方法文章

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

DOI：

10.3791/60215

⸱

2019年10月4日

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microRNA（miRNA）在健康与疾病中的生物学意义主要依赖于多种同时失调的miRNA所形成的特定组合，而非单个miRNA的作用。鉴定这些特定的miRNA模块是充分发挥其治疗潜力的关键步骤。这一点极为重要，因为miRNA的组合特性在实际应用中具有可操作性。本文描述了一种用于定义特定miRNA特征的方法，该特征与胶质母细胞瘤中癌性染色质抑制因子的调控相关。该方法首先确定在肿瘤组织与正常组织相比时发生失调的一组普遍miRNA；随后通过不同培养条件进一步细化分析，明确在特定细胞状态下共表达的miRNA亚群。最后，将满足上述筛选条件的miRNA组合成一种人工多顺反子转基因结构，该结构基于天然存在的miRNA基因簇骨架构建，用于在受体细胞中过表达这些miRNA模块。

引言

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miRNA 为多种疾病的广谱基因治疗策略开发提供了无与伦比的机遇1,2,3，包括癌症4,5。这一前景基于这些生物分子的若干独特特性，如分子量小6、生物合成过程简单7，以及天然倾向于协同发挥作用8。许多疾病均表现出特定的 miRNA 表达模式，这些模式通常共同调控复杂的生物学功能9。本方法的首要目标是建立一种策略，用于鉴定在特定细胞功能中具有协同作用的 miRNA 群组；进而为后续研究与应用中重建此类 miRNA 组合提供可行方案。

该方法能够同时对多个miRNA进行功能分析，利用它们对大量mRNA的协同靶向作用，从而重现疾病的复杂分子图景。最近，该方法已被用于鉴定一组三个miRNA，它们：1）在脑癌中同时呈下调表达；2）在神经分化过程以及辐射或DNA烷基化试剂引起的基因毒性应激反应中，表现出强烈的共表达模式。通过下文所述的聚类方法，对这三个miRNA组成的模块进行联合再表达，可显著干扰癌....

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方案

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1. 胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征

  1. 胶质母细胞瘤与正常脑组织间差异性 miRNA 表达的广谱分析
    1. 首先，确定在肿瘤中表达显著失调的 miRNA。可通过至少以下三种方法实现：
      1. 在 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 获取癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）中的测序数据11。
      2. 利用新鲜手术标本进行微阵列分析12。
      3. 使用已发表的数据集13。
        注意：无论选择哪种方法，其输出结果均提供一组在统计学上与肿瘤生物学显著相关（正相关或负相关）的 miRNA。该初始 miRNA 集合构成进一步分析的基础，通过更动态的表达变化分析，从中识别出功能关联最为严格的 miRNA 子集，如下文所述。
  2. 条件特异性 miRNA 表达分析
    1. 诱导细胞分化：
      1. 使用预先包被多聚-D-赖氨酸（P....

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结果

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该方法实现了对一组包含三个miRNA的功能模块的表征，这些miRNA在脑肿瘤中持续下调，且特异性地在神经元分化过程中共表达（图1），并参与治疗后肿瘤的存活应答（图2）。其作用机制是通过调控一条复杂的致癌性染色质抑制通路实现的。这种共表达模式提示这三个miRNA之间存在强烈的协同作用（图3）。因此，利用miRNA分子小且生物合成简单的特性，本实验方案的第二部分设计了一种转基因结构（图4），可在体外和体内同时重现这三个miRNA在胶质母细胞瘤细胞中的表达，显著干扰肿瘤生物学行为，并展现出良好的转化应用前景（图5A,B,C）10。此外，研究还证实该转基因簇在乳腺癌模型中同样具有功能活性（

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讨论

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本方案基于以下理念：miRNA并非孤立发挥作用，而是在特定细胞环境中通过成组协作实现其生物学功能，这些miRNA组的表达由特定的转录调控机制决定26。为了从转化医学角度证明该策略的合理性，本文介绍了一项后续实验方案，可用于在细胞或组织中重建这种多miRNA表达模式。该方法利用了miRNA相对简单的生物合成过程：只要miRNA发夹结构被微处理器复合物（microprocessor）识别，即足以启动正确的miRNA加工过程27。这一最低结构要求使得研究人员能够利用天然存在的miRNA基因簇的遗传骨架作为载体，表达目标miRNA模块。这些模块可被包含在较短的DNA序列中，并可插入任意选择的递送载体。本方案的主要要求是维持发夹结构的完整性以及茎环部分具有足够的长度，以确保适当的切割加工。

在执行本方案时，有两个主要的关键注意事项。第一点是准确确定最佳的miRNA组合。这需要仔细分析细胞或组织与对照相比的miRNA表达特征，以及在实验操作过程中观察到的任何同时发生的表达变化。一旦确定了一组miRN.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者谨向Harvey Cushing神经肿瘤学实验室的成员致以感谢，感谢他们的支持与建设性批评。本研究工作由NINDS基金K12NS80223和K08NS101091资助，项目负责人：P. P.

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 低熔点琼脂糖 IBI ScientificIB70058
0.45 µM 无菌滤器单元默克密理博SLH033RS
1.5 mL 微型离心管Eppendorf22431081
6孔板 Greiner Bio-One657160
裸鼠（FoxN1 nu/nu）Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 补充剂 赛默飞世尔科技12587010
细胞培养瓶Greiner Bio-One660175
细胞刮刀，16 cmSarstedt83.1832
铯-137辐照仪 JL Sheperd and Associates核心设施（哈佛医学院）
氯仿Sigma-Aldrich439142-4L
DMEM，高糖，丙酮酸钠 赛默飞世尔科技11995040
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 Gibco14190144
伊红Y溶液 Sigma-AldrichE4009
胎牛血清 Sigma-AldrichF9665
甲醛溶液Sigma-AldrichHT501128
GlutaMAX 补充剂 赛默飞世尔科技35050061
HEK-293美国典型培养物保藏中心ATCC CRL-1573
苏木精溶液Sigma-Aldrich1051750500
人原代胶质瘤干细胞样细胞（GBM62）由 E. A. Chiocca 博士提供（Brigham and Women’波士顿，马萨诸塞州，s 医院
人原代胶质瘤干细胞样细胞（MGG4）由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院 Hiroaki Wakimoto 博士提供
慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 赛默飞世尔科技11668019
带制冷功能的微型离心机Eppendorf型号 5424 R，货号 5404000138
封片剂 赛默飞世尔科技4112APG
Nalgene 高速聚碳酸酯圆底离心管 赛默飞世尔科技 3117-0380PK
NanoDrop赛默飞世尔科技2000c
神经前体细胞（NPC）由 Jakub Godlewski 博士提供（Brigham and Women’波士顿，马萨诸塞州，s 医院
Neurobasal 培养基 赛默飞世尔科技21103049
尼康Eclipse Ti电动荧光显微镜系统日本尼康14314
Opti-MEM赛默飞世尔科技31985088
PCR管 Sigma-AldrichCLS6571-960EA
青霉素-链霉素 赛默飞世尔科技15140122
94/16 培养皿 Greiner Bio-One632180
聚-D-赖氨酸 Sigma- AldrichP4707
重组人表皮生长因子 PeproTech AF-100-15
重组人碱性成纤维细胞生长因子 PeproTech AF-100-18B
视黄酸Gibco12587-010 
RNA小量制备试剂盒Direct-zolR2050
S1000型热循环仪 伯乐（Bio-Rad）1852196
小型动物影像引导微型照射器 Xstrahl Life Sciences，英国核心设施（美国波士顿达纳—法伯癌症研究所）
Sorvall WX+ 超速离心机 赛默飞世尔科技 75000100
StemPro Accutase 赛默飞世尔科技A1110501
StepOne 实时荧光定量 PCR 系统应用生物系统公司 4376357
SterilGARD 生物安全柜 The Baker CompanySG403A-HE
蔗糖Sigma-AldrichS9378
T98-G美国典型培养物保藏中心ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒 赛默飞世尔科技4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix赛默飞世尔科技4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek最佳切割温度 Fisher ScientificNC9636948
TRIzol试剂 赛默飞世尔科技15596026裂解试剂
U251-MG美国典型培养物保藏中心ATCC HTB-17
U87-MG 美国典型培养物保藏中心ATCC HTB-14
ViraPower 慢病毒表达系统 赛默飞世尔科技K4970-00
水，HPLC 级FisherW54
二甲苯 Sigma-Aldrich534056

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Gene....

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标签

microRNA miR 17 92 TargetScan ToppGene RNA

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