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方法文章

造血干祖细胞代谢分析

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DOI：

10.3791/60234

⸱

2019年11月9日

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

本文内容

摘要

造血干细胞祖细胞（HSPCs）在血液形成过程中由于其代谢可塑性，会从静息状态转变为分化状态。本文介绍了一种优化的检测HSPCs线粒体呼吸和糖酵解的方法。

摘要

造血干祖细胞（HSPCs）具有独特的代谢可塑性，使其能够从静息状态转变为分化状态，以满足血液生成的需求。然而，由于HSPCs数量有限，且缺乏针对非贴壁、脆弱HSPCs优化的实验方案，分析其代谢状态（线粒体呼吸和糖酵解）一直存在困难。本文提供了一套清晰、逐步的操作指南，用于检测小鼠骨髓LineagenegSca1+c-Kit+（LSK）HSPCs的代谢呼吸（氧消耗率；OCR）和糖酵解（细胞外酸化率；ECAR）。该方案可从小鼠骨髓中获得更高数量的LSK HSPCs，提高HSPCs在孵育过程中的存活率，便于对非贴壁HSPCs进行细胞外通量分析，并提供了针对氧化磷酸化和糖酵解通路靶向药物的优化注射方案（浓度和时间）。该方法有助于预测HSPCs在血液发育及疾病过程中的代谢状态和细胞健康状况。

引言

由于大多数成熟血细胞的寿命较短，血液系统的稳态依赖于一种寿命较长但数量稀少的造血干细胞（HSPCs）的自我更新和分化能力1。HSPCs通常处于静息状态，但在受到刺激时能够迅速增殖并启动分化，以满足血液系统的需求。由于每种HSPC细胞状态都需要独特的生物能量支持，因此代谢变化是决定HSPC命运的关键驱动因素。因此，当HSPCs在静息、自我更新和分化之间的平衡被打破，导致代谢可塑性丧失时，常引发骨髓或淋巴增殖性疾病。综上所述，深入理解代谢调控在HSPC发育过程中的作用，对于揭示血液系统恶性肿瘤的潜在机制至关重要2,3,4,5。

线粒体呼吸和糖酵解生成 ATP，以驱动细胞内反应并产生大分子合成所需的结构单元。由于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的线粒体质量低于分化细胞6，且它们在低氧的骨髓微环境中维持静息状态，因此主要依赖糖酵解供能。HSPCs 的激活会增强其线粒体代谢，导致静息状态的丧失并进入细胞周期。HSPCs 的这种代谢可塑性使得 HSPC 群体能够在整个成年期得以维持6,7,8,9,10,11,12。因此，研究其代谢活性至关重要，例如氧消耗率（OCR；氧化磷酸化的指标）和细胞外酸化率（ECAR；糖酵解的指标），以分析 HSPC 的激活状态和健康状况。OCR 和 ECAR 均可利用细胞外通量分析仪进行实时、同步测量。然而，现有方法需要大量细胞，且针对贴壁细胞进行了优化13。由于 HSPCs 无法从小鼠体内大量分离14，需要分选以获得纯群体，属于非贴壁细胞15，且无法在不诱导分化的情况下进行过夜培养16，因此对 HSPCs 的 OCR 和 ECAR 进行测量一直存在困难。本文提供了一套清晰、逐步的操作说明，配合基于视频的教程，介绍如何对数千个鼠源骨髓 LineagenegSca1+c-Kit+（LSK）HSPCs 的代谢呼吸和糖酵解进行测量。

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方案

本方案已获全美儿童医院动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

注意：本实验方案按时间顺序描述，跨越两天时间。请使用下述方案中所述的新鲜试剂。

1. 检测前一天的试剂准备

  1. 水化传感器板。
    1. 将5 mL校准液（材料表）置于无CO2、37 °C的培养箱中孵育过夜。
    2. 打开细胞能量代谢检测套件（材料表），将传感器板（绿色；上层）与工具板（透明；下层）分离。随后将传感器板倒置，并放置在工具板旁边。
    3. 使用无菌水，向工具板的孔中加入200 µL，孔周围腔室加入400 µL。
    4. 将传感器板完全浸入工具板中，确保传感器完全被水覆盖。轻敲3次以避免气泡形成。
    5. 将浸没在工具板中的传感器板置于无CO2、37 °C的培养箱中过夜。为防止水分蒸发，确保培养箱内保持适当湿度。在传感器板-工具板旁额外放置一个盛有H2O的敞口烧杯作为预防措施，特别是在使用普通烘箱时。
  2. 准备检测板。
    1. 使用70%乙醇对二级生物安全柜表面进行消毒。在生物安全柜内打开检测板。
    2. 在生物安全柜内，向检测板的每个孔中加入40 µL市售的0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。
    3. 用试剂盒提供的盖子盖上检测板。将封闭的检测板在室温（RT）下于生物安全柜内孵育1小时。
      注意：孵育的目的是使PLL包被检测板表面，以促进悬浮细胞在检测板表面的黏附。
    4. 孵育1小时后，用无菌真空吸液器吸除多余液体，并在生物安全柜内将孔晾干。
      注意：使用吸液器去除多余PLL后，晾干检测板孔大约需要30−60分钟。

2. 检测当天

  1. 准备 cartridge。
    1. 取出传感器 cartridge，将其倒置放置于组织培养罩内，并弃去 utility plate 中的水。
    2. 向 utility plate 的孔中加入 200 μL 预热的校准液。
    3. 向孔周围的腔室中加入 400 μL 校准液。
    4. 将传感器 cartridge 浸入 utility plate 中，确保传感器完全被校准液覆盖。轻敲 3 次以避免气泡形成。
    5. 将浸没在 utility plate 中的传感器 cartridge 置于不含 CO2 的 37 °C 培养箱中平衡 45−60 分钟。
  2. 分离小鼠骨髓来源的 LSK HSPCs。
    1. 为满足足够的生物学重复，计划每孔检测板使用一只小鼠来源的 HSPCs。
      注意：该骨髓采集方法每只小鼠可获得约 50,000−80,000 个 LSK HSPCs。本细胞外通量检测方案已优化为每 96 孔板每孔使用约 70,000 个 LSK HSPCs。
    2. 按照当地 IACUC 批准的方法，使用过量 CO2 和颈椎脱位法处死小鼠。
    3. 使用 70% 乙醇对解剖工具和实验台表面进行消毒。
    4. 每只小鼠预先准备一个培养皿，加入室温的含 2% 热灭活胎牛血清（FBS）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。
      注意：请勿使用预冷的 PBS，否则在后续步骤中会产生细胞团块。
    5. 用 70%（v/v）乙醇喷洒整个已处死的小鼠。从小鼠中分离所有骨骼，包括上下肢、髋骨、胸骨、肋骨和脊柱17,18。从小鼠脊髓中取出白质组织，因其可能污染 LSK 细胞。在收集过程中，将所有骨骼立即放入含 2% FBS 的 1× PBS 中，置于培养皿内备用。
    6. 将一个新的 50 mL 离心管倒置，用于在培养皿中含 1× PBS（+ 2% FBS）的液体中吹打骨骼。
    7. 使用 10 mL 移液管，在压碎骨骼后上下吹打约 10 次，均匀地将细胞从骨骼中冲洗出来。
    8. 将 40 µm 细胞筛置于 50 mL 离心管上。通过加入 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 预先润湿筛网表面。
    9. 收集步骤 2.2.7 得到的骨髓细胞悬液，通过已润湿的细胞筛，以去除骨碎片。
    10. 重复步骤 2.2.6 至 2.2.9，直至所有骨组织变为白色，表明大部分骨髓细胞已被收集至 50 mL 离心管中。
      注意：通常每只小鼠需要两个 50 mL 离心管才能收集全部骨髓来源的细胞。
    11. 将含有骨髓来源细胞的 50 mL 离心管在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。
    12. 弃去上清液。将骨髓来源的细胞（合并两个 50 mL 管中的内容物）重悬于 5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，最终体积为 5 mL，并将细胞置于室温保存。
  3. 分离单核小鼠骨髓细胞。
    1. 向 15 mL 离心管中加入 5 mL 密度梯度介质（如 Ficoll）。然后缓慢加入 5 mL 骨髓细胞悬液，确保细胞层位于密度梯度介质上方。
    2. 在室温下以 500 × g 离心 30 分钟。离心过程中不得使用刹车，并确保离心机加速度设置为最低（例如加速度为 1，减速度为 0）。
    3. 离心后，收集中间单核细胞层（白色）至新的 15 mL 离心管中。
    4. 用 5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 洗涤从密度梯度介质中收集的细胞，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    5. 重复步骤 2.3.4。
    6. 将管中细胞重悬于 300 µL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。取 10 µL 细胞悬液分装至流式管中，用于未染色或单色对照。
  4. 从小鼠骨髓单核细胞中分离 LSK HSPCs。
    1. 通过混合以下每种抗体各 3 µL（每样本）制备生物素化抗体混合液：Gr1、Cd8a、Cd5、B220、Ter119。向 300 µL 单核骨髓细胞中加入 15 µL 生物素化抗体混合液。
      注意：每种抗体的稀释比例为 1:100。
    2. 将细胞与生物素化抗体混合液在 4 °C 下避光震荡孵育 30 分钟，防止细胞在管底聚集。
    3. 向与生物素化抗体混合的细胞中加入 10 mL 预冷的含 2% FBS 的 1× PBS。
    4. 在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 400 µL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。分装 10 µL 用于链霉亲和素单色对照。
    5. 使用前短暂涡旋抗生物素微珠（材料表）。向每个细胞样本（400 µL）中加入 80 µL 微珠，充分混匀后在 4 °C 下继续震荡孵育 20 分钟。
    6. 向细胞中加入 10 mL 预冷的含 2% FBS 的 1× PBS，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。
    7. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，4 °C 保存，同时准备磁性分离装置。
    8. 将柱子（材料表）置于磁性细胞分选（MACS）分选仪的磁场中，保持 4 °C。在 4 °C 下通过重力流用 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 冲洗柱子，完成磁性分离前的准备。
    9. 将步骤 2.4.7 的细胞悬液加入已在 4 °C 预润湿的柱子中，让细胞在 4 °C 下流过柱子，并将流出液收集至 15 mL 离心管中。
      注意：流出液中未标记的细胞部分即为富集的谱系阴性细胞。
    10. 在 4 °C 下用 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 洗涤柱子，重复 3 次。收集穿流液并置于 4 °C 保存。使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数洗脱的活细胞。
    11. 将含有穿流液的 15 mL 离心管在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 0.5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，并转移至流式管中。
    12. 每 107 个细胞加入 24 µL LSK 抗体混合液。该抗体混合液包含等浓度的 450-链霉亲和素抗体、PE-CY7-Sca1 抗体和 APC-c-Kit 抗体。
    13. 在 4 °C 下避光（用锡箔纸包裹）震荡孵育 1 小时。
    14. 向流式管中加入 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    15. 将抗体标记的细胞重悬于 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。在分选前立即向细胞悬液中加入 1 µL 浓度为 1 mg/mL 的碘化丙啶（propidium iodide）。
    16. 在分选 LSK 细胞前，使用 40 µm 滤器过滤流式管中的内容物。
    17. 通过流式细胞分选（FACS）收集 LSK 细胞，分选至含有 0.5 mL 完全培养基的 1.5 mL 管中，该培养基补充有 2 mM 谷氨酰胺、3 mg/mL 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠、1× 血小板生成素（TPO）、1× 干细胞因子（SCF）、0.5× 青霉素/链霉素（P/S），pH 7.4（表 1）。

3. LSK造血干细胞的线粒体呼吸和糖酵解检测

  1. 在检测板中接种LSK细胞
    1. 将步骤2.4.17中获得的LSK细胞在室温下以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。
    2. 用完全培养基重悬细胞，调整终浓度至少为70,000个细胞/40 µL。
    3. 将含70,000个细胞的40 µL培养基接种至步骤1.2.4中已包被PLL的8孔板中，四个角上的孔保持空置。
    4. 在室温下以450 × g 离心1分钟，不启用刹车。使用倒置显微镜确认细胞已贴附于孔底。
    5. 向每孔细胞中加入135 µL完全培养基，使终体积达到175 µL；在板的两个对角孔中各加入175 µL完全培养基作为空白对照。
    6. 将细胞置于非CO2 培养箱中，37 °C孵育2小时。
    7. 在分析仪中设置程序，按照表2（线粒体应激测试）和表3（糖酵解应激测试）所述的计量方式向各孔添加药物。
      注：细胞孵育期间，请开启仪器并确保其温度维持在37 °C。
  2. 线粒体应激测试
    1. 配制寡霉素（oligomycin）45 µM、羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）50 µM以及鱼藤酮/抗霉素A（rotenone/antimycin A）25 µM的储备液。配制45 µM寡霉素储备液时，将市售小袋内含物溶于280 µL完全培养基中；配制50 µM FCCP储备液时，将市售小袋内含物溶于288 µL完全培养基中；配制25 µM鱼藤酮/抗霉素A储备液时，将市售小袋内含物溶于216 µL完全培养基中。
    2. 从培养箱中取出装有传感器微板的工具板，向其端口（A、B和C）加样，使各孔在稀释后达到终浓度分别为2 µM寡霉素、1.5 µM FCCP和0.5 µM鱼藤酮/抗霉素A，具体稀释比例参见表4（用于氧消耗率检测）。
    3. 取下工具板上组装好的传感器微板盖，将其放置于仪器托盘上，启动校准程序，持续20分钟。
    4. 校准完成后，移除工具板，并替换为含有已贴壁LSK细胞的检测板。
    5. 点击继续以启动表2中描述的程序。程序运行结束后，获取数据并使用Wave Desktop软件进行分析。
      注：细胞外通量检测所产生的数据可通过Wave Desktop软件中的点图进行可视化，或导出至基于网络的统计分析程序。
  3. 糖酵解应激测试
    1. 将市售小袋中的葡萄糖溶于300 µL完全培养基中（终浓度100 mM），寡霉素溶于288 µL完全培养基中（终浓度50 µM），2-脱氧葡萄糖（2-DG）溶于300 µL完全培养基中（终浓度500 mM）。
    2. 轻柔吹打溶液约10次以充分溶解化合物；对2-DG样品涡旋震荡约1分钟，确保其在培养基中完全溶解。
    3. 从培养箱中取出传感器微板，按照表5所述的稀释比例向端口A至C加样，使终浓度分别为10 mM葡萄糖、2 µM寡霉素和50 mM 2-DG。
    4. 重复步骤3.2.3和3.2.4。
    5. 点击继续以启动表3中描述的程序。程序运行结束后，获取数据并使用Wave Desktop软件进行分析。

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结果

我们的提取方法使每只小鼠可收获约 80,000 个 LSK HSPC。由于以下原因，该方法提高了 LSK 细胞的存活率和数量：（1）联合采集上肢和下肢、髋骨、胸骨、肋骨及脊柱的骨髓；（2）避免使用红细胞裂解缓冲液，以免增加细胞死亡和细胞聚团；（3）采用密度梯度介质分离单核细胞；（4）避免使用预冷缓冲液，以防目标细胞因聚团而丢失。

尽管细胞外通量分析传统上用于贴壁细胞，但我们通过使用PLL包被孔板，随后将细胞离心接种于其上，促进了LSK造血干细胞（HSPCs）在孔板表面的贴附。这使得我们能够测量细胞外通量，从而评估LSK HSPCs的代谢状态。考虑到从小鼠中可收获的细胞数量有限，以及其分离方案耗时较长，我们采用具有8孔板格式的分析仪，已成为最具成本效益且可行的解决方案（图1）。

细胞通过糖酵解和线粒体呼吸作用来满足其能量需求，并产生增殖和生长所需的中间代谢产物19。己糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，后者随后被转化为丙...

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讨论

本文展示了如何分离出最大量的高纯度且具有活性的小鼠LSK HSPCs群体，并利用细胞外通量分析仪检测其糖酵解和线粒体呼吸功能。具体而言，该实验方案克服了LSK HSPCs应用中的以下技术难题：i）LSK HSPCs在小鼠骨髓中频率较低14；ii）LSK HSPCs的基础代谢活性较低26；iii）LSK HSPCs细胞脆弱易损27；以及iv）LSK HSPCs不易贴附于培养容器表面15。此外，我们还优化了药物浓度和培养基成分，以确保细胞外通量检测达到最佳性能。

骨髓来源的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）存在于低氧微环境中，表现出糖酵解表型，这对于维持其干性至关重要28。相反，呼吸作用对HSPC的分化至关重要6。由于HSPCs的代谢功能障碍会导致血液系统疾病，本文中我们描述了用于检测小鼠骨髓来源LSK ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（HL131645，CA016058）、圣巴尔德里克基金会和佩洛通尼亚基金会的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液SigmaP8920用于LSK细胞贴附
40 µm 细胞滤筛Fisher Scientific22-363-547用于骨组织碾碎后的细胞过滤
抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads）Miltenyi130-090-485用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD45R/B220单克隆抗体（克隆RA3-6B2）BD Biosciences553086用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD5单克隆抗体（克隆53-7.3）BD Biosciences553019用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠CD8a单克隆抗体（克隆53-6.7）BD Biosciences553029用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠Ly-6G和Ly-6C单克隆抗体（克隆RB6-8C5）BD Biosciences553125用于Lin⁻细胞分离
生物素标记大鼠抗小鼠TER-119/红系细胞单克隆抗体（克隆TER-119）BD Biosciences553672用于Lin⁻细胞分离
CD117 (c-Kit) 单克隆抗体 (2B8), APC标记eBioscience17-1171-83用于LSK细胞分选
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Falcon-Fischer Scientific14-959-53A用于细胞分离
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Falcon-Fischer Scientific14-432-22用于细胞分离
Falcon 圆底聚丙烯管Falcon-Fischer Scientific14-959-11A用于LSK细胞分选
胎牛血清NeuromicsFBS001-HI用于FACS缓冲液配制
Histopaque-1083Sigma10831用于Ficoll密度梯度分离
L-谷氨酰胺 100倍溶液Fisher Scientific25-030-081用于实验培养基配制
LS柱Miltenyi130-042-401用于Lin⁻细胞分离
Ly-6A/E (Sca-1) 单克隆抗体 (D7), PE-Cyanine7标记eBioscience25-5981-82用于LSK细胞分选
小鼠干细胞因子（SCF）PeproTech250-03-100UG用于实验培养基配制
小鼠血小板生成素（TPO）PeproTech315-14-100UG用于实验培养基配制
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802用于FACS缓冲液配制
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Fisher Scientific15140122用于实验培养基配制
碘化丙啶Fisher ScientificP1304MP用于LSK细胞分选
Seahorse XFp 细胞培养微型板Agilent Technologies103025-100用于LSK细胞接种
丙酮酸钠（100 mM）ThermoFisher11360070用于实验培养基配制
链霉亲和素-eFluor 450偶联物eBioscience48-4317-82用于LSK细胞分选
XF校准液Agilent Technologies100840-000用于检测探针盒平衡
XF培养基Agilent Technologies103575-100用于实验培养基配制
XFp 糖酵解压力测试试剂盒Agilent Technologies103017100用于糖酵解压力测试的药物
XFp 线粒体压力测试试剂盒Agilent Technologies103010100用于线粒体压力测试的药物
XFp 传感器探针盒Agilent Technologies103022-100用于糖酵解和线粒体压力测试

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