基于FACS的从副细胞中分离RNA的实验方案 果蝇 雄性附属腺体

摘要

本文介绍了一种从黑腹果蝇（Drosophila）雄性附属腺中分离并分选特定细胞群体（次级细胞）以进行RNA测序和RT-qPCR的实验方案。通过解剖、蛋白酶消化和机械分散等多步骤解离处理后，利用流式细胞术对表达GFP的次级细胞进行分选纯化，从而实现细胞的分离。

摘要

要理解一个器官的功能，通常需要了解其组成细胞群体的作用。然而，由于某些细胞群体数量稀少，往往难以获得足够的材料用于分子研究。例如，黑腹果蝇（Drosophila）雄性生殖系统中的附属腺包含两种不同的分泌细胞类型：主细胞占腺体分泌细胞的96%，而次级细胞（SC）仅占剩余的4%（每只雄蝇约80个细胞）。尽管这两种细胞均产生精液的重要组分，但目前仅发现少数基因是次级细胞特异表达的。由于次级细胞数量稀少，迄今为止对其开展转录组分析仍存在困难。本文介绍一种可用于纯化次级细胞以进行RNA提取和测序的方法。该方案首先解剖表达SC特异性GFP报告基因的果蝇的腺体，随后通过蛋白酶消化和机械解离获得单细胞悬液。在此基础上，利用荧光激活细胞分选仪（FACS）对存活的、带有GFP标记的单个细胞进行分选，进而提取RNA。该方法可在一天内从每组约40只雄蝇中获得特异于次级细胞的RNA，适用于后续的RT-qPCR和/或RNA测序。该方法快速简便，可在短时间内对来自不同基因型或不同环境条件的多种果蝇进行转录组分析。

引言

器官由多种细胞类型组成，每种细胞具有不同的功能，有时表达的基因集合也存在显著差异。为了精确理解器官的功能，研究构成该器官的每一种特定细胞类型通常至关重要。探索细胞可能功能的主要方法之一是转录组分析。这种强大的方法能够提供细胞基因表达的快照，揭示其活跃的生物学过程和信号通路。然而，对于必须从大量邻近细胞中分离出来的稀有细胞群体而言，这类分析往往具有挑战性。例如，黑腹果蝇（Drosophila）雄性附属腺主要由两种分泌细胞类型构成。由于其中较稀有的细胞类型仅占该腺体细胞总数的4%，因此此前尚未采用细胞类型特异性的转录组分析来帮助确定这些细胞的功能。

附属腺（AGs）是昆虫雄性生殖道中的器官，负责产生精液中大部分蛋白质（即精液蛋白质（SFPs）和附属腺蛋白质（ACPs））。已知部分SFPs可诱导交配后雌虫发生生理和行为上的变化，这种现象通常称为交配后反应（PMR）。部分PMR表现包括：排卵和产卵速率增加、精子的储存与释放、雌虫食性改变，以及对二次求偶雄虫的接受度降低。^1,2。由于昆虫在诸多重大社会问题中扮演着重要角色，例如在人类健康方面作为致命疾病的传播媒介，在农业方面既可成为害虫，又对授粉和土壤质量至关重要，因此了解昆虫的繁殖机制是当前重要的研究领域。随着模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的应用，对附腺（AGs）及....

方案

1. 果蝇 使用的品系及雄性个体的收集

1. 本方案中，应使用在精原细胞（SCs）中表达GFP、但在主细胞中不表达的雄性果蝇。此处采用一种AbdB-GAL4驱动子（见参考文献¹⁸），并与位于2号染色体上的UAS-GFP重组。也可使用其他合适的驱动子。若需在不同突变条件下分离SCs，可将相应突变与特异性表达GFP的SC品系进行杂交。
2. 每种基因型和年龄组收集两批约25只健康的未交配雄性果蝇，置于含新鲜制备的Drosophila培养基的培养瓶中，在25 °C下培养3-4天。
   注意：由于年龄、交配状态、营养状况和社会环境均会影响生殖生物学特性，因此必须严格遵循实验方案以控制这些参数。未交配雄性果蝇在蛹羽化后于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，在标准玉米粉-琼脂-酵母培养基上饲养，每瓶20-25只，培养3-4天。

2. 溶液与材料制备

1. 配制以下溶液。
   1. 配制血清补充培养基（SSM）：在Schneider's Drosophila 培养基中添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
   2. 分装1×胰蛋白酶（例如TrypLE Express酶....

结果

本方案使一位实验人员能够在一天内完成从Drosophila雄性附腺中分离次级细胞并提取其RNA的操作（图1）。

我们使用 Abd-B-GAL4 构建¹⁸ 标记次级细胞（SC）而不标记主细胞（MC）的GFP（图2A）。本实验的一个目的是获得精原细胞（SC）的野生型转录组（“野生型”加引号是因为这些细胞来源于表达GFP和GAL4的转基因果蝇）。另一个目的是通过一种快速简便的方法获取SC的RNA，以便在不同条件下研究其基因表达。因此，我们使用野生型和“iab-6^cocuD1携带一个1.1 kb缺失以移除增强子的突变体 Abd-B 负责SC表达。该缺失还移除了启动子 <.......

讨论

已有文献描述了从Drosophila组织（如成虫盘）中解离细胞的方法²³。我们尝试直接将这些方法应用于副腺组织时未能成功，因此促使我们开发了本新方案。蛋白酶消化和机械吹打是本方案成功的关键步骤，我们在第2至第5节中添加了大量注释，以帮助实验人员获得满意的结果。为了实现有效解离，蛋白酶必须能够接触到副腺细胞，而这些细胞受到腺腔内黏稠精液以及腺体周围肌层的保护。因此，解剖腺体远端部分至关重要（步骤3.6）。此外，使用剧烈振荡进行至少60分钟的消化（步骤4.1）也是必要的。使用胰蛋白酶溶液（例如TrypLE）进行温和消化，可在机械解离前保持腺体完整性和细胞活力。在胰蛋白酶溶液中添加木瓜蛋白酶（papain）或胶原酶（collagenase）可改善解离效果（使用更少的吹打次数即可实现完全解离，从而提高细胞存活率）。然而，这些酶单独使用均不足以实现充分的细胞解离。在第2.2.2部分中制备的圆口细尖移液枪头是本方法的关键环节。因此，应通过小规模预实验优化吹打操作（步骤5.2–5.3），以选择最佳的枪头组合（参见步骤5.3中的注释）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	VWR	734-2325
解剖用双目显微镜
带GFP光源的双目显微镜
本生灯
Draq7 0.3 mM	BioStatus	DR71000
1.5 mL塑料微量离心管	Eppendorf
FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios
精细解剖镊
胎牛血清	Gibco	10270-106	使用前需热灭活
解剖用玻璃培养皿
冰桶
ImProm-II反转录系统	Promega	A3800
MasterPure RNA纯化试剂盒	Epicentre	MCR85102
Nextera XT试剂盒	illumina		https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000移液器	Gilson
P20移液器	Gilson
P200移液器	Gilson
木瓜蛋白酶			50U/mL储备液
PBS			自行配制
青霉素-链霉素	Gibco	15070-063
polydT引物
随机六聚体引物
RNA 6000 Pico试剂盒	Agilent
Schneider’s Drosophila培养基	Gibco	21720-001
SMARTer cDNA合成试剂盒	Takara		https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
CFX用SYBR Select Master Mix	applied biosystems	4472942
恒温振荡器	杭州艾本森仪器	MS-100
Tipone 1250 μL刻度吸头	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL斜面吸头	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express酶	Gibco	12604013
涡旋振荡器