一种用于胶原诱导性关节炎模型中小鼠足爪组织炎症分子通路分析的冷冻研磨处理方案

摘要

开发了一种使用液氮冷冻研磨机处理小鼠足爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的得率和质量，并实现对与炎症反应相关的分子谱的分析。

摘要

对局部组织中的分子变化进行分析对于理解治疗候选物在体内的作用机制至关重要。在关节炎研究领域，许多研究集中于炎症关节，这些关节由骨、软骨、肌肉、基质细胞和免疫细胞等复杂混合物构成。本文中，我们建立了一种可靠且稳健的机械方法，在低温控制环境下将炎症小鼠足爪破碎成均一的粉末样品。随后制备蛋白质和RNA裂解物，以实现蛋白质组学和转录组学检测，并对局部组织中相关疾病通路进行分子表征。

引言

类风湿关节炎（RA）是一种慢性全身性炎症性疾病，其特征是关节出现持续性对称性滑膜炎，并伴有皮肤、心脏、肺和眼睛等关节外器官受累¹。尽管在人类患者中免疫反应的全身表现显而易见，但RA病理学的一个重要特征是免疫细胞浸润滑膜组织以及滑膜成纤维细胞的增殖²。

与人类类风湿关节炎（RA）相似，小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型可引发明显的组织炎症，表现为滑膜组织及全身各部位的活跃免疫应答。不同小鼠品系对CIA模型的易感性与主要组织相容性复合体（MHC）单倍型以及抗原特异性T细胞和B细胞的相互作用相关^3,4。此外，人类RA中的多种致病通路，包括自身抗体产生、免疫复合物沉积、髓系细胞活化、多关节受累以及伴有滑膜免疫细胞浸润的血管翳形成，在该模型中也均能观察到^5,6。研究人员已利用这一成熟的CIA模型来研究抗炎性细胞因子治疗的效果⁷。许多已获批用于自身免疫性疾病或炎症性疾病的生物制剂，如抗TNFα和抗IL-6，在CIA模型中也被证实具有疗效^8,9。

分析免疫系统在滑膜组织中的相互作用对于阐明与类风湿关节炎（RA）发病机制相关的分子机制至关重要。在人类临床实践中，通常在超声成像引导下进行针刺滑膜活检。而在临床前研究中，由于小鼠关节结构较小，使得活检操作极为困难甚至无法实施。近期，我们已证明可利用小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型来评估多种药物组合对不同终点指标的影响，并通过联合干预策略实现疾病缓解¹⁰。本研究采用基于低温冷冻研磨机的粉碎方法，将发炎的小鼠足爪组织处理成均一的细粉，并建立了下游的RNA和蛋白质提取流程。该方法可有效保护RNA和蛋白质免受酶解和化学降解，使我们能够对同一均质化样本来源应用多种分析技术。

方案

所有动物实验均按照强生公司机构动物照护与使用委员会（IACUC）的政策进行。&D.

1. 基于低温冷冻研磨机的粉碎方法

1. 在CIA研究结束时，使用1.5%异氟烷麻醉小鼠后实施颈椎脱位处死。
2. 组织处理当天，将所有器械（刮匙、研磨管等）置于干冰上预冷至少10分钟。佩戴防冻手套以避免冻伤。
3. 用剪刀在毛发分界线处剪下后肢足部，如图1A所示。
4. 将每只足部立即转移至一个1.5 mL微量离心管中，迅速在液氮中速冻，并将冷冻的足部储存在-80 °C。样品冷冻保存时间不得超过一周。
5. 按照图1B所示，向冷冻研磨机中加入液氮，并使其平衡至少10分钟。
6. 未处理的样品应始终保持在干冰上，避免经历冻融循环。
7. 将一只后肢足部转移至已预冷的大型聚碳酸酯研磨管中（底部配有钢制塞），插入已预冷的钢制撞击子，并用已预冷的顶部钢制塞封闭聚碳酸酯研磨管（图1C）。
8. 将装有样品的大型聚碳酸酯研磨管转移至已充满液氮的冷冻研磨机中，并使用仪器前端的橡胶夹扣关闭盖子。
9. 让样品在液氮中冷却1分钟。
10. 将冷冻研磨机设置为每秒10个循环、持续1分钟的程序，按下启动按钮。等待设备完成整个研磨周期。
    注意： 机器运行时钢制撞击子来回运动会产生敲击声。请使用耳塞以防止听力损伤。
11. 打开冷冻研磨机盖子，取出大型聚碳酸酯研磨管，按图1D所示将其放入提取装置中。通过向下按压黑色手柄，直至钢制塞从聚碳酸酯管中滑出，从而移除顶部钢制塞。
12. 将打开的大型聚碳酸酯研磨管放回干冰上。使用已预冷的镊子取出钢制撞击子。
13. 将冷冻粉末转移至已预冷的50 mL锥形管中。
14. 称取30–50 mg冷冻粉末至已预冷并去皮的1.5 mL微量离心管中用于RNA提取，另称取100–200 mg冷冻粉末用于蛋白质提取。
    注意： 冷冻粉末应呈白色或淡粉色细沙状，如图1E所示。
15. 将粉碎后的样品储存在-80 °C，并在24小时内进行RNA和蛋白质的提取。

2. RNA 提取

1. 每 1 mL RLT 缓冲液中加入 10 µL β-巯基乙醇（β-ME）。
2. 根据组织量计算所需 RLT 缓冲液体积，比例为 23.3 mL/mg，并将相应体积的含 β-ME 的 RLT 缓冲液加入装有冷冻粉末的离心管中。该比例经实验确定为小鼠足部组织的最佳比例。
3. 将样品在 3,000 RPM 条件下涡旋振荡 10 秒。
4. 使用 1 mL 移液器剧烈吹打 10 次，充分混匀。
5. 再次将样品在 3,000 RPM 条件下涡旋振荡 20 秒。
6. 在 13,000 × g 条件下离心 2 分钟。
7. 将 700 µL 上清液转移至新的离心管中，并加入 700 µL 70% 乙醇。
   注意：如果管中上清液体积 <700 µL，仍可继续实验，加入等体积的 70% 乙醇即可。
8. 将 700 µL 样品加载至 RNA 纯化柱中。
9. 在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。
10. 弃去穿流液，将剩余样品继续加载至 RNeasy 柱中。
11. 在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。
12. 弃去穿流液，加入 700 µL RW1 缓冲液洗涤柱子，并在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。 若进行 DNASE 消化步骤，则在 DNASE 处理前加入 350 µL RW1 缓冲液。 DNASE 处理后，再额外加入 350 µL RW1 缓冲液。
13. 可选）按照试剂盒制造商说明书进行 DNase 消化步骤。
14. 每次加入 500 µL RPE 缓冲液，重复洗涤两次，每次均在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒，每次均弃去穿流液。
15. 在 ≥10,000 × g 条件下离心 2 分钟，干燥柱子。
16. 加入 50 µL 水进行洗脱，在 ≥10,000 × g 条件下离心 2 分钟。收集穿流液并转移至新的 1.5 mL 离心管中。
17. 使用研究者选定的方法测定 RNA 含量，并于 -80 °C 保存，以备后续分析。

3. 蛋白质提取

1. 使用细胞培养级水将10倍浓度的细胞裂解储存液稀释为1倍浓度的细胞裂解储存液。
2. 加入1 mL水重悬蛋白酶抑制剂混合物集I，配制成100倍浓度的蛋白酶抑制剂储存液。
3. 将100 µL蛋白酶抑制剂加入9.9 mL的1倍细胞裂解液中，配制成终浓度为1倍的储存溶液。
4. 每毫克组织粉末加入4 µL预冷的1倍细胞裂解缓冲液（例如，向200 mg组织粉末中加入800 µL裂解缓冲液）。
5. 向离心管中加入一颗5 mm不锈钢珠。
6. 以3,000 RPM涡旋震荡管子60秒。随后将管子转移至湿冰上，并继续处理下一个样品。
7. 将所有样品管放入一个盒子中，置于摇床上以1,000 RPM在4 °C条件下震荡1小时。 
   注意： 研究人员可能会发现将盒子垂直放置有助于钢珠更有效地混合样品。
8. 在4 °C条件下以10,000 x g 离心15分钟。
9. 将上清液转移至新的离心管中，避免接触顶部的脂肪层。
10. 测定总蛋白浓度。进行10至30倍稀释的蛋白裂解液适用于BCA检测。
11. 将样品分装至1.5 mL微量离心管中，在进一步分析前于-80 °C保存。

结果

此处，我们在图2A中展示了从CIA小鼠前爪提取RNA的代表性凝胶图像。28S rRNA与18S rRNA条带表明所有样本均含有足量的完整RNA。接下来，在图2B中展示了基于BCA蛋白分析法测定的总蛋白浓度的代表性散点图。来自未免疫小鼠、CIA小鼠或接受不同治疗的CIA小鼠的总蛋白浓度在各组间具有可比性。为确定蛋白提取物中炎症性细胞因子和趋化因子的浓度，进行了Luminex分析。我们在图2C中展示了经标准化后细胞因子和趋化因子浓度（pg/mg总蛋白）的代表性散点图。与未免疫小鼠相比，CIA小鼠中多种细胞因子水平升高，而抗IL-17A抗体治疗显著抑制了多种细胞因子的产生。为评估CIA模型及治疗相关效应中的转录组变化，进行了微阵列分析。我们在图2

讨论

尽管从科学角度有必要在滑膜组织中评估分子通路，但目前许多关于小鼠CIA模型免疫谱型的研究主要集中在外周血，而对炎症足爪的蛋白质和RNA分析数据则相对有限。造成这种偏向的原因可能有多个：小鼠踝关节直径不超过约2 cm；病变区域包含皮肤、骨骼和结缔组织，这些组织通常难以通过传统方法（如组织研磨器、研钵研杵、二氧化硅珠破碎、吹打裂解或酶消化）充分均质化。这些方法通常会导致组织破碎不完全、蛋白质或RNA得率低，或因蛋白水解和核酸降解而导致质量不一致。本文所述的可靠方法提供了一套详细操作流程，可将组织制备成均一的冷冻粉末，从而支持后续的蛋白质组学和转录组学分析，实现从单一且均一的样本来源建立疾病的分子特征谱。

进行该方法时应考虑几个关键步骤。首先，在组织采集过程中应沿毛发线剪下小鼠足部，并避免带有大量毛发。过多的毛发可能在RNA提取过程中堵塞层析柱，并干扰蛋白质提取。其次，整个操作过程中，离心管、镊子和刮勺应始终保持在干冰上，因为组织粉末温度升高会迅速导致材料变为无定形状态 "泥" 蛋白质和RNA的完整性将受到影响。第三，用于蛋白质或RNA提取的组织粉末用量应经过仔细优化。增...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm 不锈钢珠	Qiagen	69989
β-巯基乙醇	Sigma	M6250	抑制RNASE酶的样品还原剂
Bioanalyzer 试剂盒	Agilent	5067-1511	RNA 质量评估试剂盒
β-巯基乙醇	Sigma	M6250
细胞培养级水	Corning	25-055-CI	水
细胞裂解储存液	Cell Signaling	9803
Eppendorf 管	Eppendorf	22363204	微量离心管
Eppendorf 管离心盒	Nalgene	5055	用于水平放置 Eppendorf 管的离心盒
Everlast 247 可调速摇床	Benchmark Scientific	BR5000
冷冻研磨仪	Spex Sample Prep	6875	用于将足部组织研磨成粉末的冷冻研磨仪
研磨管	Spex Sample Prep	6801	用于将足部组织研磨成粉末的聚碳酸酯管
Pierce BCA 试剂盒	Pierce	23225	总蛋白定量试剂盒
蛋白酶抑制剂混合物套装 1	Calbiochem	539131	蛋白酶抑制剂
蛋白 BCA 试剂盒	Pierce	23225
Quantigene 试剂盒	Thermofisher	QP1013	bDNA 分析试剂盒
制冷型微量离心机	Eppendorf	5417R	离心
RLT 缓冲液	Qiagen	79216	RNA 提取缓冲液
RNeasy 小量试剂盒	Qiagen	74104	包含 RNeasy 柱、RLT 缓冲液和 RW1 缓冲液
摇床	Benchmark Scientific	BR5000	摇床/振荡器
刮勺	VWR	10806-412	用于粉末转移的刮勺
不锈钢珠	Qiagen	69989	蛋白提取过程中用于混匀的珠子
管盖提取器	Spex Sample Prep	6884	用于取下研磨管盖的提取工具
涡旋振荡器	VWR	10153-838	样品混匀