本报告介绍了一种基于微流控芯片的方法，用于建立单细胞培养实验，可实现多个单细胞的高效配对及显微分析。
本文内容
摘要
摘要
细胞共培养实验已被广泛用于研究不同类型细胞之间的细胞间相互作用，以更深入地理解包括癌症在内的多种疾病的生物学机制。然而，使用传统的共培养系统难以阐明高度异质性细胞群体中复杂的细胞间相互作用机制，因为亚群细胞的异质性会被平均值所掩盖；传统共培养系统仅能描述群体信号，无法追踪单个细胞的行为。此外，由于泊松分布的影响，传统单细胞实验方法在细胞操作方面效率较低。微加工器件是单细胞研究领域的一项新兴技术，因其能够高通量地精确操控单个细胞，并减少样品和试剂的消耗。本文介绍了用于多种单细胞共培养的微流控芯片的设计理念与应用。该芯片可在培养腔室中高效捕获多种类型的单细胞（捕获效率约46%），并提供充足的培养空间，适用于在单细胞水平上研究细胞间相互作用下的细胞行为（如迁移、增殖等）。我们利用淋巴管内皮细胞与口腔鳞状细胞癌细胞，在该微流控平台上开展了活体多单细胞相互作用的共培养实验。
引言
进行多种单细胞的单细胞共培养实验，需要能够高效捕获不同类型的单细胞，并提供充足的培养空间1。由于所需设备成本较低，有限稀释法是此类实验制备单细胞最常用的方法。然而，受限于泊松分布，其单细胞获取概率最高仅为37%，导致实验操作繁琐且耗时2。相比之下，使用荧光激活细胞分选（FACS）可突破泊松分布的限制，高效地制备单细胞3。但FACS因仪器昂贵且维护成本高，可能并不适用于部分实验室。近年来已开发出用于单细胞捕获4、单细胞配对5和单细胞培养的微加工装置。这些装置的优势在于能够精确操控单细胞6、实现高通量实验，或减少样品和试剂消耗。然而，由于泊松分布的限制1,7,8，或现有微流控装置无法捕获两种以上类型的单细胞4,5,6,9,10，目前仍难以利用微流控装置开展包含多种细胞类型的单细胞共培养实验。
例如，Yoon 等人报道了一种用于细胞间相互作用研究的微流控装置11。该装置采用概率法在同一个腔室中实现细胞配对。然而，由于装置结构的几何限制，仅能实现两种不同类型细胞的配对。Lee 等人的另一项研究展示了一种确定性的单细胞捕获与配对方法12。该装置通过确定性方法提高了配对效率，但受限于细胞配对所需的较长操作时间。具体而言，只有在第一个被捕获的细胞在表面贴附24小时后，才能进行第二个细胞的捕获。Zhao 等人报道了一种基于液滴的微流控装置，用于捕获两种类型的单个细胞13。我们可以发现，基于液滴的微流控装置仍然受限于泊松分布，仅适用于非贴壁细胞，并且在培养过程中无法更换培养液。
此前，我们开发了一种微流控"流体动力穿梭芯片"，该芯片利用确定性的流体动力捕获多种类型的单细胞进入培养腔，并可进一步开展共培养实验，以分析细胞间相互作用下单个细胞的迁移行为14。该流体动力穿梭芯片由多个单元阵列组成，每个单元包含一个蛇形旁通通道、一个捕获位点和一个培养腔。通过蛇形旁通通道与培养腔之间流动阻力的差异，结合特别设计的操作流程，可实现不同类型单细胞的重复捕获。值得注意的是，培养腔具有充足的空间，不仅可在细胞捕获过程中防止细胞被冲走，还能为细胞的铺展、增殖和迁移提供足够的空间，从而实现对活体单细胞相互作用的实时观察。本文重点介绍该装置的制备过程及详细的操作步骤。
方案
1. 通过软光刻技术制备晶圆模具
注意：掩模图案数据可在我们之前的出版物中获取14。
- 将一片4英寸硅片置于120 °C烘箱中脱水15分钟。
- 在4英寸硅片上以1,000 rpm转速旋涂4 g SU-8 2负性光刻胶，持续30秒，形成一层厚度为5 µm的薄膜（第1层）。
- 将第1层在65 °C热板上预烘1分钟，然后转移至95 °C热板上继续烘烤3分钟。
- 将第1层冷却至室温，放置于半自动掩模对准器的载具上，并与第1层镀铬光掩模（捕获位点层）进行对准。
- 使用365 nm紫外光以150 mJ/cm2的剂量曝光第1层。
- 将第1层从对准器中取出，在65 °C热板上后烘1分钟，随后转移至95 °C热板上继续烘烤1分钟。
- 将第1层冷却至室温，浸入丙二醇单甲醚乙酸酯溶液中清洗2分钟，以去除未交联的光刻胶，再用氮气轻轻吹干，显现出第1层对准标记。
- 用胶带覆盖第1层对准标记，在其上以1,230 rpm转速旋涂4 g SU-8 10负性光刻胶，持续30秒，形成厚度为25 µm的第2层。
- 移除胶带，将第2层在65 °C热板上预烘3分钟，然后转移至95 °C热板上继续烘烤7分钟。
- 将第2层冷却至室温，放置于半自动掩模对准器的载具上，将第2层镀铬光掩模（旁路通道层）与第1层对准标记对齐。
- 使用365 nm紫外光以200 mJ/cm2的剂量曝光第2层。
- 将第2层从对准器中取出，在65 °C热板上后烘1分钟，随后转移至95 °C热板上继续烘烤3分钟。
- 将第2层冷却至室温，用胶带覆盖第1层对准标记，在其上以1,630 rpm转速旋涂4 g SU-8 2050负性光刻胶，持续30秒，形成厚度为100 µm的第3层。
- 移除胶带，将第3层在65 °C热板上预烘5分钟，然后转移至95 °C热板上继续烘烤20分钟。
- 将第3层冷却至室温，放置于半自动掩模对准器的载具上，将第3层镀铬光掩模（培养腔层）与第1层对准标记对齐。
- 使用365 nm紫外光以240 mJ/cm2的剂量曝光第3层。
- 将第3层从对准器中取出，在65 °C热板上后烘5分钟，随后转移至95 °C热板上继续烘烤10分钟。
- 将第3层冷却至室温，浸入丙二醇单甲醚乙酸酯溶液中清洗10分钟，以去除未交联的光刻胶，再用氮气轻轻吹干。
2. 用于多重单细胞捕获的PDMS装置制备
- 将晶圆模具和含有 100 µL 三氯硅烷的称量皿放入干燥器中（仅用于硅烷化处理），抽真空（-85 kPa）15 分钟。
注意：在浇铸 PDMS 前，使用三氯硅烷对晶圆表面进行硅烷化处理，以形成疏水表面特性，从而使 PDMS 可轻松从晶圆模具上剥离。 - 停止抽真空，然后将晶圆模具在干燥器中（仅用于硅烷化处理）于 37 °C 下静置至少 1 小时。
- 按 10:1 的比例混合 PDMS 基体与 PDMS 固化剂。将总共 20 g 混合后的 PDMS 倒入直径为 15 cm 培养皿中的晶圆模具上。
- 将 15 cm 培养皿放入干燥器中，抽真空（-85 kPa）1.5 分钟。随后将培养皿从干燥器中取出，在室温下静置 20 分钟。最后用氮气去除 PDMS 中残留的气泡。
- 将 15 cm 培养皿置于 65 °C 烤箱中加热 2–4 小时，以固化 PDMS。
- 将 PDMS 复制品从晶圆模具上取下，然后使用内径为 1.5 mm 和 0.5 mm 的打孔器在 PDMS 上分别打出进样口（1.5 mm）和出样口（0.5 mm）（图 1C）。
- 使用可剥离胶带清洁 PDMS 复制品和载玻片表面，随后用氧气等离子体处理表面（功率 100 W，时间 14 秒）。
- 手动将 PDMS 复制品与载玻片对齐，并使其相互贴合。
- 将 PDMS 载玻片置于 65 °C 烤箱中放置 1 天。
注意：载玻片与 PDMS 复制品之间实现永久键合，从而形成器件。 - 将 PDMS 器件浸入盛有磷酸盐缓冲液的容器中，并放入干燥器内。随后抽真空（-85 kPa）15 分钟，以去除气泡。
- 将 PDMS 器件置于细胞培养超净台中，用紫外光（波长：254 nm）照射 30 分钟进行灭菌。
- 将 PDMS 器件中的缓冲液更换为培养基（含 1% 抗生素和 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 基础培养基），并在 4 °C 下孵育 1 天。此步骤可防止细胞黏附于 PDMS 表面。
3. 单细胞悬液的制备
注意：细胞类型包括人淋巴内皮细胞（LECs）、表达针对WNT5B的特异性shRNA（WNT5B sh4）的人口腔鳞状细胞癌TW2.6细胞以及空载体对照（pLKO-GFP），这些细胞均来自我们之前的研究15。详细的培养步骤请参考我们之前的发表文献。
- 当细胞融合度达到70-80%时，移除培养基。然后用5 mL无菌PBS轻柔洗涤细胞三次。
- 向WNT5B sh4细胞和pLKO-GFP细胞中加入1 mL含有1 µM荧光染料的DMEM-F12培养基（LEC细胞使用MV2培养基），并在室温下孵育30分钟。
注意：LEC细胞使用绿色氯甲基荧光素二乙酸盐（CMFDA）染料染色，WNT5B sh4细胞使用蓝色7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）染料染色，pLKO-GFP细胞使用红色Dil荧光染料染色。 - 用5 mL无菌PBS轻柔洗涤细胞三次。
- 移除PBS，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（LEC细胞使用0.05%胰蛋白酶-EDTA）。
- 在室温下孵育4分钟，然后轻敲培养皿以促进细胞脱落。
- 加入4 mL DMEM-F12培养基以重悬WNT5B sh4细胞和pLKO-GFP细胞（LEC细胞则加入3 mL MV2培养基和1 mL胰蛋白酶中和液）。将细胞转移至15 mL离心管中，在300 × g 条件下离心3分钟。
- 弃去上清液，用1 mL DMEM-F12培养基轻柔重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活细胞数量16。将细胞以3 × 105 个/mL的浓度配制成1 mL DMEM-F12单细胞悬液，并置于冰上以防止细胞聚集。
注意：为提高单细胞捕获效率，需仔细制备充分解离的单细胞悬液。
4. 多重单细胞捕获与三联单细胞培养
- 将聚四氟乙烯（PTFE）管连接在装置出口与注射泵之间。移除培养基，并将1 µL浓度为3 × 105 个细胞/mL的细胞悬液加入PDMS装置的入口。
- 使用注射泵以0.3 µL/min的流速将细胞悬液载入装置（图2A）。流动方向为从入口流向出口。
注意：加入细胞悬液后应立即开始加载，以防止细胞沉降。 - 在完成步骤4.2后，向PDMS装置的入口加入1 µL DMEM-F12培养基。使用注射泵以0.3 µL/min的流速将DMEM-F12培养基载入装置（图2B）。流动方向为从入口流向出口。
- 使用注射泵以10 µL/min的流速将0.3 µL DMEM-F12培养基载入装置（图2C）。流动方向为从出口流向入口。
- 重复步骤4.1至4.4，将其他类型的细胞载入装置。
- 完成细胞捕获后，使用4倍物镜的显微镜对每个培养腔室成像。
注意：通过细胞的荧光发射信号来识别并计数每个培养腔室中的单个细胞数量。 - 移除PTFE管，并用聚烯烃胶带密封入口和出口，以构建封闭的培养系统。
- 将PDMS装置转移至10 cm培养皿中，并在PDMS装置周围加入10 mL无菌PBS，以防止装置内培养基蒸发。
- 将培养皿转移至培养箱（37 °C、5% CO2 和95%湿度）中进行三重单细胞培养。
- 每隔12小时进行显微观察并拍摄细胞生长图像。
结果
该装置具有三层结构，如切割后的PDMS装置的截面照片所示（图1A）。第一层包含一个捕获位点（宽6.0 µm，高4.6 µm），连接培养腔室与旁路通道。由于培养腔室与旁路通道之间的流动阻力差异，细胞会流入捕获位置并堵塞小通道的入口。当一个细胞被捕获在捕获位置后，小通道的流动阻力增加，导致后续进入的细胞转向并流经旁路通道，进入下一个下游捕获位点。第二层的旁路通道采用蛇形设计（宽25.0 µm，高26.4 µm），以增加其流动阻力。第三层的培养腔室尺寸设计为直径500.3 µm、高111.3 µm，旨在为细胞培养实验提供足够的空间，同时降低腔室内的流速，防止细胞被冲出腔室。
操作步骤所需的工具（图2）在普通实验室中常见，包括显微镜、注射泵、玻璃注射器、离心管、管路和移液器。该装置尺寸约为盖玻片的1/5，厚度为2 mm，适用于在显微镜下使用4倍至20倍物镜进行观察。采用此方法，可在7分钟内捕获培养室中的单细胞，因此三重单细胞的总操作时间少于21分钟。所展示的三种细胞的单细胞捕获效率分别为70.83% ± 15.42%（LECs）、73.96% ± 14.09%（WNT5B sh4）和78.13% ± 3.13%（pLKO-GFP）。三重单细胞的总体捕获效率为47.92% ± 7.86%（图3B）。回流操作步骤用于同时将细胞从捕获位点释放，并使细胞流入培养室（图2C）。在此过程中，若某个细胞未能从其捕获位点释放，则位于其下游捕获位点的已释放细胞将不会进入培养室，原因是旁通通道的流动阻力低于培养室。这是HSC的三重单细胞捕获效率仅为47.92% ± 7.86%的主要原因，尽管如此，该效率仍显著高于泊松分布的概率（约5%）。
细胞培养结果表明，淋巴管内皮细胞与鳞状癌细胞的多种单细胞共培养可进行24 h，可在显微镜下观察细胞的增殖情况和形态变化。图4，补充视频 1-3在存在pLKO-GFP细胞的情况下，WNT5B sh4细胞和LEC表现出更强的增殖能力，并呈现接近片状伪足的形态。这些结果表明，该装置能够高效捕获培养室中多种类型的单细胞，并提供充足的培养空间，适用于研究多种单细胞类型间的相互作用。
图1：流体动力学穿梭芯片的实物照片与显微图像。 （A）PDMS截面的显微图像。（B）单个细胞捕获单元的放大视图。（C）包含48个单元的芯片外观。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：流体动力学穿梭芯片操作流程。（A）由于旁路通道具有较高的流体动力学阻力，单个细胞被捕获在捕获位点。（B）当第一个细胞被捕获并堵塞捕获位点后，后续细胞因流动阻力增加而流向旁路通道。使用培养基冲洗通道中残留的细胞。（C）将细胞回流至培养室。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：肝内皮细胞（LEC）、WNT5B sh4 和 pLKO-GFP 在流体动力穿梭芯片中的单细胞捕获效率。（A）培养室中捕获的三联单细胞的显微镜图像。（B）绿色、蓝色和红色柱状图分别表示单个细胞的捕获效率，黄色柱状图表示三联单细胞的捕获效率。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 4：在流体动力学穿梭芯片中进行 24 小时的双细胞共培养与三细胞共培养。（A）三细胞共培养在 0、12 和 24 小时的显微镜图像。（B）pLKO-GFP 细胞与 WNT5B sh4 细胞共培养在 0、12 和 24 小时的显微镜图像。LEC 细胞用绿色 CMFDA 染料标记，WNT5B sh4 细胞用蓝色 CMAC 染料标记，pLKO-GFP 细胞用红色 DiI 荧光染料标记。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
补充视频 1：细胞加载。 请点击此处观看视频（右键单击可下载）。
补充视频 2：细胞回流。 请点击此处观看该视频（右键单击可下载）。
补充视频 3：第二种细胞回流进入培养腔室。 请点击此处观看该视频（右键单击可下载）。
讨论
肿瘤微环境中不同细胞之间的细胞间相互作用在肿瘤进展中起着重要作用17。为了理解细胞间相互作用的机制，共培养系统被作为一种常见的分析方法。然而，多种细胞类型以及细胞自身的异质性导致了实验复杂性和分析困难。
流体动力穿梭芯片通过确定性方法实现了在培养室中进行多个单细胞的加载，不受稀释法和微孔平台中泊松分布限制的影响。该芯片具有较高的三重单细胞捕获效率（大于45%，而泊松分布方法仅为5%），并证明培养室内的空间足以支持细胞的生长与增殖（图4）。由于该装置能够以简单的设置和操作流程高效地实现多个单细胞的捕获，并支持活细胞培养的实时观察，我们预期这类微流控装置可广泛应用于多种研究领域，包括多个细胞间的细胞相互作用18、药物筛选19以及癌症生物学研究20。另一方面，该装置的结构具有可模塑性，捕获位点的结构和尺寸可调整，因而可拓展应用于微生物和植物细胞等其他领域。理论上，我们的方法也可适用于构建和追踪微生物共培养体系（例如细菌、酵母等）。
该方法的主要局限在于器件制备所需的精度较高。这主要是因为，若最小通道的加工尺寸存在微小偏差，其流动阻力可能会发生显著变化。微通道阻力的精确控制对于实现器件高效捕获单细胞至关重要。另一方面，在细胞培养过程中，各个腔室之间不存在封闭结构，因此某一腔室内细胞的旁分泌物质可能扩散至其他腔室，从而影响其他细胞。最后，在器件制备过程中必须注意通道和管路的清洁。实验中所用的培养基及任何缓冲液均需经过过滤，以防止颗粒物和碎屑堵塞通道。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了科技部（105-2628-E-400-001-MY2）以及中国台湾国立中兴大学与国家卫生研究院联合设立的组织工程与再生医学博士培养计划的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3M 高级聚烯烃诊断微流控医用胶带 | 3M Company | 9795R | |
| 抗生素 | Biowest | L0014-100 | 谷氨酰胺-青霉素-链霉素 |
| AutoCAD 软件 | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | 部件号 057C1-74A111-1001 |
| CellTracker Blue CMAC 染料 | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA 染料 | Invitrogen | C7025 | |
| 普通烘箱 | YEONG-SHIN 公司 | ovp45 | |
| 干燥器 | Bel-Art 产品公司 | F42020-0000 | 节省空间型真空干燥器，190 mm 白色底座 |
| DiIC12(3) 细胞膜染料 | BD Biosciences | 354218 | 用作细胞示踪剂 |
| DMEM-F12 培养基 | Gibco | 11320-082 | |
| 内皮细胞生长培养基 MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| 胎牛血清 Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 系列玻璃注射器（0.1 ml） | Hamilton | 80630 | 100 µL，型号 710 RN SYR，小型可拆卸针头，22 号规格，2 英寸，2 型针尖 |
| Harris Uni-Core 打孔器 | Ted Pella Inc. | 15075 | 内径 1.5 mm |
| Harris Uni-Core 打孔器 | Ted Pella Inc. | 15071 | 内径 0.5 mm |
| 加热板 | YOTEC 公司 | YS-300S | |
| 掩模对准器 | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| 氧气等离子体 | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| 等离子清洗机 | Nordson | AP-300 | 台式等离子处理系统 |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）试剂盒 | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| 聚四氟乙烯（PTFE） | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | 内径 0.51 mm；外径 0.82 mm |
| 可移除胶带 | 3M Company | Scotch 可移除胶带 811 | |
| 硅晶圆 | Eltech Corporation | SPE0039 | |
| 旋涂仪 | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 负性光刻胶 | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 负性光刻胶 | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 负性光刻胶 | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 显影液 | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | 丙二醇单甲醚醋酸酯 |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 703007 | |
| 三氯硅烷 | Gelest, Inc | SIT8174.0 | 十三氟-1,1,2,2-四氢辛基。危险品。对呼吸道具有腐蚀性，遇水剧烈反应。 |
| 胰蛋白酶中和液 | Gibco | R-002-100 |
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