方法文章

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

DOI：

10.3791/60215

⸱

2019年10月4日

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microRNA（miRNA）在健康与疾病中的生物学意义主要依赖于多种同时失调的miRNA所形成的特定组合，而非单个miRNA的作用。鉴定这些特定的miRNA模块是充分发挥其治疗潜力的关键步骤。这一点极为重要，因为miRNA的组合特性在实际应用中具有可操作性。本文描述了一种用于定义特定miRNA特征的方法，该特征与胶质母细胞瘤中癌性染色质抑制因子的调控相关。该方法首先确定在肿瘤组织与正常组织相比时发生失调的一组普遍miRNA；随后通过不同培养条件进一步细化分析，明确在特定细胞状态下共表达的miRNA亚群。最后，将满足上述筛选条件的miRNA组合成一种人工多顺反子转基因结构，该结构基于天然存在的miRNA基因簇骨架构建，用于在受体细胞中过表达这些miRNA模块。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA 为多种疾病的广谱基因治疗策略开发提供了无与伦比的机遇1,2,3，包括癌症4,5。这一前景基于这些生物分子的若干独特特性，如分子量小6、生物合成过程简单7，以及天然倾向于协同发挥作用8。许多疾病均表现出特定的 miRNA 表达模式，这些模式通常共同调控复杂的生物学功能9。本方法的首要目标是建立一种策略，用于鉴定在特定细胞功能中具有协同作用的 miRNA 群组；进而为后续研究与应用中重建此类 miRNA 组合提供可行方案。

该方法能够同时对多个miRNA进行功能分析，利用它们对大量mRNA的协同靶向作用，从而重现疾病的复杂分子图景。最近，该方法已被用于鉴定一组三个miRNA，它们：1）在脑癌中同时呈下调表达；2）在神经分化过程以及辐射或DNA烷基化试剂引起的基因毒性应激反应中，表现出强烈的共表达模式。通过下文所述的聚类方法，对这三个miRNA组成的模块进行联合再表达，可显著干扰癌细胞的生物学行为，并可便捷地作为基因治疗策略用于临床前研究10。本实验方案对于从事miRNA研究及其转化应用的研究人员可能具有特别意义。

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方案

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1. 胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征

  1. 胶质母细胞瘤与正常脑组织间差异性 miRNA 表达的广谱分析
    1. 首先，确定在肿瘤中表达显著失调的 miRNA。可通过至少以下三种方法实现：
      1. 在 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 获取癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）中的测序数据11。
      2. 利用新鲜手术标本进行微阵列分析12。
      3. 使用已发表的数据集13。
        注意：无论选择哪种方法，其输出结果均提供一组在统计学上与肿瘤生物学显著相关（正相关或负相关）的 miRNA。该初始 miRNA 集合构成进一步分析的基础，通过更动态的表达变化分析，从中识别出功能关联最为严格的 miRNA 子集，如下文所述。
  2. 条件特异性 miRNA 表达分析
    1. 诱导细胞分化：
      1. 使用预先包被多聚-D-赖氨酸（PDL）的塑料培养皿，以促进单层细胞培养的形成。包被时，将 PDL 溶于水，配制成 100 µg/mL 的浓度，每 25 cm2 表面使用 1 mL 溶液。PDL 溶液加入后 6 小时，用 PBS 洗涤 2 次。
      2. 将人神经干细胞以等量（100,000 个细胞/5 mL）接种于干细胞培养基（Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 20 ng/mL EGF/FGF）、星形胶质细胞分化培养基（DMEM + 10% FBS）或神经元分化培养基（Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 2 µM 视黄酸）中14。少突胶质细胞分化的方案要求在去除 EGF/FGF 后添加 IGF-1（200 ng/mL）14,15。
      3. 细胞接种后，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 1 周。
    2. RNA 提取：
      1. 7 天后，将细胞从培养箱中取出，弃去培养基。
      2. 用 PBS（5 mL）洗涤细胞，然后加入 1 mL 裂解试剂（参见 材料表）裂解细胞，并用细胞刮刀将细胞刮入 1.5 mL 微离心管中。将含有裂解细胞的管子在室温（RT）下静置 5 分钟。
      3. 按照制造商说明书进行总 RNA 的提取。
    3. miRNA 表达分析：
      1. 通过实时 PCR，使用 TaqMan 探针并遵循制造商的逆转录和 PCR 扩增方案，定量分析在步骤 1.1 中鉴定出的特定 miRNA 在三种分化模式中的差异表达（图 1）。
  3. 通过应激特异性挑战验证 miRNA 簇
    1. 在 Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 20 ng/mL EGF/FGF 中培养 G34 胶质母细胞瘤干细胞样细胞。起始接种 1 × 106 个细胞于 5 mL 培养基中，置于 25 cm2 的低吸附培养瓶中。
    2. 接种后 48 小时开始，每隔 5 天以倍增浓度添加 DNA 烷基化剂替莫唑胺（TMZ），具体如下：
      1. 起始浓度为 5 µM，作用 5 天。5 天后弃去培养基，更换为不含替莫唑胺的新鲜培养基，使存活细胞恢复。48 小时后，加入 10 µM TMZ，继续孵育 5 天。
      2. 重复步骤 1.3.2.1，每次将 TMZ 浓度倍增，直至浓度达到至少 100 µM 且细胞对该药物产生耐药性10。
    3. 在平行实验中，对 G34 细胞进行照射，方法如下：
      1. 将 1 × 106 个细胞接种于 5 mL 培养基中，置于 25 cm2 低吸附培养瓶中，接种后 48 小时开始，以 2 Gy 能量照射细胞（任何可提供光子辐射的照射设备均可）。照射后将细胞放回培养箱，避免扰动。48 小时后，再次以额外 2 Gy 能量照射细胞。
      2. 重复步骤 1.3.3.1 共 4 次，累计照射总能量达 10 Gy。
      3. 照射结束后将细胞放回培养箱，在新鲜培养基中恢复至少 5 天，再进行后续分析。
    4. 诱导耐药性后，使用裂解试剂裂解细胞，并根据制造商说明书提取总 RNA。
    5. 按照步骤 1.2.1 所述方法，分析在第 1.1–1.2 节中鉴定出的特定 miRNA 的表达情况（图 2）。
  4. 聚类 miRNA 功能汇聚的表征
    1. 利用 miRNA 靶标预测工具，获取在第 1.2–1.3 节中确定的各 miRNA 的预测靶基因组。
      注意：我们通常使用 TargetScan，因其算法会定期更新16。其他可用的预测工具包括 miRanda17、miRDB18 和 DIANA-miRPath19。这些程序均为免费的基于网页的应用。
      1. 在 TargetScan 首页，从预填充的下拉菜单中选择感兴趣的 miRNA，点击 提交 按钮。
      2. 通过 下载表格 链接下载得到的靶基因列表为电子表格格式（补充图 1）。
      3. 为降低假阳性预测的可能性，在后续分析中仅包含保守位点列中的靶基因。此外，可通过使用其他 miRNA 预测程序（见上文）并仅保留所有算法共同预测的靶基因，进一步提高筛选的严格性。
    2. 使用 ToppGene Suite20 根据基因本体（Gene Ontology）分类对所得靶基因组进行分类，以评估各 miRNA 共同富集的通路。
      1. 将步骤 1.4.1 得到的靶基因列表粘贴至 "训练基因集" 窗口中，输入类型选择 HGNC 符号。点击 提交 > 开始。程序将输出一个表格，显示所输入基因列表中最显著的 "GO" 分类（补充图 2）。
    3. 最终为确定每个 miRNA 对共同通路或细胞过程（本例中为染色质调控）的调控贡献，使用 Bioinformatics and Evolutionary Genomics 网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）提供的维恩图（Venn diagram）功能，将步骤 1.4.1 中获得的每个靶基因组与参与该特定细胞过程（即染色质调控）的全部基因列表进行比对。
      注意：该程序可同时分析多个组的交集（图 3）。每个 miRNA 提供的特异性唯一靶基因随后将被注释，并用于后续功能实验。
      1. 在程序首页，上传或复制粘贴每个感兴趣 miRNA 的靶 mRNA 列表至相应窗口中，并为每个列表命名唯一标识符。
      2. 点击 提交。程序将生成一个可视化维恩图，显示各区域的基因数量，同时提供每个子集及交集组合的完整 mRNA 列表。

2. 将miRNA模块组装成多顺反子转基因簇

  1. 基于miR-17-92簇位点的转基因载体构建
    1. 从 Ensembl 基因组浏览器获取 miR-17-92 基因簇的核苷酸序列21选择约800个碱基对 "核心" 包含该位点全部六个编码 miRNA 发夹结构的序列，以及核心序列上游（5'）和下游（3'）各至少 200 个核苷酸的侧翼序列。
    2. 将上述序列粘贴到任意文字编辑程序中。
    3. 通过在miRBase中检索，确定六个天然发夹结构的序列22在先前已确定的范围内标记每一段序列 "核心" 序列。每个发夹结构之间的任何序列均代表间隔序列，这些间隔序列对于转基因的正确加工至关重要。
    4. 移除天然发夹序列 "核心" 序列，但每个发夹结构的5'和3'末端各有3-5个核苷酸除外，这些核苷酸将作为新发夹结构的接合区域。
  2. 构建编码多种选定miRNA的新转基因
    1. 从 miRBase 获取拟在转基因中过表达的 miRNA 的发夹序列。仔细记录微处理器切割位点的特定核苷酸。
    2. 用步骤 2.2.1 中获得的所需 miRNA 的发夹序列替换已移除的发夹序列（步骤 2.1.4）。
    3. 在转基因序列两侧的侧翼区域添加所需的限制性酶切位点，以方便将其亚克隆至选定的递送载体中。验证所选的限制性酶切位点在转基因序列内部不存在。
    4. 对于阴性对照，使用20个核苷酸的随机序列替换每种成熟miRNA的天然20个核苷酸序列。可利用在线工具（如 https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence）生成这些随机序列。
  3. 验证转基因的二维结构
    1. 将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件RNAweb Fold中23.
    2. 使用标准程序设置，点击 继续.
    3. 分析图形输出结果，特别关注是否存在结构明确的发夹结构，以及在微处理器切割位点近端至少11个核苷酸处是否存在双链茎结构。同时，检查发夹序列内部是否存在分支点图4).

3. 通过DNA合成获取转基因

  1. 在嵌合miRNA簇的设计及计算机模拟验证完成后，通过商业供应商的DNA合成服务获取工作序列24 并进行下游克隆至载体及转基因递送。我们已采用慢病毒载体进行体外递送10 以及用于体内颅内递送的腺相关病毒（AAVs）25.

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结果

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该方法实现了对一组包含三个miRNA的功能模块的表征，这些miRNA在脑肿瘤中持续下调，且特异性地在神经元分化过程中共表达（图1），并参与治疗后肿瘤的存活应答（图2）。其作用机制是通过调控一条复杂的致癌性染色质抑制通路实现的。这种共表达模式提示这三个miRNA之间存在强烈的协同作用（图3）。因此，利用miRNA分子小且生物合成简单的特性，本实验方案的第二部分设计了一种转基因结构（图4），可在体外和体内同时重现这三个miRNA在胶质母细胞瘤细胞中的表达，显著干扰肿瘤生物学行为，并展现出良好的转化应用前景（图5A,B,C）10。此外，研究还证实该转基因簇在乳腺癌模型中同样具有功能活性（

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讨论

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本方案基于以下理念：miRNA并非孤立发挥作用，而是在特定细胞环境中通过成组协作实现其生物学功能，这些miRNA组的表达由特定的转录调控机制决定26。为了从转化医学角度证明该策略的合理性，本文介绍了一项后续实验方案，可用于在细胞或组织中重建这种多miRNA表达模式。该方法利用了miRNA相对简单的生物合成过程：只要miRNA发夹结构被微处理器复合物（microprocessor）识别，即足以启动正确的miRNA加工过程27。这一最低结构要求使得研究人员能够利用天然存在的miRNA基因簇的遗传骨架作为载体，表达目标miRNA模块。这些模块可被包含在较短的DNA序列中，并可插入任意选择的递送载体。本方案的主要要求是维持发夹结构的完整性以及茎环部分具有足够的长度，以确保适当的切割加工。

在执行本方案时，有两个主要的关键注意事项。第一点是准确确定最佳的miRNA组合。这需要仔细分析细胞或组织与对照相比的miRNA表达特征，以及在实验操作过程中观察到的任何同时发生的表达变化。一旦确定了一组miRN...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨向Harvey Cushing神经肿瘤学实验室的成员致以感谢，感谢他们的支持与建设性批评。本研究工作由NINDS基金K12NS80223和K08NS101091资助，项目负责人：P. P.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 低熔点琼脂糖 IBI ScientificIB70058
0.45 µM 无菌滤器单元默克密理博SLH033RS
1.5 mL 微型离心管Eppendorf22431081
6孔板 Greiner Bio-One657160
裸鼠（FoxN1 nu/nu）Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 补充剂 赛默飞世尔科技12587010
细胞培养瓶Greiner Bio-One660175
细胞刮刀，16 cmSarstedt83.1832
铯-137辐照仪 JL Sheperd and Associates核心设施（哈佛医学院）
氯仿Sigma-Aldrich439142-4L
DMEM，高糖，丙酮酸钠 赛默飞世尔科技11995040
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 Gibco14190144
伊红Y溶液 Sigma-AldrichE4009
胎牛血清 Sigma-AldrichF9665
甲醛溶液Sigma-AldrichHT501128
GlutaMAX 补充剂 赛默飞世尔科技35050061
HEK-293美国典型培养物保藏中心ATCC CRL-1573
苏木精溶液Sigma-Aldrich1051750500
人原代胶质瘤干细胞样细胞（GBM62）由 E. A. Chiocca 博士提供（Brigham and Women’波士顿，马萨诸塞州，s 医院
人原代胶质瘤干细胞样细胞（MGG4）由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院 Hiroaki Wakimoto 博士提供
慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 赛默飞世尔科技11668019
带制冷功能的微型离心机Eppendorf型号 5424 R，货号 5404000138
封片剂 赛默飞世尔科技4112APG
Nalgene 高速聚碳酸酯圆底离心管 赛默飞世尔科技 3117-0380PK
NanoDrop赛默飞世尔科技2000c
神经前体细胞（NPC）由 Jakub Godlewski 博士提供（Brigham and Women’波士顿，马萨诸塞州，s 医院
Neurobasal 培养基 赛默飞世尔科技21103049
尼康Eclipse Ti电动荧光显微镜系统日本尼康14314
Opti-MEM赛默飞世尔科技31985088
PCR管 Sigma-AldrichCLS6571-960EA
青霉素-链霉素 赛默飞世尔科技15140122
94/16 培养皿 Greiner Bio-One632180
聚-D-赖氨酸 Sigma- AldrichP4707
重组人表皮生长因子 PeproTech AF-100-15
重组人碱性成纤维细胞生长因子 PeproTech AF-100-18B
视黄酸Gibco12587-010 
RNA小量制备试剂盒Direct-zolR2050
S1000型热循环仪 伯乐（Bio-Rad）1852196
小型动物影像引导微型照射器 Xstrahl Life Sciences，英国核心设施（美国波士顿达纳—法伯癌症研究所）
Sorvall WX+ 超速离心机 赛默飞世尔科技 75000100
StemPro Accutase 赛默飞世尔科技A1110501
StepOne 实时荧光定量 PCR 系统应用生物系统公司 4376357
SterilGARD 生物安全柜 The Baker CompanySG403A-HE
蔗糖Sigma-AldrichS9378
T98-G美国典型培养物保藏中心ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒 赛默飞世尔科技4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix赛默飞世尔科技4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek最佳切割温度 Fisher ScientificNC9636948
TRIzol试剂 赛默飞世尔科技15596026裂解试剂
U251-MG美国典型培养物保藏中心ATCC HTB-17
U87-MG 美国典型培养物保藏中心ATCC HTB-14
ViraPower 慢病毒表达系统 赛默飞世尔科技K4970-00
水，HPLC 级FisherW54
二甲苯 Sigma-Aldrich534056

参考文献

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microRNA miR 17 92 TargetScan ToppGene RNA

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