已发现 FGFR 信号通路存在多种异常，这些异常由基因突变或基因扩增事件引起。因此，近期研究集中于开发靶向 FGFR 的治疗策略。目前处于不同临床前和临床开发阶段的 FGFR 抑制剂主要包括酪氨酸激酶小分子抑制剂或单克隆抗体，而基于肽类的抑制剂在研数量较少。本文提供了一种利用噬菌体展示技术筛选 FGFR2 拮抗小肽的实验方案。简言之，将噬菌体展示肽库与包被有 FGFR2 的酶标板共同孵育，随后用 TBST（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20）洗去未结合的噬菌体，并用 0.2 M 盐酸甘氨酸缓冲液（pH 2.2）洗脱结合的噬菌体。洗脱后的噬菌体进一步扩增，并作为下一轮生物淘选的输入材料。经过三轮生物淘选后，通过 DNA 测序鉴定各个噬菌体克隆的肽序列。最后，对筛选出的肽进行合成，并分析其亲和力和生物学活性。

引言

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在体内细胞增殖、伤口愈合和血管生成中发挥关键作用1。在多种肿瘤中观察到FGFR信号通路的异常激活2,3,4,5，包括基因扩增、基因突变、染色体异常以及配体过度分泌6。许多靶向FGFR的抑制剂在临床试验中显示出良好的治疗效果，主要分为三类：（1）小分子激酶抑制剂，可结合FGFR的胞内结构域；（2）靶向胞外段的拮抗剂；（3）FGF配体捕获剂6。尽管部分小分子激酶抑制剂在体外和体内均表现出良好的治疗效果7，但大多数药物靶向特异性较差，并可能引起高血压等不良反应8。大多数拮抗剂为单克隆抗体9,10和多肽11。与小分子相比，多肽具有更高的特异性和更低的副作用。与蛋白质类药物相比，多肽还具有细胞通透性良好、不易在特定器官中蓄积的优点12。因此，靶向性小肽是一类高效且具有前景的治疗剂。

噬菌体展示技术是一种简便而强大的工具，可用于鉴定能够与特定分子结合的小肽13,14,15。我们使用了一种基于简单M13噬菌体的噬菌体展示肽库，其尾部展示出超过109种不同的肽序列，可用于与靶分子结合（见材料表）16。由于噬菌体对特定分子具有高亲和力，未结合的噬菌体可通过洗涤去除，仅保留与目标分子紧密结合并携带所需短肽的噬菌体。特定的分子靶标可以是固定的蛋白质17,18、碳水化合物、培养的细胞，甚至是无机材料19,20。已有研究报道，利用噬菌体展示技术在活体（in vivo）中筛选出器官特异性肽，这是一个令人振奋的案例21。噬菌体展示技术的优点包括高通量、操作简便、成本低以及应用范围广泛22。

本研究中，我们提供了一种利用噬菌体展示文库筛选结合固定化蛋白（FGFR2）的小肽的详细实验方案。同时，通过等温滴定量热法（ITC）测定所获得肽段与FGFR2之间的亲和力，并通过细胞增殖实验评估其生物学活性，以验证该技术的有效性。该方法还可拓展用于筛选结合碳水化合物、培养细胞甚至无机材料的小肽。

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方案

1. 试剂准备

  1. LB（溶菌肉汤）培养基：将1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物和0.5 g NaCl溶解于100 mL H2O中。121°C高压灭菌，4 °C保存。
  2. 四环素母液：用体积比1:1的乙醇与H2O配制20 mg/mL的溶液。-20 °C保存，使用前涡旋混匀。
  3. IPTG/X-gal溶液：将0.5 g IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和0.4 g X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）溶于10 mL DMF（二甲基甲酰胺）中。避光保存于-20 °C，可稳定保存一年。
  4. LB + 四环素（Tet）平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H2O中。高压灭菌后冷却至< 70 °C，加入100 μL四环素母液，倒平板。避光，4 °C保存。
  5. LB + IPTG/X-gal平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H2O中。高压灭菌后冷却至< 70°C，加入100 μL IPTG/X-gal溶液，倒平板。避光，4 °C保存。
  6. 甘氨酸-HCl缓冲液（0.2 M）：将1.5014 g甘氨酸和100 mg BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL H2O中，用HCl调节pH至2.2。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。
  7. Tris-HCl缓冲液（1 M）：将12.11 g Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）溶于100 mL H2O中，用HCl调节pH至9.1。高压灭菌，4 °C保存。
  8. 包被缓冲液（0.1 M）：将1.68 g NaHCO3溶于200 mL H2O中，用NaOH调节pH至8.6。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。
  9. 封闭缓冲液：用含5 mg/mL BSA的0.1 M NaHCO3（pH 8.6）配制。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。
  10. TBS缓冲液：配制含50 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl的溶液。高压灭菌，室温保存。
  11. 0.05%、0.1%或0.5% TBST缓冲液：在TBS中加入0.05%、0.1%或0.5%（v/v）Tween-20。用0.22 μm滤膜过滤，室温保存。
  12. PEG/NaCl溶液：配制含20%（w/v）聚乙二醇-8000和2.5 M NaCl的溶液。高压灭菌，室温保存。
  13. TE溶液：取1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和2 mL 50 mM EDTA（pH 8.0），加H2O定容至100 mL。高压灭菌，室温保存。
  14. 碘化物缓冲液：将30 g NaI溶于50 mL TE缓冲液（pH 8.0）中。避光，室温保存。
  15. 顶层琼脂：将1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和0.7 g琼脂糖溶于100 mL H2O中。高压灭菌后分装为每份15 mL。室温保存备用。

2. 第一轮生物筛选：筛选结合FGFR2胞外域的噬菌体克隆

注意：为尽量减少环境中噬菌体的污染，所有实验步骤均应使用抗气溶胶移液器吸头并佩戴手套。

  1. 在包被缓冲液中配制10 µg/mL的FGFR2（纯度> 97%；参见材料表）溶液。将1 mL上述溶液加入35 cm2培养皿中，反复旋转混匀，直至表面完全润湿。于4 °C振荡孵育过夜。
    注意：为避免筛选出诱饵靶标结合物，靶蛋白必须高度纯化。
  2. 在5 mL LB + Tet培养基中接种大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）ER2738菌株，于37 °C振荡培养5–10小时。扩增后的ER2738细胞将用于步骤3.3中的滴定。
  3. 倒掉培养皿中的包被液（必须去除多余液体），加入封闭液。于4 °C孵育至少1小时。
  4. 弃去封闭液，用TBST（TBS + 0.05% (v/v) Tween-20）快速洗涤6次。避免培养皿干燥。
  5. 将原始噬菌体文库用1 mL TBST重悬（终浓度为1011噬菌斑形成单位（PFU）），加入包被后的培养皿中，在室温下轻轻摇动孵育2小时。
  6. 弃去上清液，用TBST（TBS + 0.05% (v/v) Tween-20）洗涤10次，操作同步骤2.4。
    注意：必须通过充分洗涤彻底去除未结合的噬菌体。
  7. 向培养皿中加入1 mL 0.2 M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.2），室温下轻轻摇动10分钟，以洗脱结合的噬菌体。
  8. 将洗脱液转移至无菌微量离心管中，并加入100 µL 1 M Tris-HCl（pH 9.1）进行中和。
    注意：在步骤2.6中，应通过10次剧烈洗涤尽可能去除未结合的噬菌体，此步骤至关重要。洗脱的噬菌体可在4 °C保存一周，但最好尽快进行下一步操作。

3. 洗脱噬菌体的滴度测定

  1. 使用前，将 LB + IPTG/X-gal 平板在 37 °C 下预热至少 1 小时。
  2. 用 LB 培养基对步骤 2.8 中的洗脱液进行 100 µL 的 10 倍系列稀释（即 101、102、103 和 104）。使用带滤芯的吸头以避免污染。
  3. 使步骤 2.2 中的菌液达到对数中期（OD600 ≈ 0.5）。将 200 µL 菌液分装至灭菌的微量离心管中，每种洗脱液稀释度各一管。
  4. 为启动感染，将步骤 3.2 中每种稀释液各 10 µL 加入含有步骤 3.3 中 E. coli ER2738 菌液的各个微量离心管中。迅速涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
  5. 用涂布棒将步骤 3.4 中的混合物 90 μL 涂布于 LB + IPTG/X-gal 平板上。
  6. 可选：在微波炉中融化顶层琼脂，每种洗脱液稀释度分别取 3 mL 加入无菌培养管中，并将培养管保持在 45 °C。将步骤 3.4 中的混合物转移至含有 45 °C 融化顶层琼脂的培养管中，迅速混匀后立即倾注于预热的 LB/IPTG/X-gal 平板上。轻轻倾斜并旋转平板，使顶层琼脂均匀铺展。
  7. 5 分钟后，将平板倒置，并在 37 °C 下过夜孵育。
  8. 计数含有约 100 个噬菌斑的平板。将每个平板上的噬菌斑数乘以相应的稀释倍数，得到每 10 µL 中的噬菌体滴度（PFU）。
  9. 另取 5 mL LB + Tet 培养基，接种 E. coli ER2738，在 37 °C 振荡培养过夜，用于噬菌体扩增。
    注意：用于测定噬菌体滴度时，应使用处于对数中期（OD600 ≈ 0.5）的 ER2738 菌液。若 X-gal/IPTG 平板上大多数噬菌斑为白色，表明噬菌体库已被野生型噬菌体污染。一旦发生污染，必须从无污染的噬菌体储存液重新开始淘选步骤。

4. 噬菌体扩增

  1. 将步骤 3.8 中的过夜培养物在 250 mL 锥形瓶中的 20 mL LB 培养基中稀释（1:100）。加入未扩增的洗脱液，并在 37 °C 下剧烈振荡培养 4.5 小时。
  2. 将培养物转移至离心管中，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新管中，再次离心，并弃去沉淀。
  3. 将上清液上层的 80% 转移至新管中，并加入 1/6 体积的 20% PEG/2.5 M NaCl。于 4 °C 下静置过夜，使噬菌体沉淀。
    注意：需将培养上清液与 PEG/2.5 M NaCl 充分混匀。
  4. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟，收集沉淀的噬菌体。弃去上清液，再次离心，并用移液器去除残留的上清液。
  5. 将沉淀重悬于 1 mL TBS 中，并将上清液转移至微量离心管中。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟。
  6. 将上清液转移至新的微量离心管中，加入 1/6 体积的 20% PEG/2.5 M NaCl 再次沉淀。冰上孵育 15–60 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，重新离心，并用移液器去除残留的上清液。
  7. 将沉淀重悬于 200 μL TBS 中，并额外离心 1 分钟以去除杂质。将上清液转移至新的微量离心管中，获得扩增后的洗脱液。
  8. 按照第 3 节所述方法测定扩增后噬菌体的滴度。
    注意：扩增后洗脱液的稀释倍数较未扩增洗脱液更高；通常建议进行 108–1011 的系列稀释。

5. 第二轮生物淘选

  1. 重复第2至第4节步骤。
  2. 按照第3节所述方法，将第二轮扩增后的洗脱液滴定到LB + IPTG/X-gal平板上。
    注意：将FGFR2蛋白的包被浓度降低至5 μg/mL。使用步骤4.7中获得的扩增噬菌体作为输入，并保持噬菌体滴度与第一轮相同（1011 PFU）。将噬菌体与包被FGFR2的培养皿孵育时间缩短至1小时，并在洗涤步骤中将Tween浓度提高至0.1%（v/v）。

6. 第三轮生物筛选

  1. 重复步骤 2.1–2.6。
  2. 通过向培养皿中加入 1 mL 的 20 μM bFGF 溶液（FGFR2 的配体），在室温下轻轻摇动孵育 60 分钟，洗脱结合的噬菌体。
  3. 重复步骤 3.1–3.7。
    注意：将 FGFR2 蛋白的包被浓度降低至 2.5 μg/mL。使用第 5 部分中扩增的第二轮噬菌体作为输入，噬菌斑形成单位（PFU）滴度与第一轮保持相同（1011 PFU）。将噬菌体与包被 FGFR2 的培养皿孵育时间缩短至 30 分钟，并在洗涤步骤中将 Tween 浓度提高至 0.5%（v/v）。

7. 获取斑块DNA用于测序

  1. 噬菌斑扩增
    1. 将ER2738的过夜培养物用LB培养基稀释（1:100）。将1 mL稀释后的培养物分装至2 mL离心管中，每种待鉴定的克隆各一管。
    2. 用移液器吸头从第6节的滴定平板上挑取一个分离良好、呈蓝色的噬菌斑，转移至含有稀释培养物的离心管中。共挑取15个噬菌斑。
      注意：平板应为存放于4 °C、< 1–3天内的新鲜平板，且每个平板上的噬菌斑数量应< < 100个。
    3. 将离心管置于37 °C下剧烈振荡培养4.5小时。
    4. 将培养物转移至离心管中，在12,000 x g 条件下离心30秒。将上清液转移至新管中，再次离心。
    5. 用移液器吸取上清液上层80%转移至新的离心管中。标记为扩增后的噬菌体储备液。
      注意：将扩增的噬菌体与等体积的100%无菌甘油混合稀释后，于-80 °C保存以备后续使用。
  2. 噬菌斑DNA提取
    1. 将500 µL扩增后的噬菌体溶液转移至新的微量离心管中，加入1/6体积的20% PEG/2.5 M NaCl溶液。颠倒混匀后，室温静置10–20分钟。
    2. 在4 °C、12,000 x g 条件下离心10分钟，然后倒掉上清液。
      注意：噬菌体沉淀可能不可见。
    3. 再次离心，小心移除残留的上清液。
    4. 通过剧烈轻弹管壁，将沉淀充分重悬于100 µL碘化物缓冲液中。
    5. 加入250 µL 100%乙醇，室温孵育15分钟。
    6. 在4 °C、12,000 x g 条件下离心10分钟，弃去上清液。用0.5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，快速再次离心后弃去上清液，并短暂干燥沉淀。
    7. 将沉淀重悬于30 µL TE缓冲液中，用于测序。
      注意：在进行步骤7.2.6前，应提前将70%乙醇预冷至-20°C。在加入乙醇前，必须确保噬菌体沉淀已在碘化物缓冲液中充分重悬。

8. 肽序列的鉴定

  1. 使用 -96 gIII 测序引物（5´-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3´）进行测序。
  2. 根据DNA测序结果分析噬菌体表面展示的肽序列。
  3. 合成小肽并通过高效液相色谱（HPLC）和质谱分析，以确认其纯度（≥98%）。

9. 通过等温滴定量热法检测获得的小肽与FGFR2胞外蛋白的亲和力

  1. 使用超声波仪器对无菌水进行脱气处理。将小肽和FGFR2胞外蛋白溶解于无菌水中。离心样品以去除残留的沉淀物。
  2. 在25 °C下进行等温滴定量热（ITC）滴定实验。将40 μM的小肽置于样品池中，从注射器中加入1.5 μM的FGFR2蛋白，搅拌速度为750 rpm。每隔5分钟以2 μL等分量加入FGFR2蛋白（共19次注射）。
  3. 使用单一位点结合模型分析ITC数据。
    注意：无菌水必须脱气，所有样品均需离心以去除气泡和残留杂质。实验必须在25 °C的恒定温度下进行。

10. 使用细胞增殖实验验证所获得小肽的生物学活性

  1. 在96孔板中接种BALB/c 3T3细胞（每孔3.0 × 103个细胞，100 μL），加入含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
  2. 弃去上清液，更换为含0.5% FBS的新鲜DMEM，饥饿处理细胞12小时。
  3. 用补充了0.5% FBS的新鲜DMEM对小分子肽进行系列稀释（浓度分别为0、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20和100 μM，每浓度设6个复孔），弃去96孔板中的上清液，每孔加入100 μL小分子肽溶液。于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
  4. 弃去上清液，每孔加入含10%细胞计数试剂盒（CCK）-8溶液的新鲜DMEM 100 μL，孵育2小时。
  5. 使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度，分析细胞活力。

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结果

获得靶向FGFR2的高亲和力小肽。

为了筛选靶向 FGFR2 的噬菌体，本研究使用了 Ph.D.-7 文库。该实验流程的示意图见图 1。在此过程中，噬菌体输入量（PFU）保持不变，而 FGFR2 蛋白的包被浓度逐步降低。噬菌体滴度结果显示，回收的噬菌体数量逐渐增加，经过 3 轮筛选后，其数量较第一轮增加了 65 倍（Table 1）。

接下来，我们在第三轮筛选后随机挑选噬菌体克隆，并提取噬菌体DNA进行测序。通过筛选获得的一个代表性肽段（WRARVPL）被命名为SP1。随后将其合成，并通过质谱法测定其分子量。

SP1 肽对 FGFR2 表现出高结合亲和力。

采用ITC实验测定小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有较高的亲和力（Kd ≈ ...

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讨论

组合噬菌体文库是一种强大且高效的工具，可用于高通量筛选能够结合靶分子并调控其功能的新型肽段13。目前，噬菌体展示肽库具有广泛的应用。例如，可用于筛选与受体蛋白结合的生物活性肽23、非蛋白靶标24，25、疾病特异性抗原模拟物13、细胞特异性肽段26，27、或组织/器官特异性肽段21，28，29，以及用于开发肽介导的药物递送系统19，30。简而言之，噬菌体展示肽库是在...

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披露

作者声明不存在经济利益冲突。

致谢

本工作由广州市科技计划项目（编号：2016201604030039）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜Merck MilliporeMPGP002A1
35 cm² 小培养皿Thermo150460
70% 乙醇广州化学试剂厂64-17-5
-96 gIII 测序引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成
96 孔板Nest701001-2
琼脂碧云天ST004D
胰蛋白胨OxoidL0037
BALB/c 3T3 细胞ATCCCRL-­6587
BSA百奥龙BD-M10110
CCK-8 试剂盒DOJINDOCK04
DMEMHyclonesh30243.01
DMFNewprobePB10247
EDTAInvitrogen15576028
FGF2 蛋白义翘神州公司10014-HNAE纯度 >95%
甘氨酸SigmaG8898-1KG
IPTG碧云天ST097
ITC200 系统MicroCal Omega
NaClSigmaS6191
NaHCO3广州化学试剂厂144-55-8
NaI毕得医药BD40879
NaOH广州化学试剂厂1310-73-2
PEG–8000SigmaP2139-250
Ph.D.-7 噬菌体展示肽库试剂盒New England BioLabsE8100S包含 Ph.D.-7 噬菌体文库、E. coli ER2738 宿主菌株和 M13KE 对照噬菌体
重组 FGFR2 胞外域蛋白义翘神州公司10824-H08H纯度 > 97%
小肽由吉尔生化有限公司（中国上海）合成
四环素SigmaS-SHS-5
TrisSigmaSLF-T1503
Tween-20碧云天ST825
X-gal碧云天ST912
酵母提取物OxoidLP0021

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