通过电形成法制备巨型单层杂化囊泡及利用微管吸吮法测量其力学性质

摘要

本实验方案的目的是通过微管吸吮法可靠地测量巨囊泡的膜力学性质。

摘要

由磷脂和嵌段共聚物制备的巨型囊泡可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜结构，以及仿生微/纳米反应器的开发。在所有这些应用中，对其膜特性的表征具有根本性的重要意义。在现有的表征技术中，由 E. Evans 首创的微管吸吮法（micropipette aspiration）能够测量膜的力学性质，例如面积压缩模量、弯曲模量以及破裂应力和应变。本文介绍了从脂质或嵌段共聚物（或两者）的薄膜制备巨型囊泡的全部方法与详细步骤、微管的制备与表面处理，以及实现上述各项参数测量的吸吮操作流程。

引言

自20世纪70年代以来，由磷脂（脂质体）制备的巨型囊泡被广泛用作基本的细胞膜模型¹。20世纪90年代末，嵌段共聚物通过自组装形成的囊泡结构（称为聚合物囊泡，以类比其脂质类似物）^2,3迅速成为脂质体的一种有吸引力的替代方案，因为脂质体机械稳定性较差且化学功能可调性有限。然而，与由细胞膜主要成分——磷脂构成的脂质体相比，聚合物囊泡的细胞仿生特性相对有限。此外，在某些应用（如药物递送）中，其较低的膜通透性可能成为问题，因为这些应用需要物质通过膜的可控扩散。近年来，将磷脂与嵌段共聚物结合以构建杂化聚合物-脂质囊泡和膜的研究日益增多^4,5。其主要思路是设计出能够协同结合各组分优势的结构（即脂质双分子层的生物功能性和通透性，以及聚合物膜的机械稳定性和化学多样性），这些结构可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜、以及仿生微/纳米反应器的开发。

如今，不同的科学领域（生物化学家、化学家、生物物理学家、物理化学家、生物学家）对开发更先进的细胞膜模型日益关注。本文旨在尽可能详细地介绍现有方法（电形成法、微管吸吮法），以获取和表征巨囊泡的力学性质，以及近期的相关....

方案

1. 制备微移液管

注意：此处需要内径范围为 6 到 12 µm、锥形长度约为 3–4 mm 的微移液管。以下将详细介绍微移液管的制备方法。

1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管放入拉制仪的拉杆中，并通过拧紧旋钮固定一端。
2. 小心地将玻璃管穿过加热室侧面的孔洞。
3. 拧紧另一端的夹紧旋钮。
4. 控制尖端尺寸和锥形长度以达到所需规格。为此，需优化加热温度、拉力、速度、延迟和压力等技术参数。以下是一个所用程序的示例：
   加热：550 °C
   拉力：10（仪器范围：0–255，任意单位）
   速度：30（范围：0–255，任意单位）
   延迟：1（范围：0–255，任意单位）
   压力：500（范围：0–999，任意单位）
5. 点击 PULL 以执行程序定义的操作。毛细管随后被分离成两根微电极，其尺寸需使用显微操作仪进行调整。
6. 将微电极插入显微操作仪的金属电极夹持器中（见图1）。使用10倍物镜，调节显微镜载物台和电极操作器（垂直和水平移动），使电极尖端接近玻璃珠表面。
7. 踩下脚踏开关以熔化玻璃珠。降低尖端并使其接触熔融的玻璃珠，熔融玻璃将通过毛细作用流入电极内。等待数秒，直至熔融玻璃上升至如图1插图所示的适当高度....

结果

通过上述方案，我们研究了不同类型的合成巨型单层囊泡（GUV），这些囊泡来源于磷脂：2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、三嵌段共聚物：聚环氧乙烷-b-聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PEO₁₂-b-PDMS₄₃-b-PEO₁₂）（该共聚物在先前的研究中合成¹³）以及二嵌段共聚物聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PDMS₂₇-b-PEO₁₇）。我们课题组此前已证实，三嵌段共聚物PEO₈-b-PDMS₂₂-b-PEO₈与磷脂POPC结合所形成的巨型杂化单层囊泡（GHUVs）的膜韧性显著降低¹⁵。本研究重复了该测量，并进一步扩展.......

讨论

微移液管的包被是获得可靠测量结果的关键之一。必须防止囊泡黏附于微移液管，文献中通常采用BSA、β-酪蛋白或Surfasil进行包被^{17,18,19,20,21}，但很少提及包被步骤的具体细节。

为实现良好的溶解，BSA 应在搅拌条件下至少溶解 4 小时。然而，仍需进行过滤步骤，以去除可能堵塞微量移液器吸头的任何聚集体。如果 BSA 未充分溶解，大部分将被过滤去除，导致包被效果不佳。理想的浓度和溶解时间分别为 0.8–1 wt. % 和 4 小时。

另一个关键点是在测量过程中确保囊泡内外渗透压恒定。实验过程中由于水分蒸发导致葡萄糖浓度升高，可能引起囊泡收缩，从而干扰测量结果（例如，导致K_a

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微移液管设计所需的设备与材料
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100-4	外径和内径分别为1 mm和0.58 mm。
纤维已安装	Sutter Instrument Co.	FB255B	2.5 mm × 2.5 mm 盒式灯丝
火焰/布朗微管拉制仪	Sutter Instrument Co.	Model P-97
显微操作仪	NARISHGE 公司	MF-900	配备两个物镜（10x 和 32x）
用于BSA包被移液管尖端的材料
牛血清白蛋白第五组分（BSA）	Sigma-Aldrich	10735078001
一次性1 ml鲁尔接头注射器	Codan	62.1612
一次性10 ml鲁尔接头注射器	科丹	626616
一次性5 ml鲁尔接头注射器	科丹	62.5607
一次性醋酸纤维素滤膜	Cluzeau Info Labo	L5003SPA	孔径：0.22µm，直径：25 mm
柔性熔融石英毛细管管材	Polymicro Technologies	TSP530660	内径 536µm，外径 660µ米，
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
注射器 500 µL luer Lock GASTIGHT	Hamilton 注射器公司	1750
试管旋转混匀仪	Labinco	28210109
显微操作装置搭建
铝制光学导轨，1000 mm 长度，M4 螺纹，X48 系列	纽波特
减震光学平台	纽波特		用作显微镜的支撑，以防止外部振动。
显微操作仪	Eppendorf	Patchman NP 2	模块单元（X、Y 和 Z 方向移动的电机单元）通过适配器安装在倒置显微镜上。
微米	Mitutoyo Corporation	350-354-10	数显液晶千分表头 25.4 mm 量程 0.001 mm
有机玻璃水储液罐（100 ml）	自制
TCS SP5 倒置共聚焦显微镜（DMI6000），配备共振扫描仪和水浸物镜（HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I）。	Leica
X48 轨道载具，80 mm 长度，带 1/4-20、8-32 和 4-40 螺纹	纽波特
蔗糖与两亲性分子溶液制备所需材料
2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱	Sigma-Aldrich
氯仿	VWR	22711.244
L-α-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)	Sigma-Aldrich	810146C	罗丹明标记脂质
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
电极形成装置
10 µL型玻璃毛细管封口环	Hirschmann	9600110
一次性1 ml鲁尔接头注射器	科丹	62.1612
H 润滑脂	Apiezon	阿皮松 H 润滑脂	无硅润滑脂
镀有氧化铟锡的玻璃载片	Sigma-Aldrich	703184
针	Terumo	AN2138R1	0.8 × 38 mm
欧姆表（万用表）	Voltcraft	VC140
甲苯	VWR	28676.297
电压发生器	Keysight	33210A