造血干祖细胞代谢分析

摘要

造血干细胞祖细胞（HSPCs）在血液形成过程中由于其代谢可塑性，会从静息状态转变为分化状态。本文介绍了一种优化的检测HSPCs线粒体呼吸和糖酵解的方法。

摘要

造血干祖细胞（HSPCs）具有独特的代谢可塑性，使其能够从静息状态转变为分化状态，以满足血液生成的需求。然而，由于HSPCs数量有限，且缺乏针对非贴壁、脆弱HSPCs优化的实验方案，分析其代谢状态（线粒体呼吸和糖酵解）一直存在困难。本文提供了一套清晰、逐步的操作指南，用于检测小鼠骨髓Lineage^negSca1⁺c-Kit⁺（LSK）HSPCs的代谢呼吸（氧消耗率；OCR）和糖酵解（细胞外酸化率；ECAR）。该方案可从小鼠骨髓中获得更高数量的LSK HSPCs，提高HSPCs在孵育过程中的存活率，便于对非贴壁HSPCs进行细胞外通量分析，并提供了针对氧化磷酸化和糖酵解通路靶向药物的优化注射方案（浓度和时间）。该方法有助于预测HSPCs在血液发育及疾病过程中的代谢状态和细胞健康状况。

引言

由于大多数成熟血细胞的寿命较短，血液系统的稳态依赖于一种寿命较长但数量稀少的造血干细胞（HSPCs）的自我更新和分化能力¹。HSPCs通常处于静息状态，但在受到刺激时能够迅速增殖并启动分化，以满足血液系统的需求。由于每种HSPC细胞状态都需要独特的生物能量支持，因此代谢变化是决定HSPC命运的关键驱动因素。因此，当HSPCs在静息、自我更新和分化之间的平衡被打破，导致代谢可塑性丧失时，常引发骨髓或淋巴增殖性疾病。综上所述，深入理解代谢调控在HSPC发育过程中的作用，对于揭示血液系统恶性肿瘤的潜在机制至关重要^2,3,4,5。

线粒体呼吸和糖酵解生成 ATP，以驱动细胞内反应并产生大分子合成所需的结构单元。由于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的线粒体质量低于分化细胞⁶，且它们在低氧的骨髓微环境中维持静息状态，因此主要依赖糖酵解供能。HSPCs 的激活会增强其线粒体代谢，导致静息状态的丧失并进入细胞周期。HSPCs 的这种代谢可塑性使得 HSPC 群体能够在整个成年期得以维持^6....

方案

本方案已获全美儿童医院动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

注意：本实验方案按时间顺序描述，跨越两天时间。请使用下述方案中所述的新鲜试剂。

1. 检测前一天的试剂准备

1. 水化传感器板。
   1. 将5 mL校准液（材料表）置于无CO₂、37 °C的培养箱中孵育过夜。
   2. 打开细胞能量代谢检测套件（材料表），将传感器板（绿色；上层）与工具板（透明；下层）分离。随后将传感器板倒置，并放置在工具板旁边。
   3. 使用无菌水，向工具板的孔中加入200 µL，孔周围腔室加入400 µL。
   4. 将传感器板完全浸入工具板中，确保传感器完全被水覆盖。轻敲3次以避免气泡形成。
   5. 将浸没在工具板中的传感器板置于无CO₂、37 °C的培养箱中过夜。为防止水分蒸发，确保培养箱内保持适当湿度。在传感器板-工具板旁额外放置一个盛有H₂O的敞口烧杯作为预防措施，特别是在使用普通烘箱时。
2. 准备检测板。
   1. 使用70%乙醇对二级生物安全柜表面进行消....

结果

我们的提取方法使每只小鼠可收获约 80,000 个 LSK HSPC。由于以下原因，该方法提高了 LSK 细胞的存活率和数量：（1）联合采集上肢和下肢、髋骨、胸骨、肋骨及脊柱的骨髓；（2）避免使用红细胞裂解缓冲液，以免增加细胞死亡和细胞聚团；（3）采用密度梯度介质分离单核细胞；（4）避免使用预冷缓冲液，以防目标细胞因聚团而丢失。

尽管细胞外通量分析传统上用于贴壁细胞，但我们通过使用PLL包被孔板，随后将细胞离心接种于其上，促进了LSK造血干细胞（HSPCs）在孔板表面的贴附。这使得我们能够测量细胞外通量，从而评估LSK HSPCs的代谢状态。考虑到从小鼠中可收获的细胞数量有限，以及其分离方案耗时较长，我们采用具有8孔板格式的分析仪，已成为最具成本效益且可行的解决方案（图1）。

细胞通过糖酵解和线粒体呼吸作用来满足其能量需求，并产生增殖和生长所需的中间代谢产物¹⁹。己糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，后者随后被转化为丙.......

讨论

本文展示了如何分离出最大量的高纯度且具有活性的小鼠LSK HSPCs群体，并利用细胞外通量分析仪检测其糖酵解和线粒体呼吸功能。具体而言，该实验方案克服了LSK HSPCs应用中的以下技术难题：i）LSK HSPCs在小鼠骨髓中频率较低¹⁴；ii）LSK HSPCs的基础代谢活性较低²⁶；iii）LSK HSPCs细胞脆弱易损²⁷；以及iv）LSK HSPCs不易贴附于培养容器表面¹⁵。此外，我们还优化了药物浓度和培养基成分，以确保细胞外通量检测达到最佳性能。

骨髓来源的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）存在于低氧微环境中，表现出糖酵解表型，这对于维持其干性至关重要²⁸。相反，呼吸作用对HSPC的分化至关重要⁶。由于HSPCs的代谢功能障碍会导致血液系统疾病，本文中我们描述了用于检测小鼠骨髓来源LSK .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P8920	用于LSK细胞贴附
40 µm 细胞滤筛	Fisher Scientific	22-363-547	用于骨组织碾碎后的细胞过滤
抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads）	Miltenyi	130-090-485	用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD45R/B220单克隆抗体（克隆RA3-6B2）	BD Biosciences	553086	用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD5单克隆抗体（克隆53-7.3）	BD Biosciences	553019	用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD8a单克隆抗体（克隆53-6.7）	BD Biosciences	553029	用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠Ly-6G和Ly-6C单克隆抗体（克隆RB6-8C5）	BD Biosciences	553125	用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠TER-119/红系细胞单克隆抗体（克隆TER-119）	BD Biosciences	553672	用于Lin⁻细胞分离
CD117 (c-Kit) 单克隆抗体 (2B8), APC标记	eBioscience	17-1171-83	用于LSK细胞分选
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Falcon-Fischer Scientific	14-959-53A	用于细胞分离
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Falcon-Fischer Scientific	14-432-22	用于细胞分离
Falcon 圆底聚丙烯管	Falcon-Fischer Scientific	14-959-11A	用于LSK细胞分选
胎牛血清	Neuromics	FBS001-HI	用于FACS缓冲液配制
Histopaque-1083	Sigma	10831	用于Ficoll密度梯度分离
L-谷氨酰胺 100倍溶液	Fisher Scientific	25-030-081	用于实验培养基配制
LS柱	Miltenyi	130-042-401	用于Lin⁻细胞分离
Ly-6A/E (Sca-1) 单克隆抗体 (D7), PE-Cyanine7标记	eBioscience	25-5981-82	用于LSK细胞分选
小鼠干细胞因子（SCF）	PeproTech	250-03-100UG	用于实验培养基配制
小鼠血小板生成素（TPO）	PeproTech	315-14-100UG	用于实验培养基配制
PBS 1%	Fisher Scientific	SH3002802	用于FACS缓冲液配制
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Fisher Scientific	15140122	用于实验培养基配制
碘化丙啶	Fisher Scientific	P1304MP	用于LSK细胞分选
Seahorse XFp 细胞培养微型板	Agilent Technologies	103025-100	用于LSK细胞接种
丙酮酸钠（100 mM）	ThermoFisher	11360070	用于实验培养基配制
链霉亲和素-eFluor 450偶联物	eBioscience	48-4317-82	用于LSK细胞分选
XF校准液	Agilent Technologies	100840-000	用于检测探针盒平衡
XF培养基	Agilent Technologies	103575-100	用于实验培养基配制
XFp 糖酵解压力测试试剂盒	Agilent Technologies	103017100	用于糖酵解压力测试的药物
XFp 线粒体压力测试试剂盒	Agilent Technologies	103010100	用于线粒体压力测试的药物
XFp 传感器探针盒	Agilent Technologies	103022-100	用于糖酵解和线粒体压力测试