方法文章

使用微流体芯片以确定性方式建立基于单细胞的共培养物

DOI：

10.3791/60202

⸱

2019年9月27日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

本文内容

摘要

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本报告描述了一种基于微流体芯片的方法，用于建立单细胞培养实验，实现多个单细胞的高效配对和微观分析。

摘要

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细胞共培养测定已广泛用于研究不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用，以更好地了解包括癌症在内的疾病的生物学。然而，使用传统的共生系统来澄清高异质细胞群中细胞间相互作用的复杂机制具有挑战性，因为细胞亚群的异质性被平均值所掩盖;传统的共培养系统只能用于描述总体信号，但不能跟踪单个细胞的行为。此外，传统的单细胞实验方法由于泊森分布而降低细胞操作效率。微制造器件是单细胞研究的新兴技术，因为它们能以高通量精确操作单个细胞，并能减少样品和试剂的消耗。在这里，我们描述了微流体芯片在多种单细胞共培养物中的概念和应用。该芯片可以有效地捕获培养室中的多种类型的单个细胞（+46%）并有足够的培养空间可用于研究细胞在单细胞级细胞-细胞相互作用下的行为（如迁移、增殖等）。淋巴内皮细胞和口腔鳞状细胞癌用于在微流体平台上进行单细胞共培养实验，进行活多细胞相互作用研究。

引言

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高效捕获不同类型的单细胞，并提供足够的培养空间，为多种类型的单细胞的单个细胞共培养实验1。限制稀释是准备单细胞用于此类实验的最常见方法，因为所需的设备成本低。然而，由于泊森分布的限制，最大单细胞采集概率仅为37%，使得实验操作费力大，耗时2.相比之下，使用荧光活化细胞分拣（FACS）可以克服泊森分布限制，以高效制备单细胞3。然而，由于仪器仪表和维护费用高昂，一些实验室可能无法进入外地资产管制系统。微造设备最近被开发用于单细胞陷印4，单细胞配对5和单细胞培养应用。这些设备基于其准确操作单细胞6、执行高通量实验或减少样品和试剂消耗的能力而具有优势。然而，使用当前微流体装置对多种细胞类型进行单细胞共培养实验仍然具有挑战性，因为泊森分布1、7、8或不能设备捕获两种以上类型的单个细胞4，5，6，9，10。

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方案

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1. 用软光刻制造晶圆模具

注:掩码模式数据可在我们以前的出版物14中提供。

  1. 在 120°C 烤箱中脱水 4 英寸硅晶圆 15 分钟。
  2. 在 1，000 rpm 转速下将 4 g SU-8 2 负光刻胶旋转到 4 英寸硅片上，30 s 可形成 5 μm 厚的层（层#1）。
  3. 软烘烤层#1在65°C的热板上1分钟，然后将层#1转移到95°C的热板3分钟。
  4. 冷却层#1室温，将其放在半自动蒙版校准器的支架上，并与镀铬光掩膜（捕获位图层）#1层对齐。
  5. 以150 mJ/cm2的剂量照射365nm紫外光的#1层。
  6. 从校准器上取下层#1，在 65°C 热板上进行后烘烤 1 分钟，将层#1转移到 95°C 热板 1 分钟。
  7. 冷却层#1室温。浸入丙二醇单甲基乙醚醋酸溶液中，将未交联的光酸胶洗去2分钟，用氮气轻轻干燥，露出一层#1对齐标记。
  8. 用胶带覆盖层#1对齐标记，将 4 g SU-8 10 负光刻胶旋转到层上，#1在 1，230 rpm 下 30 s，形成 25 μm 厚的层#2。
  9. 取出胶带，软烘烤层#2在65°C的热板上3分钟，然后将层#2转移到95°C热板7分钟。
  10. 冷层#2室温，将图层#2放置在半自动蒙版校准器的支架上，并将图....

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结果

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该器件具有三层结构，如切割 PDMS 器件的横截面照片所示（图1A）。第一层包含连接文化室和旁路通道的捕获位点（宽度为 6.0 μm，高度为 4.6 μm）。培养室和通路通道之间的流动电阻差异导致细胞流入捕获位置并填充小路径的入口。在捕获位置捕获单元后，小路径的流量阻力增加，导致下一个传入的单元朝向并通过旁路通道到达下一个下游捕获站点。第二层旁通通道（宽度25.0μm，高26.4μm）的蛇形设计用于增加其流动阻力。第三层培养室的尺寸（直径500.3μm，高111.3μm）旨在为细胞培养实验提供足够的空间，并降低腔室中的流速，防止细胞被冲出腔室。

操作程序所需的工具（图2）在一般实验室中很常见，包括显微镜、注射器泵、玻璃注射器、离心管、管和移液器。该装置大约是2毫米厚度的盖玻片的1/5，适合在显微镜下用.......

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讨论

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肿瘤微环境中各种细胞间的相互作用对肿瘤17的进展起着重要作用。为了理解细胞-细胞相互作用的机制，共培养系统作为一种常见的分析方法。然而，多种细胞类型和细胞本身的异质性导致了实验的复杂性和分析困难。

流体动力穿梭芯片允许通过确定性方法在培养室中进行多个单元加载，而不受稀释方法和微孔平台中的泊森分布限制的限制。通过提供高三元单单元捕获效率（大于45%，泊森分布法为5%）并证明在培养室中，空间足以促进细胞生长和增殖（图4）。由于其能够通过简单的设置和协议高效地执行多个单细胞捕获和活细胞培养观测，我们设想这些微流体设备是各种应用的有用工具，包括细胞多细胞18、药物筛选19、癌症生物学20个相互作用。另一方面，设备结构可塑性，采集部位的结构和尺寸可以改变，并应用于微生物和植物细胞等其他领域。从理论上讲，我们的方法也具有建立和跟踪微生物共培养物（.......

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披露

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提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

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这项工作得到了科技部（105-2628-E-400-001-MY2）和组织工程和再生医学博士项目、国立中兴大学和国家卫生研究院的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3M 高级聚烯烃诊断微流控医用胶带3M 公司9795R
抗生素BiowestL0014-100谷氨酰胺-青霉素-链霉素
AutoCADAutodeskAutoCAD LT 2011零件号 057C1-74A111-1001
CellTracke 蓝色 CMAC 染料InvitrogenC2110
CellTracker 绿色 CMFDA 染料InvitrogenC7025
常规烘箱YEONG-SHIN 公司OVP45
干燥器Bel-Art ProductsF42020-0000节省空间的真空干燥器 190 毫米白色底座
DiIC12（3） 细胞膜染料BD Biosciences 354218用作细胞追踪器
DMEM-F12 培养基Gibco11320-082
内皮细胞生长培养基 MV 2PromoCellC-22022
胎牛血清 HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton 700 系列玻璃注射器 （ 0.1 ml ）Hamilton80630100 µL，型号 710 RN SYR，小型可拆卸 NDL，22 秒 ga，2 英寸，点式 2
Harris Uni-Core 打孔机Ted Pella Inc.15075配备 1.5 毫米内径
Harris Uni-Core 打孔机Ted Pella， Inc.15071带 0.5mm 内径
加热板YOTEC 公司YS-300S
Msak 对准器Deya Optronic CO.A1K-5-MDA
氧气等离子体诺信 MarchAP-300
等离子清洗剂诺信AP-300台式等离子处理系统
聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 套件道康宁Sylgard 184
聚四氟乙烯 （PTFE）Ever Sharp Technology， Inc.TFT-23T内径，0.51 mm;外径，0.82 mm
可移除胶带3M CompanyScotch Removable Tape 811
硅晶片Eltech 公司SPE0039
旋涂机Synrex Co.， Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
体视显微镜徕卡显微系统 徕卡E24
SU-8 10 负性光刻胶MicroChemY131259
SU-8 2 负性光刻胶MicroChemY131240
SU-8 2050 负性光刻胶MicroChemY111072
SU-8 显影远大化工公司GP5002-000000-72GC丙二醇单甲醚乙酸
酯注射泵哈佛仪器703007
三氯氢硅烷Gelest， IncSIT8174.0十三氟-1,1,2,2-四氢辛基。危险。对呼吸道有腐蚀性，与水 急剧地发生反应。
胰蛋白酶中和剂溶液GibcoR-002-100
软件 剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y.

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PDMS

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