Drosophila melanogaster 中血脑屏障完整性的检测方法

Matthew J. Davis; Danielle Talbot; Jennifer Jemc

doi:10.3791/60233

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Drosophila melanogaster 中血脑屏障完整性的检测方法

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DOI：

10.3791/60233

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2019年9月18日

Matthew J. Davis¹ , Danielle Talbot¹ , Jennifer Jemc¹

¹Department of Biology, Loyola University Chicago

本文内容

摘要

血脑屏障的完整性对神经系统功能至关重要。Drosophila melanogaster 的血脑屏障在胚胎发育晚期由胶质细胞形成。本方案描述了检测 D. melanogaster 胚胎及三龄幼虫中血脑屏障形成与维持的方法。

摘要

神经系统正常发育包括血脑屏障的形成，该屏障是一种扩散屏障，可严格调控对神经系统的通透性，保护神经组织免受毒素和病原体侵害。血脑屏障形成缺陷已被证实与神经病变相关，且该屏障的破坏在多种神经退行性疾病中均有观察到。因此，明确调控血脑屏障形成与维持的关键基因，对于识别潜在治疗靶点至关重要。为了深入理解这些基因在神经发育过程中的确切作用，有必要检测基因表达改变对血脑屏障完整性的具体影响。许多参与血脑屏障建立的分子在真核生物物种间具有高度保守性，其中包括模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。果蝇已被证明是研究调控神经系统发育与功能的分子机制的优良模型系统。本实验方案详细描述了在黑腹果蝇（D. melanogaster）胚胎期和幼虫期检测血脑屏障完整性的逐步操作流程。

引言

在发育过程中，细胞间的通讯与相互作用对于组织和器官结构及功能的建立至关重要。在某些情况下，这些细胞间相互作用会将器官与周围环境隔离开来，以确保器官正常发挥功能。神经系统即属于此类情况，其功能依赖于血脑屏障（BBB）的绝缘作用。人类血脑屏障功能障碍已被证实与癫痫等神经系统疾病相关，且在多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病中均观察到该屏障的破坏¹。在哺乳动物中，血脑屏障由内皮细胞之间的紧密连接构成²^,³。其他动物，如果蝇（Drosophila melanogaster），其血脑屏障则由胶质细胞组成。这些胶质细胞形成一种选择性通透的屏障，用以调控营养物质、代谢废物、毒素以及大分子物质进出神经系统的运输⁴。这有助于维持产生动作电位所必需的电化学梯度，从而实现机体的运动与协调功能⁴。在D. melanogaster中，胶质细胞可保护神经系统免受富含钾离子、类似血液的血淋巴的侵害⁵。

在黑腹果蝇（D. melanogaster）的中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）中，两层外周胶质细胞——围膜下胶质细胞（subperineurial glia）和神经鞘膜胶质细胞（perineurial glia），以及一层位于外部的细胞外基质网络——神经鞘膜（neural lamella），共同构成了血淋巴-脑屏障和血淋巴-神经屏障⁶，本文中统称为血脑屏障（BBB）。在发育过程中，围膜下胶质细胞会变为多倍体并增大，以包裹整个神经系统⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。围膜下胶质细胞形成隔膜样连接（septate junctions），构成血淋巴与神经系统之间主要的扩散屏障⁵^,⁶^,¹²。这些连接在分子结构上与脊椎动物有髓鞘胶质细胞 paranode 区域的隔膜样连接相似，并在功能上等同于哺乳动物血脑屏障中的紧密连接（tight junctions）¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷。神经鞘膜胶质细胞通过分裂、生长并包裹在围膜下胶质细胞外层，调控代谢物和大分子物质的扩散⁶^,¹⁰^,¹⁸^,¹⁹。在25 °C条件下，血脑屏障的形成在产卵后18.5小时（AEL）完成⁵^,⁸。先前的研究已鉴定出若干对血脑屏障形成起关键调控作用的基因²⁰^,²¹^,²²。为了更深入理解这些基因的确切功能，有必要研究这些潜在调控因子发生突变后对血脑屏障完整性的具体影响。尽管已有研究概述了在胚胎和幼虫阶段检测血脑屏障完整性的方法，但目前尚无一套完整的实验操作流程被系统描述⁵^,⁷。本逐步操作方案详细介绍了在黑腹果蝇（D. melanogaster）胚胎期及三龄幼虫期检测血脑屏障完整性的实验方法。

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方案

1. 样品采集

胚胎收集
1. 在每个胚胎收集笼中，使用至少50只处女雌蝇和20−25只雄蝇进行收集。在开始收集前，将这些果蝇置于装有玉米粉-琼脂培养基（材料表）的瓶子中，在25 °C下培养1−2天²³。
  注意：可以使用更多的果蝇，但雌雄比例应保持在2:1。
2. 将苹果汁琼脂平板（表1）在25 °C下预热过夜。
  注意：此步骤对于胚胎的准确分期是必需的。如果平板干燥过快，可在培养箱中放置盛水的容器以提高环境湿度。
3. 用CO₂麻醉步骤1.1.1中的果蝇，并将其转移至收集笼中。在笼子开口端放置一个预热的苹果汁琼脂平板，并在平板上涂抹少量酵母糊，然后用红色套筒（材料表）固定。为清除较老的胚胎，让果蝇在25 °C下于苹果汁琼脂平板上产卵1小时。
4. 将收集笼从培养箱中取出，将笼网朝下倒置，并轻敲使果蝇落入笼底。更换新的预热苹果汁琼脂平板（涂有少量酵母糊），并丢弃第一个平板。
5. 让果蝇在新的苹果汁琼脂平板上于25 °C下产卵1小时。收集结束后丢弃该平板，并进入下一步以获取用于显微注射的胚胎。
6. 为收集晚期17阶段胚胎（20−21小时龄，AEL），让具有目标基因型的果蝇（来自步骤1.1.1−1.1.5）在25 °C下于新的预热苹果汁琼脂平板（涂有少量酵母糊）上产卵1小时。随后将平板置于25 °C培养箱中继续发育19小时，使胚胎在成像时达到20−21小时龄。
  注意：可根据需要重复此步骤，进行多轮样本收集、注射和成像。
7. 将平板上的胚胎用磷酸盐缓冲液（含0.1%非离子型表面活性剂，PBTx；表1）冲洗，借助毛笔松动胚胎表面，然后收集至带有70 μm尼龙滤网的细胞筛中。
8. 将收集在细胞筛中的胚胎转移至100 mm培养皿中，用50%次氯酸钠溶液（表1）在室温下脱膜5分钟，期间偶尔轻轻晃动。每次使用新鲜PBTx溶液，在培养皿中轻轻旋转细胞筛，用PBTx清洗胚胎3次。
9. 若所有胚胎均为正确基因型，则直接进入步骤1.1.10。若需通过与杂合子果蝇杂交来获得目标基因型胚胎，则需根据荧光标记的平衡染色体是否存在来筛选正确基因型的胚胎。使用具备荧光功能的体视显微镜进行基因型筛选。
  注意：使用带有Deformed-黄色荧光蛋白；Kruppel-Gal4, UAS-绿色荧光蛋白（GFP）；以及twist-Gal4, UAS-GFP标记的平衡染色体，在晚期胚胎发育阶段进行基因型筛选效果良好（表2）²⁴^,²⁵^,²⁶。
10. 使用玻璃移液管将PBTx中的胚胎转移至2%琼脂糖凝胶板（表1）上。用滤纸吸去多余液体。将约6−8个胚胎排列在2%琼脂糖凝胶板上，使胚胎后端朝右，背侧向上（图1B）。
  注意：精孔是精子进入卵子的小孔，位于胚胎前端；后端较为圆钝。气管呈白色，位于胚胎背侧，可用于区分胚胎的背腹面（图1B）。
11. 准备一张载玻片，在其上贴一段双面胶带。将载玻片用力压在胚胎上，使胚胎粘附到双面胶带上。
12. 在室温下孵育约25分钟以干燥胚胎（不使用干燥剂）。干燥后，用卤代烃油覆盖胚胎。
  注意：干燥时间可能因环境温度、湿度和通风情况而异。建议利用此孵育时间准备显微注射装置和共聚焦显微镜，具体操作见本方案第2和第3节。
幼虫收集
1. 将5−10只具有目标基因型的处女雌蝇与同等数量一半的同基因型雄蝇放入装有玉米粉-琼脂培养基的小管中，在25 °C下培养²³。
2. 根据基因型不同，在5−7天后，用镊子轻轻从管壁上收集爬行的三龄幼虫。用1× PBS冲洗幼虫以去除附着的食物残渣。如有必要，将幼虫转移至苹果汁琼脂平板上，按照步骤1.1.9所述方法进行基因型鉴定。
3. 用毛笔将幼虫在纸巾上轻轻滚动以吸干表面水分。用镊子将6−8只幼虫转移至预先贴有双面胶带的载玻片上。

2. 针头制备与样本注射

在启动本方案之前，使用微移液管拉制仪制备玻璃针。将毛细管固定在拉针仪上，并根据果蝇（D. melanogaster）注射的标准针头形状和参数（表3）进行拉制²⁷。将制备好的针头用黏土固定，存放于培养皿中，待注射时使用。
在胚胎干燥25分钟期间（步骤1.1.12），或在将幼虫转移至载玻片后立即（步骤1.2.3），使用20 μL凝胶上样枪头，向针头中装载5 μL的10 kDa磺酰罗丹明101酸氯化物标记的葡聚糖（材料表）。
将装载好的针头插入针头夹持器，并安装至固定在钢制底座上的显微操作仪上（材料表）。
注意：进行胚胎注射时，针头应几乎与显微镜载物台平行；进行幼虫注射时，针头应略微向下倾斜。
将注射装置（材料表）设置为50 psi，脉冲时间为5−10 ms，范围设为10。
注意：根据所使用的具体注射装置，可能需要调整这些参数。
将载玻片置于载物台上，以45°角将针尖轻轻触碰双面胶带边缘，形成具有倾斜角度的断裂尖端。
注意：对于胚胎注射，仅需轻微断裂针尖，以允许10 kDa葡聚糖溶液流出即可。理想的针头应具有轻微倾斜的尖端，每次注射仅流出少量染料。对于幼虫注射，需更大幅度断裂针尖，但仍需保持倾斜角度，以便穿透幼虫体壁，此时会有较大液滴流出。
踩下脚踏开关，推动染料至针尖处。
调整针头方向，使其与胚胎保持平行，或略微向下倾斜对准幼虫。
移动针头刺入样本后端，并踩下脚踏开关进行注射。向胚胎注射约2 nL染料，向幼虫注射约220 nL染料。
注意：若注射成功，胚胎或幼虫体内应迅速充满染料。
记录每一样本的注射时间，以便后续孵育。将胚胎在室温下孵育10分钟，将幼虫在室温下孵育30分钟。
沿载玻片继续注射其他样本，并记录每一样本的注射时间。
注意：根据后续解剖和成像步骤的操作速度，每次可同时注射4−8个样本。

3. 成像样品的制备

胚胎成像
1. 注射后，准备胚胎用于成像。使用棉签在载玻片上样本的左右两侧涂抹凡士林作为间隔物，以防止盖玻片压片时损伤胚胎。
2. 使用共聚焦显微镜配合20倍物镜对胚胎全深度进行成像。根据以下公式计算在腹神经索（VNC）中观察到染料的样本占总样本的百分比：血脑屏障受损样本百分比 = VNC中出现染料积累的样本数 / 检测的总样本数。
幼虫解剖与成像
1. 提前准备用于幼虫样本的载玻片。用指甲油将两个盖玻片固定在载玻片上，间隔约0.5 cm。
  注意：盖玻片作为脑组织的支撑间隔物，以确保在封片过程中不损伤脑组织。
2. 完成30分钟孵育后，在用于成像的载玻片上直接用1×PBS缓冲液解剖幼虫。首先用一对镊子夹住幼虫体中部，再用另一对镊子将幼虫的前半部与后半部分离。
3. 接着，用一对镊子夹住口钩所在的前端区域，用另一对镊子将体壁翻转至夹住口钩的镊子尖端之上，从而暴露脑和腹神经索（VNC）。
4. 通过切断神经将脑和腹神经索从体壁分离，并将体壁从载玻片上移除（图1C,D）。如需，可同时移除成虫盘组织。
5. 在样本上覆盖10 μL 80%甘油溶液，并加盖盖玻片用于成像。
6. 使用20倍物镜对神经系统组织的全深度进行成像。计算在腹神经索（VNC）中观察到染料的样本占总样本的百分比。

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结果

本文所述方法可用于在D. melanogaster胚胎和幼虫中可视化中枢神经系统（CNS）中血脑屏障（BBB）的完整性（图1）。在胚胎发育晚期BBB形成完成后，其功能是阻止大分子进入脑和腹神经索（VNC）⁵。本实验方案利用该功能来检测BBB的形成。当将10 kDa的与磺罗丹明101酸氯荧光染料偶联的葡聚糖注射到野生型（Oregon R）17晚期（20−21小时龄）胚胎中时，大分子葡聚糖被排除在VNC之外，结果符合预期（图2A）。为了展示基因突变对BBB完整性的效应，本研究使用了raw基因突变的胚胎。此前研究表明，raw基因在胚胎发育过程中调控成虫盘回缩，而近期研究发现其在胶质细胞中发挥作用，调控发育过程中VNC的形态变化²⁸。杂合的raw¹突变胚胎表现出完整的BBB，结果与...

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讨论

本方案全面描述了在黑腹果蝇（D. melanogaster）发育的晚期胚胎及三龄幼虫阶段检测血脑屏障完整性的所需步骤。已有其他文献报道了用于检测发育过程中以及成虫阶段血脑屏障完整性的类似方法⁵^,⁷^,²⁹^,³⁰。然而，材料与方法部分中的操作描述通常较为笼统，缺乏足以支持顺利实施的细节，导致研究者需要进行大量故障排查。本方案详细阐述了在胚胎和幼虫阶段检测血脑屏障完整性的具体步骤。在每个发育阶段，均有若干关键步骤必须严格遵循，以确保所检测的发育阶段准确无误，且组织结构未受破坏——这些因素均可能影响血脑屏障的完整性。为了确保这些方法的成功实施，必须对方案中的多个步骤进行优化和问题排查，以获得准确的结果。胚胎和幼虫阶段方案中的关键步骤如下所述。

既往研究报道，血脑屏障（BBB）在胚胎发育18.5小时（h AEL）时已建立...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 F. Bryan Pickett 博士和 Rodney Dale 博士提供注射设备。本研究由芝加哥洛约拉大学向 M.D.、D.T. 和 J.J. 提供的研究经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
10 kDa 磺酰罗丹明101酸氯化物（Texas Red）葡聚糖	ThermoFisher Scientific	D1863	葡聚糖应使用高压灭菌的ddH₂O稀释至25 mg/mL的浓度。
20 μL凝胶加样吸头	Eppendorf	22351656
100% 乙醇（200 proof）	Pharmco-Aaper	11000200
活性干酵母	Red Star
琼脂	Fisher Scientific	BP1423
琼脂糖	Fisher Scientific	BP160-500
空气压缩机	DeWalt	D55140
苹果汁	Mott's Natural Apple Juice
漂白剂	家用漂白剂		含1-5%次氯酸盐
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
瓶塞	Fisher Scientific	AS-277
细胞筛	BD Falcon	352350
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000	使用20倍物镜（UPlanSApo 20x/0.75）成像样品
棉签	Puritan	19-062614
双面胶带 1/2"	Scotch
Dumont镊子；型号#5；尖端尺寸0.05 × 0.01 mm	Roboz	RS-5015
果蝇培养瓶	Fisher Scientific	AS-355
果蝇培养小管	Fisher Scientific	AS-515
脚踏开关	Treadlite II	T-91-S
凝胶铸模装置	Bio-Rad	1704422
凝胶托盘	Bio-Rad	1704436
玻璃移液管	VWR	14673-010
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
砂糖			购自杂货店。
卤代烃油	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
光源	Schott	Ace I
操作器支架	World Precision Instruments	M10
显微操作仪	World Precision Instruments	KITE-R
微量移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
持针器	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea滤光片组	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	用于YFP的观察
Nightsea全适配系统，配备皇家蓝光源头	Electron Microscopy Science	SFA-RB	用于GFP的观察
画笔	Simply Simmons	Chisel Blender #6
移液器	Fisher Scientific	13-683C
气动泵	World Precision Instruments	PV830	该设备也称为微注射仪或压力调节器。由于本研究中使用的型号已不再供应，此为一种替代方案。
氯化钾	Fisher Scientific	BP366-500
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP363-500
小型胚胎收集笼	Genesee Scientific	59-100
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
无水磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500
钢制底板	World Precision Instruments	5052
体视显微镜	Carl Zeiss	Stemi 2000	用于组织解剖。
配备透射光源的体视显微镜	Baytronix		用于注射操作。
Tegosept（对羟基苯甲酸甲酯）	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	非离子型表面活性剂
小管塞	Fisher Scientific	AS-273

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