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方法文章

通过电形成法制备巨型单层杂化囊泡及利用微管吸吮法测量其力学性质

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DOI：

10.3791/60199

⸱

2020年1月19日

 ,  , 
1Université de Bordeaux, CNRS, Bordeaux INP, LCPO, UMR 5629

本文内容

摘要

本实验方案的目的是通过微管吸吮法可靠地测量巨囊泡的膜力学性质。

摘要

由磷脂和嵌段共聚物制备的巨型囊泡可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜结构，以及仿生微/纳米反应器的开发。在所有这些应用中，对其膜特性的表征具有根本性的重要意义。在现有的表征技术中，由 E. Evans 首创的微管吸吮法（micropipette aspiration）能够测量膜的力学性质，例如面积压缩模量、弯曲模量以及破裂应力和应变。本文介绍了从脂质或嵌段共聚物（或两者）的薄膜制备巨型囊泡的全部方法与详细步骤、微管的制备与表面处理，以及实现上述各项参数测量的吸吮操作流程。

引言

自20世纪70年代以来，由磷脂（脂质体）制备的巨型囊泡被广泛用作基本的细胞膜模型1。20世纪90年代末，嵌段共聚物通过自组装形成的囊泡结构（称为聚合物囊泡，以类比其脂质类似物）2,3迅速成为脂质体的一种有吸引力的替代方案，因为脂质体机械稳定性较差且化学功能可调性有限。然而，与由细胞膜主要成分——磷脂构成的脂质体相比，聚合物囊泡的细胞仿生特性相对有限。此外，在某些应用（如药物递送）中，其较低的膜通透性可能成为问题，因为这些应用需要物质通过膜的可控扩散。近年来，将磷脂与嵌段共聚物结合以构建杂化聚合物-脂质囊泡和膜的研究日益增多4,5。其主要思路是设计出能够协同结合各组分优势的结构（即脂质双分子层的生物功能性和通透性，以及聚合物膜的机械稳定性和化学多样性），这些结构可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜、以及仿生微/纳米反应器的开发。

如今，不同的科学领域（生物化学家、化学家、生物物理学家、物理化学家、生物学家）对开发更先进的细胞膜模型日益关注。本文旨在尽可能详细地介绍现有方法（电形成法、微管吸吮法），以获取和表征巨囊泡的力学性质，以及近期的相关进展 "高级" 杂合聚合物-脂质巨型囊泡的细胞膜模型4,5.

这些方法的目的是可靠地测量膜的面积压缩模量和弯曲模量，以及其破裂应力和应变。目前测量巨囊泡弯曲刚度的最常用技术之一是基于直接视频显微观察的涨落分析法6,7；但该方法需要膜具有明显的可见涨落，而在较厚的膜（如聚合物囊泡）上通常难以系统获得。面积压缩模量可通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir Blodgett）技术在实验中测定，但通常限于单分子层8。微管吸吮技术则可在一次实验中对形成巨单层囊泡（GUV）的双分子层同时测量这两个模量。

以下方法适用于所有能够通过电形成法形成双层膜并进而形成囊泡的两亲性分子或大分子。这要求双层膜在电形成温度下具有流动性。

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方案

1. 制备微移液管

注意：此处需要内径范围为 6 到 12 µm、锥形长度约为 3–4 mm 的微移液管。以下将详细介绍微移液管的制备方法。

  1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管放入拉制仪的拉杆中，并通过拧紧旋钮固定一端。
  2. 小心地将玻璃管穿过加热室侧面的孔洞。
  3. 拧紧另一端的夹紧旋钮。
  4. 控制尖端尺寸和锥形长度以达到所需规格。为此，需优化加热温度、拉力、速度、延迟和压力等技术参数。以下是一个所用程序的示例：
    加热：550 °C
    拉力：10（仪器范围：0–255，任意单位）
    速度：30（范围：0–255，任意单位）
    延迟：1（范围：0–255，任意单位）
    压力：500（范围：0–999，任意单位）
  5. 点击 PULL 以执行程序定义的操作。毛细管随后被分离成两根微电极，其尺寸需使用显微操作仪进行调整。
  6. 将微电极插入显微操作仪的金属电极夹持器中（见图1）。使用10倍物镜，调节显微镜载物台和电极操作器（垂直和水平移动），使电极尖端接近玻璃珠表面。
  7. 踩下脚踏开关以熔化玻璃珠。降低尖端并使其接触熔融的玻璃珠，熔融玻璃将通过毛细作用流入电极内。等待数秒，直至熔融玻璃上升至如图1插图所示的适当高度。
  8. 松开脚踏开关停止加热，并迅速使用垂直电极操作器将尖端拉开，使其形成锐利的断裂。
  9. 重复步骤1.7和1.8，直至获得所需直径（6至12 µm）。
    注意：为提高直径测量的准确性，在最后一步应使用配备目镜测微尺的32倍物镜。

2. 用BSA（牛血清白蛋白）包被移液器吸头

  1. 配制含有1%（质量分数）BSA的0.1 M葡萄糖水溶液。
    1. 称取180 mg葡萄糖粉末，置于15 mL聚丙烯圆锥形离心管中，加入纯水定容至10 mL。
    2. 加入0.1 g BSA粉末，使用试管旋转混合器轻轻振荡，直至完全溶解（约4小时）。
  2. 用一支10 mL一次性鲁尔接头注射器（带针头）吸取上述溶液。充满后取下针头，安装0.22 μm醋酸纤维素滤器，将溶液过滤至多个聚丙烯微量离心管（1.5 mL）中，用于浸没移液吸头。
  3. 将毛细管垂直放入支架中。将支架下降，使管尖浸入葡萄糖/BSA溶液中过夜。溶液应通过毛细作用上升约1 cm高度。
  4. 将移液吸头从葡萄糖/BSA溶液中取出。配制5 mL 0.1 M葡萄糖溶液（将90 mg葡萄糖粉末溶于5 mL纯水中），并通过0.22 μm醋酸纤维素滤器过滤。
  5. 使用配备柔性熔融石英毛细管的500 µL玻璃注射器将葡萄糖溶液吸入移液吸头内，然后通过回吸将全部葡萄糖溶液吸出并弃去（图2）。重复此步骤数次，以去除未结合的BSA。

3. 通过电形成法制备GUV和GHUV

注意：电形成法是一种由 Angelova 开发的常用技术9。以下将介绍制备电形成腔室、沉积脂质或聚合物薄膜（或同时沉积以制备GHUVs，即巨型杂化单层囊泡）的方法，以及在交变电场下对薄膜进行水合的步骤。此外，还描述了收集所获得的巨型单层囊泡（GUV）的操作流程。

  1. 两亲分子、蔗糖和葡萄糖溶液的配制
    1. 配制浓度为1 mg/mL的两亲性分子溶液。称取10 mg两亲性分子，溶于10 mL氯仿中。将溶液置于密封小瓶中，以避免溶剂挥发。
    2. 制备1,2-二油酰基-sn氯仿中浓度为1 mg/mL的-glycero-3-磷酸乙醇胺-N-（丽丝胺罗丹明B磺酰基）（DOPE-Rhod）
    3. 添加 10 µL 将荧光脂质溶液加入两亲性分子溶液中。将溶液置于密封小瓶中，以避免溶剂挥发。
    4. 配制浓度为 0.1 M 的蔗糖和葡萄糖溶液。分别称取 342 mg 蔗糖和 180 mg 葡萄糖，溶于 10 mL 纯水中。
  2. 电极形成室的制备
    注意：可使用不同的导电材料制作电穿孔装置（例如铂丝10，不锈钢针11）。电形成室由两片ITO载玻片组成，中间用一个O形橡胶垫片隔开，垫片一侧被切割形成开口。通过两根导线将载玻片连接至电压发生器（图3 和 图4A).
    1. 用有机溶剂（如氯仿）清洗ITO载玻片，使用欧姆表识别导电表面。
    2. 使用胶带将电线连接到导电面。
    3. 两亲分子溶液沉积
      1. 将毛细管浸入溶液中，直至液面通过毛细作用上升，并收集约 5 μL 溶液的
      2. 将毛细管与ITO玻璃片中心接触，轻轻铺展溶液。等待10秒，以确保溶剂完全挥发（图4A).
      3. 每侧重复此步骤 3 次。
    4. 在打开的无O形圈垫片两侧涂上一层无硅润滑脂。将其放置在沉积区域周围。将第二块ITO玻璃片的导电面朝下放在垫片上方。
    5. 将电形成室置于真空环境中3小时，以去除任何有机溶剂残留。
  3. 电穿孔形成程序
    1. 将电线连接到发电机上。
    2. 使用以下设置用于发生器：
      交替正弦张力
      频率：10 Hz
      振幅：2 V峰峰值
      注意：每种系统必须确定最佳的电压频率和持续时间。
    3. 确保在向腔室注入溶液之前先施加电压。
    4. 使用内径为0.8 mm针头的注射器注入1 mL溶液以填充腔室，去除可能存在的气泡。
    5. 在施加电压/频率的条件下孵育75分钟（图4B).
  4. GUVs 收获
    1. 关闭发生器。
    2. 使用内径为0.8 mm的1 mL注射器，吸取少量溶液以在腔室内产生一个气泡。轻微倾斜腔室，使气泡在腔室内移动。这有助于GUVs从ITO表面脱离图4C).
    3. 吸出所有溶液并转移至1 mL塑料管中。
    4. 移除导线，并用有机溶剂（甲苯，然后氯仿）清洗ITO载玻片。

4. 显微操作装置的设置

注意：微管吸吮法的原理是通过施加负压，将单个囊泡吸入玻璃微管中。通过测量囊泡在微管内形成的舌状突起长度随负压的变化来获取数据。如前所述，微管表面用牛血清白蛋白（BSA）进行包被，这对于防止或尽量减少囊泡膜与微管之间的黏附至关重要。

以下展示了该实验方案。

  1. 移液管与注水储液槽连接
    注意：装满水的水箱和千分尺固定在一块滑动板上。带有千分尺读头的数字计数器可使装置实现0至2.5 cm范围内的垂直位移，精度为 1 µm. 可沿长度最长为1米的铝制光学导轨进行位移。硅胶管将储液槽与毛细管支架相连（图5A).
    1. 用纯水注满水箱。将一次性5 mL注射器连接到毛细金属支架上 通过 硅胶管并抽吸以产生从水箱到固定装置的水流。
    2. 轻轻触碰管壁以消除气泡。同时抬高水箱以产生正压。5 mL 注射器仍固定在支架上。
    3. 在完成前述的包被和清洗步骤后（见步骤2），用葡萄糖溶液填充毛细管，直至其末端形成一滴液滴。将注射器管路从金属支架上取下，使其末端产生轻微的水流。
    4. 将毛细管倒置，使葡萄糖液滴与来自支架的水流相连接。通过拧紧将毛细管和支架固定在一起。
  2. 放置移液器
    注意：在此操作过程中，水箱仍需置于铝制导轨上，以维持正压。
    1. 取自制的铝制载物台，其两侧各粘附一块经乙醇清洁的玻璃盖玻片，并用真空润滑脂固定。将该装置安装在显微镜载物台上，使用含有 0.1 M 葡萄糖的 1 mL 注射器在两块盖玻片之间形成弯月面，如图所示 图5B，C.
    2. 将移液管及其支架放置在显微操作仪的电机单元上，并拧紧夹紧旋钮。
    3. 使用控制面板操纵杆在粗调模式下将微移液管降至葡萄糖弯月面附近。切换至微调模式，调节尖端位置至弯月面中心。
    4. 将尖端浸入葡萄糖溶液中数分钟，以清洗其外表面和内表面（由于保持正压，水流将冲洗移液管内表面，去除未结合的BSA）。
    5. 在显微操作器键盘上保存尖端位置，并将其从弯月面撤出。
    6. 移除葡萄糖弯月面，并更换为新的。吸取 2 μL 在0.1 M蔗糖溶液中制备GUVs的方法 20 μL 微量移液器，并将其置于新鲜的葡萄糖弯月面中。在微分干涉差（DIC）模式下观察由于蔗糖（主要位于GUVs内部）与葡萄糖（主要位于GUVs外部）之间密度差异而沉降在底部的GUVs。
    7. 当囊泡略微收缩时，重新插入吸液移液管并聚焦于其尖端。设定高度 H0 利用溶液中自然存在的微小囊泡或颗粒，调整水箱高度，直至这些颗粒的运动几乎停止，此时水箱的压力接近于0。
    8. 此时，用矿物油包围弯月面以防止水分蒸发，参见 图5D.
      注意：室温应控制在20-22 °C 通过使用空调。
  3. 微吸管抽吸实验
    1. 降低移液器吸头（6-12 µm 直径）并产生微弱负压（-1 cm）以吸取囊泡（15-30 µm 直径）。所选囊泡的膜应出现轻微波动，且不得有任何可见缺陷（无出芽或丝状结构）（图6).
    2. 使用显微操作器将移液管提升至更高位置，以使吸持的囊泡与其他囊泡分离，并在整个实验过程中保持该位置。
    3. 通过将装水的水箱降至约 -10 cm 对囊泡进行预加压，然后降低压力使其恢复至初始值（-1 cm）。重复此步骤数次，以去除膜上的多余部分及微小缺陷。
    4. 从由水箱位置定义的-0.5 cm高度处，通过千分尺缓慢降低吸力压力，使膜进入波动状态。随后增加压力，以清晰观察到尖端处出现具有显著伸展长度（数微米）的舌状结构。
      注意：所施加的最低压力（P0）以吸走最短的膜突起长度（L0) 将定义参考点 α0 (图7A）。曲线上所有数据点的测量均以此为参考（ΔL = L-L0 和 ΔP = P-P0).
    5. 逐步调节微米计以增加吸力压力，直至达到 0.5–0.8 mN/m。每一步骤保持 5 秒，并拍摄舌部图像。该低张力条件下的操作程序可用于测定弯曲模量。
    6. 通过调节轨道上装水滑块的高度（范围从 -2 到 -50 cm），逐步将吸力从 0.5 mN/m 增加至破裂张力图7B-D在高张力状态下的本实验中，将测量面积压缩模量、溶血张力和溶血应变。
    7. 拉伸约15–20个囊泡以获得具有统计学意义的数据。每次微管吸吮实验耗时7至10分钟。使用LASAF软件进行图像分析，测量舌状突起长度、囊泡直径及毛细管半径。
  4. 测量弯曲模量、面积压缩模量、溶血张力和溶血应变
    1. 要获取这些参数，请使用 E. Evans 建立的理论方法。12. 根据公式1计算施加在膜上的吸力压力：
      Δ P = ρwg (h−h₀) (1)
      其中 g 为重力加速度（9.8 m·s⁻²）−2），ρw 是水的密度（ρ = 1 g∙cm−3），h 为水箱的位置，h0 是压力等于零的初始位置。
    2. 根据拉普拉斯方程计算膜张力：
      流体稳定性方程，σ = ΔP/2 [RP/(1-(RP/Rv))]；用于平衡分析的公式。 (2)
      其中，ΔP 为微管吸液压力，Rp 和 Rv 分别为移液管和囊泡的半径（移液管外部）。膜的表面积应变（α）定义为：
      吸收系数公式，α=(A-A0)/A0，用于科学分析情境。 (3)
      静力平衡示意图，包含 ΣFx=0、MA=0 方程，用于演示力的平衡原理。 为囊泡在较低负压下的膜面积。
    3. 根据公式4，由囊泡在毛细管尖端内投影长度的增加量ΔL计算α12:
      静力平衡公式，α=1/2(Rp/Rv)^2(1-Rp/Rv)ΔL/Rp，用于表示物理概念的符号方程。 (4)
    4. 在极低张力条件下，热弯曲涨落的平滑化主导了表观膨胀。绘制 ln(σ) 与 α. 在低σ值情况下（通常为0.001–0.5 mN.m）−1 13），这会得到一条直线，其斜率与弯曲模量K相关b （方程5的第一项）14:
      静力平衡方程；α = kT/8πKb ln(1 + A0σ/24πKb) + σ/Kσ；物理公式 (5)
      注意：在高张力条件下（> 0.5 mN·m−1），膜的起伏完全被抑制，膜面积因分子间距增大而增加。在此状态下，公式5的第二项占主导地位，可用于获得面积压缩模量Ka (图8 和 图9).

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结果

通过上述方案，我们研究了不同类型的合成巨型单层囊泡（GUV），这些囊泡来源于磷脂：2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、三嵌段共聚物：聚环氧乙烷-b-聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PEO12-b-PDMS43-b-PEO12）（该共聚物在先前的研究中合成13）以及二嵌段共聚物聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PDMS27-b-PEO17）。我们课题组此前已证实，三嵌段共聚物PEO8-b-PDMS22-b-PEO8与磷脂POPC结合所形成的巨型杂化单层囊泡（GHUVs）的膜韧性显著降低15。本研究重复了该测量，并进一步扩展...

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讨论

微移液管的包被是获得可靠测量结果的关键之一。必须防止囊泡黏附于微移液管，文献中通常采用BSA、β-酪蛋白或Surfasil进行包被17,18,19,20,21，但很少提及包被步骤的具体细节。

为实现良好的溶解，BSA 应在搅拌条件下至少溶解 4 小时。然而，仍需进行过滤步骤，以去除可能堵塞微量移液器吸头的任何聚集体。如果 BSA 未充分溶解，大部分将被过滤去除，导致包被效果不佳。理想的浓度和溶解时间分别为 0.8–1 wt. % 和 4 小时。

另一个关键点是在测量过程中确保囊泡内外渗透压恒定。实验过程中由于水分蒸发导致葡萄糖浓度升高，可能引起囊泡收缩，从而干扰测量结果（例如，导致Ka

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢法国国家研究局（ANR）的财政支持（ANR Sysa）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
微移液管设计所需的设备与材料
硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instruments1B100-4外径和内径分别为1 mm和0.58 mm。
纤维已安装Sutter Instrument Co.FB255B2.5 mm × 2.5 mm 盒式灯丝
火焰/布朗微管拉制仪Sutter Instrument Co.Model P-97
显微操作仪NARISHGE 公司MF-900配备两个物镜（10x 和 32x）
用于BSA包被移液管尖端的材料
牛血清白蛋白第五组分（BSA）Sigma-Aldrich10735078001
一次性1 ml鲁尔接头注射器Codan62.1612
一次性10 ml鲁尔接头注射器科丹626616
一次性5 ml鲁尔接头注射器科丹62.5607
一次性醋酸纤维素滤膜Cluzeau Info LaboL5003SPA孔径：0.22µm，直径：25 mm
柔性熔融石英毛细管管材Polymicro TechnologiesTSP530660内径 536µm，外径 660µ米，
葡萄糖Sigma-AldrichG5767
注射器 500 µL luer Lock GASTIGHTHamilton 注射器公司1750
试管旋转混匀仪Labinco28210109
显微操作装置搭建
铝制光学导轨，1000 mm 长度，M4 螺纹，X48 系列纽波特
减震光学平台纽波特用作显微镜的支撑，以防止外部振动。
显微操作仪EppendorfPatchman NP 2模块单元（X、Y 和 Z 方向移动的电机单元）通过适配器安装在倒置显微镜上。
微米Mitutoyo Corporation350-354-10数显液晶千分表头 25.4 mm 量程 0.001 mm
有机玻璃水储液罐（100 ml）自制
TCS SP5 倒置共聚焦显微镜（DMI6000），配备共振扫描仪和水浸物镜（HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I）。Leica
X48 轨道载具，80 mm 长度，带 1/4-20、8-32 和 4-40 螺纹纽波特
蔗糖与两亲性分子溶液制备所需材料
2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱Sigma-Aldrich
氯仿VWR22711.244
L-α-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)Sigma-Aldrich810146C罗丹明标记脂质
蔗糖Sigma-AldrichS7903
电极形成装置
10 µL型玻璃毛细管封口环Hirschmann9600110
一次性1 ml鲁尔接头注射器科丹62.1612
H 润滑脂Apiezon阿皮松 H 润滑脂无硅润滑脂
镀有氧化铟锡的玻璃载片Sigma-Aldrich703184
针TerumoAN2138R10.8 × 38 mm
欧姆表（万用表）VoltcraftVC140
甲苯VWR28676.297
电压发生器Keysight33210A

参考文献

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