本文介绍了一种从黑腹果蝇（Drosophila）雄性附属腺中分离并分选特定细胞群体（次级细胞）以进行RNA测序和RT-qPCR的实验方案。通过解剖、蛋白酶消化和机械分散等多步骤解离处理后，利用流式细胞术对表达GFP的次级细胞进行分选纯化，从而实现细胞的分离。
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本文内容
摘要
摘要
要理解一个器官的功能，通常需要了解其组成细胞群体的作用。然而，由于某些细胞群体数量稀少，往往难以获得足够的材料用于分子研究。例如，黑腹果蝇（Drosophila）雄性生殖系统中的附属腺包含两种不同的分泌细胞类型：主细胞占腺体分泌细胞的96%，而次级细胞（SC）仅占剩余的4%（每只雄蝇约80个细胞）。尽管这两种细胞均产生精液的重要组分，但目前仅发现少数基因是次级细胞特异表达的。由于次级细胞数量稀少，迄今为止对其开展转录组分析仍存在困难。本文介绍一种可用于纯化次级细胞以进行RNA提取和测序的方法。该方案首先解剖表达SC特异性GFP报告基因的果蝇的腺体，随后通过蛋白酶消化和机械解离获得单细胞悬液。在此基础上，利用荧光激活细胞分选仪（FACS）对存活的、带有GFP标记的单个细胞进行分选，进而提取RNA。该方法可在一天内从每组约40只雄蝇中获得特异于次级细胞的RNA，适用于后续的RT-qPCR和/或RNA测序。该方法快速简便，可在短时间内对来自不同基因型或不同环境条件的多种果蝇进行转录组分析。
引言
器官由多种细胞类型组成，每种细胞具有不同的功能，有时表达的基因集合也存在显著差异。为了精确理解器官的功能，研究构成该器官的每一种特定细胞类型通常至关重要。探索细胞可能功能的主要方法之一是转录组分析。这种强大的方法能够提供细胞基因表达的快照，揭示其活跃的生物学过程和信号通路。然而，对于必须从大量邻近细胞中分离出来的稀有细胞群体而言，这类分析往往具有挑战性。例如，黑腹果蝇（Drosophila）雄性附属腺主要由两种分泌细胞类型构成。由于其中较稀有的细胞类型仅占该腺体细胞总数的4%，因此此前尚未采用细胞类型特异性的转录组分析来帮助确定这些细胞的功能。
附属腺（AGs）是昆虫雄性生殖道中的器官，负责产生精液中大部分蛋白质（即精液蛋白质（SFPs）和附属腺蛋白质（ACPs））。已知部分SFPs可诱导交配后雌虫发生生理和行为上的变化，这种现象通常称为交配后反应（PMR）。部分PMR表现包括：排卵和产卵速率增加、精子的储存与释放、雌虫食性改变，以及对二次求偶雄虫的接受度降低。1,2。由于昆虫在诸多重大社会问题中扮演着重要角色，例如在人类健康方面作为致命疾病的传播媒介，在农业方面既可成为害虫，又对授粉和土壤质量至关重要，因此了解昆虫的繁殖机制是当前重要的研究领域。随着模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的应用，对附腺（AGs）及其分泌蛋白（ACPs）的研究已取得显著进展。这些研究揭示了附腺及其所产生的一些特定蛋白在形成交配后反应（PMR）中的作用，推动了对其他物种（如病媒昆虫）相关研究的深入 埃及伊蚊3,4及其他昆虫1,5此外，由于精囊腺分泌精液的组成成分1,6 它们常被视为哺乳动物前列腺和精囊的功能类似物。由于这两种组织类型在功能上的相似性以及分子水平上的相似性，使得附腺（AGs）成为研究果蝇中前列腺的模型。7.
在黑腹果蝇（Drosophila）雄性个体中，存在两个附属腺叶。每个腺叶均可视为一个囊状结构，由单层分泌细胞围绕中央管腔构成，并被平滑肌包裹。如上所述，构成该腺体的分泌细胞在形态、发育和功能上可分为两种不同类型：多边形的主细胞（约占细胞总数的96%）和体积较大、呈圆形的次级细胞（SC）（约占剩余4%的细胞，即每个腺叶约40个细胞）。研究表明，这两种细胞类型均能产生不同的精液蛋白（ACP），以诱导并维持交配后反应（PMR）。迄今为止获得的大多数数据均强调了一种单一蛋白质在触发PMR典型行为中的关键作用。这种蛋白质即性肽（sex peptide），是由主细胞分泌的一种含有36个氨基酸的小肽8,9,10。尽管性肽在PMR中似乎起着主导作用，但由主细胞和次级细胞共同产生的其他ACP也被证实可影响PMR的多个方面11,12,13,14,15,16,17。例如，根据目前的研究，次级细胞通过其产生的蛋白质，似乎在交配后第一天之后维持性肽信号的持续传递中起必要作用18。
由于精囊细胞（SCs）数量稀少（每只雄性个体中仅有约80个细胞），目前关于这些细胞及其所产生蛋白质的所有知识均来源于遗传学研究和候选基因方法。迄今为止，仅有一小部分基因被证实为SC特异性表达，其中包括同源结构域蛋白Defective proventriculus（Dve）19、长链非编码RNA MSA20、Rab6, 7, 11 和 1921、CG1656 与 CG1757511,15,21，以及同源框转录因子Abdominal-B（Abd-B）18。此前我们发现，在次级细胞中同时缺失Abd-B表达和lncRNA MSA的突变体（iab-6cocuD1突变体）可使交配后反应（PMR）持续时间从约10天缩短至仅1天12,18,20。该表型似乎由SP在雌性生殖道中储存异常所致12,18,20。在细胞水平上，该突变体的次级细胞呈现异常形态，丧失其特有的空泡样结构18,20,21。利用该突变品系，我们此前曾尝试通过比较野生型与突变型附属腺整体转录谱的方法，鉴定参与SC功能的基因12。此外，其他实验室的研究表明，次级细胞的数量、形态及液泡内容物受雄性个体饮食、交配状态和年龄的影响21,25,26。
尽管采用这些方法已取得一定进展，但距离获得完整的精原干细胞转录组仍相去甚远。由于这些细胞在器官中极为稀少，即使使用野生型细胞也难以进一步推进研究。若要检测这些细胞在特定环境刺激后的基因表达变化，难度将更大。因此，亟需建立一种快速且简便的方法，用于在不同遗传背景和环境条件下分离和纯化精原干细胞RNA。
两者均 Abd-B 和 MSA 基因需要来自特定的1.1 kb增强子 果蝇 双胸复合体（称为 bithorax complex） D1 增强子）以调控其在SCs中的表达18,20。该增强子先前已被用于创建一个 GAL4 驱动因子，当与一个 UAS-GFP，能够在施万细胞（SCs）中特异性驱动强烈的GFP表达。因此，我们以该品系为基础，建立了一种FACS方案，用于从野生型和 iab-6cocuD1 氨基糖苷类（AGs）。作为 iab-6cocuD1 突变型施万细胞表现出不同的细胞形态，我们证明该方案可用于在截然不同的条件下从这种稀有细胞类型中分离细胞，以进行转录组分析。
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方案
1. 果蝇 使用的品系及雄性个体的收集
- 本方案中，应使用在精原细胞（SCs）中表达GFP、但在主细胞中不表达的雄性果蝇。此处采用一种AbdB-GAL4驱动子（见参考文献18），并与位于2号染色体上的UAS-GFP重组。也可使用其他合适的驱动子。若需在不同突变条件下分离SCs，可将相应突变与特异性表达GFP的SC品系进行杂交。
- 每种基因型和年龄组收集两批约25只健康的未交配雄性果蝇，置于含新鲜制备的Drosophila培养基的培养瓶中，在25 °C下培养3-4天。
注意：由于年龄、交配状态、营养状况和社会环境均会影响生殖生物学特性，因此必须严格遵循实验方案以控制这些参数。未交配雄性果蝇在蛹羽化后于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，在标准玉米粉-琼脂-酵母培养基上饲养，每瓶20-25只，培养3-4天。
2. 溶液与材料制备
- 配制以下溶液。
- 配制血清补充培养基（SSM）：在Schneider's Drosophila 培养基中添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
- 分装1×胰蛋白酶（例如TrypLE Express酶），室温保存。
- 分装木瓜蛋白酶[50 U/mL]（-20 °C保存，仅允许解冻一次）。
- 配制1×磷酸盐缓冲液（PBS，室温保存）。
- 为附属腺体的物理解离准备多个经火焰拉圆的移液器吸头。
注意：处理附属腺体时应使用低吸附吸头，因为组织容易黏附于未经处理的塑料表面。火焰拉圆可缩小吸头开口并使边缘更光滑，从而在肽酶消化后实现有效解离，同时避免细胞膜剪切损伤。- 用锋利刀片切下一支200 µL吸头，并轻轻在火焰上过火，使其尖端变圆，开口更宽且光滑，便于步骤3.7中的操作。
- 将多个1,000 µL吸头的开口在火焰附近快速通过不到一秒，以缩小其开口。轻微旋转吸头以避免过度熔化或堵塞。根据开口由窄到宽进行分类，可通过测定吸液速度来区分。建议先用少量附属腺组织测试最窄吸头的解离效率。
注意：这些吸头对机械振荡（步骤5.2和5.3）至关重要。高质量的火焰拉圆吸头可在保持细胞活力的同时实现完全解离。因此，每次实验结束后需用清水彻底清洗这些吸头以便重复使用，从而确保每日实验间解离效果的可重复性。
3. 附属腺体的解剖
- 将20至25只雄性Drosophila放入玻璃培养皿中，置于冰上。
- 在SSM溶液中解剖1只雄蝇，取出其生殖道，并将副腺成对分离，仅保留射精管，去除其他所有组织。
注意：需去除睾丸，因为释放的精子可能形成团块，干扰解离过程；同时去除射精囊，因其漂浮会增加操作难度。 - 用镊子将副腺转移至室温下盛有SSM溶液的玻璃平皿中。重复步骤3.2–3.3共20次，以获得一批20对副腺置于SSM中。
注意：这些步骤应在15至20分钟内完成。副腺应呈现健康状态，且可见腺体周围肌层的蠕动。可使用荧光显微镜监测GFP表达。 - 将副腺转移至1×PBS中，在室温下洗涤1–2分钟。
注意：为获得更好的解离效果，必须用PBS冲洗副腺。但此步骤时间应尽量缩短，因细胞在PBS中会出现应激反应；解离后的次级细胞在PBS中会迅速肿胀并死亡。 - 将20 µL木瓜蛋白酶[50 U/mL]加入180 µL的1×胰蛋白酶溶液中，配制成解离液（按比例放大或缩小：每只雄蝇使用9 µL胰蛋白酶和1 µL木瓜蛋白酶）。用镊子将副腺转移至该溶液中。
- 将副腺远端（含次级细胞）与近端部分分离。使用精细镊子牢固夹住腺叶中部，并用第二把镊子的尖端将其切断。去除副腺的近端部分及射精管，以提高解离效率并减少细胞分选时间。
注意：从20对副腺中分离远端部分约需15至20分钟，肽酶消化过程因此将在室温下开始。 - 完成所有腺体尖端的解剖后，使用步骤2.2.1中准备的特制200 µL移液枪头，将腺体尖端转移至1.5 mL离心管中。枪头应宽口、圆润，并在操作前润湿。
注意：吸取副腺组织时，枪头必须预先用适当溶液（胰蛋白酶溶液或SSM）润湿（为此目的，各准备一管上述溶液）。每次更换样本前应仔细冲洗枪头，避免交叉污染。
4. 组织消化
- 将微量离心管置于37 °C摇床中，以1,000 rpm振荡60分钟。
注意：振荡和消化时间对于成功解离至关重要。若消化时间过短或无振荡，解离效果将较差，可能是因为外层肌肉组织和内部黏稠的精液会保护副腺细胞，使其免受蛋白酶的降解作用。 - 加入1 mL室温SSM溶液以终止消化反应，并立即进行步骤5。
5. 细胞的机械解离
- 使用宽头圆润的 1,000 µL 枪头，先用 SSM 预润湿，然后将样品转移至 24 孔板中。在显微镜下观察 GFP 荧光：大多数腺体尖端应保持完整，仅有少量 SC 脱落。
- 使用在步骤 2.2.2 中制备的细圆枪头，上下吹打 3 至 5 次，以破坏附腺组织。
注意：通过观察荧光确认大块组织已被充分打散。若未达到此效果，请重复步骤 5.2。 - 使用极细的圆头枪头（在步骤 2.2.2 中制备），上下吹打 1–2 次。
注意：步骤 5.3 后应仅可见单个细胞。推荐使用 24 孔板，因其便于过程的直观监控。当处理少量样本并获得满意结果（形态健康且完全解离的次级细胞）后，后续吹打操作可在微量离心管中进行。 - 静置至少 15 分钟，使细胞沉降至孔底，并吸除多余 SSM，以缩短分选时间。
注意：实践表明，细胞自然沉降优于离心等其他方法，且可在流式细胞分选（FACS）前进行最后一次细胞形态的目视检查。 - 将细胞吹打转移至洁净的 1.5 mL 离心管中，并将相同条件的样本合并（每组条件合并两批共 20 只雄性果蝇的样本）。用少量 SSM 冲洗孔内残留细胞，并将其收集至同一离心管中。
- 在 1.5 mL 离心管中加入 300 µL 细胞裂解液和 1 µL 蛋白酶 K [50 µg/µL]（试剂来自 RNA 纯化试剂盒，见步骤 7）。每个样本准备两管（分别用于 MCs 和 SCs）。
6. FACS（荧光激活细胞分选）
- 分选前数分钟向每个待分选样品中加入活力标记物（0.3 mM Draq7）。
注意：Draq7 应谨慎操作。 - 分选一类均一的活体次级细胞群体（GFP 阳性、Draq7 阴性细胞）。另取一个微量离心管，分选一类主细胞群体（体积较小、GFP 阴性、Draq7 阴性细胞）。采用以下 FACS 分选门控策略：
注意：将细胞分选仪压力设置为 25 PSI，并使细胞通过 100 µm 喷嘴。分选速率约为 2,000 个细胞/秒。- 根据 FSC-SSC（图 2E）排除碎片并选择总细胞，以去除碎片。
- 排除死细胞。使用 640 nm 激光激发 Draq7，并通过 795/70 带通滤光片收集发射荧光。圈选并排除 Draq7 阳性细胞（图 2F）。
- 利用 SSC-H 对 SSC-W 和 FSC-A 对 FSC-H 的双门控方法去除双联体（图 2H）。
注意：应严格通过双门控排除细胞双联体，以减少主细胞污染。 - 将约 550 个 GFP 阳性细胞分选至含有裂解缓冲液和蛋白酶 K 的 1.5 mL 微量离心管中。该细胞群体被视为次级细胞（SC，图 2G）。在 488 nm 激发 GFP，并通过 526/52 带通滤光片收集发射荧光。
- 将约 1,000 个体积均一且较小的 GFP 阴性细胞分选至含有裂解缓冲液和蛋白酶 K 的 1.5 mL 微量离心管中。该细胞群体被视为主细胞（MC，图 2G）。
- 涡旋震荡所有样品。
注意：从约 40 只雄性个体（~40 × 80 SC = 3,200 个次级细胞）中可获得 600 至 800 个活的单细胞次级细胞（回收率约为 20–25%）。为使样品标准化，分选至约 550 个 SC 和 1,000 个 MC 时停止。
7. RNA 提取
注意：我们使用Epicentre MasterPure RNA纯化试剂盒进行RNA提取，并进行了以下调整。只要产量足够从约500个细胞中制备测序文库（本实验中使用了2 ng RNA），也可使用其他试剂盒。
- 在 65 °C 下加热样品 15 分钟，并每 5 分钟涡旋一次，以完成细胞裂解。
- 将样品置于冰上 5 分钟。按照制造商的建议进行核酸沉淀操作（参见部分 "Precipitation of Total Nucleic Acids" 和 "Removal of Contaminating DNA from Total Nucleic Acid Preparations"）。
- 将 RNA 沉淀重悬于 10 µL 无 RNase 的 TE 缓冲液中。
- 加入 RNase 抑制剂（可选）。
- 在 -80 °C 下保存样品。
8. RNA 数量、质量和特异性的质量控制
- 评估RNA的质量和浓度。由于体积和浓度较小，此处使用RNA 6000 Pico芯片。高质量RNA的特征为未降解，表现为基线较低，并出现对应于rRNA的清晰峰形。
- 通过RT-qPCR验证分选细胞的身份
- 使用随机六聚体作为引物，对2 ng总RNA进行逆转录。对次要细胞RNA和主要细胞RNA均进行逆转录。
注意：cDNA可稀释、分装后冻存，供后续使用。 - 采用合适的引物对，通过实时定量PCR检测管家基因（alpha-Tubulin, 18S rRNA）、次要细胞特异性基因（MSA, Rab19, Abd-B）以及主要细胞特异性基因（Sex peptide）的表达水平。
- 使用随机六聚体作为引物，对2 ng总RNA进行逆转录。对次要细胞RNA和主要细胞RNA均进行逆转录。
9. 测序（cDNA文库构建、测序与数据分析）
- 使用 2 ng 总 RNA，以 polydT 引物合成 cDNA，并采用 SMARTer 技术进行扩增。
- 使用 Nextera XT 试剂盒构建文库。
- 采用多重单端 100 个核苷酸读长测序（尽管大多数情况下 50 个核苷酸读长已足够），每个样本获得约 3000 万条读段。
10. 数据分析
- 运行 FastQC。
- 使用 STAR 比对工具将测序读段比对至 UCSC dm6 黑腹果蝇参考基因组，并生成 .bam 文件。使用 Integrative Genomics Viewer (IGV) 在基因组浏览器中可视化读段。
- 使用 HTSeq 进行基因计数。
- 采用修剪均值 M 值法（Trimmed Mean of M-values, TMM）对基因计数进行标准化22。使用 edgeR 进行差异表达的统计分析、MA 图绘制和主成分分析（PCA）。
- 进行基因表达分析和统计时，采用广义线性模型，结合假阳性发现率（False Detection Rate, FDR）的似然比 F 检验及 Benjamini & Hochberg 校正法（BH）。
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结果
本方案使一位实验人员能够在一天内完成从Drosophila雄性附腺中分离次级细胞并提取其RNA的操作（图1）。
我们使用 Abd-B-GAL4 构建18 标记次级细胞（SC）而不标记主细胞（MC）的GFP（图2A）。本实验的一个目的是获得精原细胞（SC）的野生型转录组（“野生型”加引号是因为这些细胞来源于表达GFP和GAL4的转基因果蝇）。另一个目的是通过一种快速简便的方法获取SC的RNA，以便在不同条件下研究其基因表达。因此，我们使用野生型和“iab-6cocuD1携带一个1.1 kb缺失以移除增强子的突变体 Abd-B 负责SC表达。该缺失还移除了启动子 <...
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讨论
已有文献描述了从Drosophila组织（如成虫盘）中解离细胞的方法23。我们尝试直接将这些方法应用于副腺组织时未能成功，因此促使我们开发了本新方案。蛋白酶消化和机械吹打是本方案成功的关键步骤，我们在第2至第5节中添加了大量注释，以帮助实验人员获得满意的结果。为了实现有效解离，蛋白酶必须能够接触到副腺细胞，而这些细胞受到腺腔内黏稠精液以及腺体周围肌层的保护。因此，解剖腺体远端部分至关重要（步骤3.6）。此外，使用剧烈振荡进行至少60分钟的消化（步骤4.1）也是必要的。使用胰蛋白酶溶液（例如TrypLE）进行温和消化，可在机械解离前保持腺体完整性和细胞活力。在胰蛋白酶溶液中添加木瓜蛋白酶（papain）或胶原酶（collagenase）可改善解离效果（使用更少的吹打次数即可实现完全解离，从而提高细胞存活率）。然而，这些酶单独使用均不足以实现充分的细胞解离。在第2.2.2部分中制备的圆口细尖移液枪头是本方法的关键环节。因此，应通过小规模预实验优化吹打操作（步骤5.2–5.3），以选择最佳的枪头组合（参见步骤5.3中的注释）。
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致谢
我们感谢Karch实验室的成员、iGE3基因组学平台、日内瓦大学流式细胞术核心设施，以及Jean-Pierre Aubry-Lachainaye博士，他建立了FACS实验方案。感谢Luca Stickley在IGV中可视化测序读长方面的帮助。感谢我们自己慷慨允许重复使用图表，也感谢编辑们促使我们在写作中发挥创造力。
本研究由日内瓦州（CI、RKM、FK）、瑞士国家科学基金会（www.snf.ch）（FK 和 RKM）以及克拉拉兹基金会的捐赠资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔组织培养板 | VWR | 734-2325 | |
| 解剖用双目显微镜 | |||
| 带GFP光源的双目显微镜 | |||
| 本生灯 | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| 1.5 mL塑料微量离心管 | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| 精细解剖镊 | |||
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | 使用前需热灭活 |
| 解剖用玻璃培养皿 | |||
| 冰桶 | |||
| ImProm-II反转录系统 | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA纯化试剂盒 | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT试剂盒 | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000移液器 | Gilson | ||
| P20移液器 | Gilson | ||
| P200移液器 | Gilson | ||
| 木瓜蛋白酶 | 50U/mL储备液 | ||
| PBS | 自行配制 | ||
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070-063 | |
| polydT引物 | |||
| 随机六聚体引物 | |||
| RNA 6000 Pico试剂盒 | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila培养基 | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA合成试剂盒 | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| CFX用SYBR Select Master Mix | applied biosystems | 4472942 | |
| 恒温振荡器 | 杭州艾本森仪器 | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL刻度吸头 | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL斜面吸头 | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express酶 | Gibco | 12604013 | |
| 涡旋振荡器 |
参考文献
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