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方法文章

结合人工授粉、显微观察与遗传分析的杏自交与杂交亲和性关系测定

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DOI：

10.3791/60241

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2020年6月16日

 ,  ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

本文内容

摘要

我们提出一种结合荧光显微镜检测自交（不）亲和性与PCR分析鉴定S基因型的方法，用于确定杏（Prunus armeniaca L.）品种的授粉需求。

摘要

蔷薇科植物的自交不亲和性由配子体型自交不亲和系统（GSI）决定，主要受多等位基因位点S控制。在杏树中，随着大量新品种的推出，许多品种的授粉需求尚不明确，因此确定品种间的自交及相互（不）亲和关系变得日益重要。本文描述了一种结合人工授粉与显微观察以及基于PCR的S基因型鉴定的方法体系。为确定自交（不）亲和性，从田间采集各品种处于气球期的花朵，在实验室进行人工授粉，随后固定并用苯胺蓝染色，通过荧光显微镜观察花粉管的生长行为。为建立品种间的不亲和关系，从各品种的幼叶中提取DNA，并通过PCR技术鉴定S等位基因。该方法可有效划分不亲和性群体，阐明品种间的不亲和关系，从而为新建果园选择适宜的授粉品种以及育种项目中亲本的选配提供重要依据。

引言

自交不亲和性是开花植物为防止自花授粉并促进异交而演化出的一种机制1。在蔷薇科植物中，该机制由配子体型自交不亲和系统（GSI）决定，主要受一个多等位基因位点S控制2。在花柱中，RNase基因编码S-花柱决定因子，即一种RNase3；而决定S-花粉决定因子的F-box蛋白则由SFB基因编码4。自交不亲和性的相互作用通过抑制花粉管在花柱中的生长来实现，从而阻止卵细胞的受精5,6。

近二十年来，全球范围内杏树品种进行了更新换代7,8。大量来自不同公共和私人育种项目的新型栽培品种被引入，导致授粉需求未知的杏树栽培品种数量增加8。

已采用多种方法来确定杏树的授粉需求。在田间，可通过在笼内植株或去雄花朵上进行控制授粉，随后记录坐果率百分比，以确定自交（不）亲和性9,10,11,12。此外，实验室中也通过花器官的半体外培养以及荧光显微镜下观察花粉管行为的方法进行控制授粉研究8,13,14,15,16,17。近年来，分子技术如PCR分析和测序，使得基于RNase和SFB基因研究的不亲和性关系得以鉴定18,19。在杏树中，已报道了33个S等位基因（S1至S20、S22至S30、S52、S53、Sv、Sx），其中包括一个与自交亲和性相关的等位基因（Sc）12,18,20,21,22,23,24。迄今为止，根据S-基因型，该物种已确立26个不亲和组8,9,17,25,26,27。具有相同S-等位基因的品种之间相互不亲和，而至少具有一个不同S-等位基因、因而归属于不同不亲和组的品种之间则相互亲和。

为明确杏树品种的授粉需求，我们介绍了一种结合荧光显微镜检测自交（不）亲和性与S基因型鉴定的方法学 S-通过PCR分析对杏品种进行基因分型。该方法可用于建立不亲和性群组，并阐明品种间的不亲和性关系。

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方案

1. 自交亲和性/不亲和性鉴定

  1. 在田间采集花朵样本。必须在花朵的气球期进行采集（图1A），对应杏树BBCH发育阶段标度的第58期28，以避免发生不必要的先前授粉。
  2. 实验室中的自花授粉与异花授粉
    1. 在花蕾处于气球期时去除花药，并将其置于纸片上，在室温下干燥。
    2. 24小时后，使用细网筛（0.26 mm）过滤花粉粒（图1B).
    3. 对每组自花授粉和异花授粉，选取30朵处于相同气球期的花朵去雄，并将雌蕊置于盛有水的花泥中，于室温下放置图1C).
    4. 用毛笔取同一品种的花粉，在去雄后24小时对雌蕊进行人工授粉。此外，以兼容的授粉品种花粉对每个品种的另一组雌蕊进行授粉，作为对照图1D).
    5. 72小时后，将雌蕊置于乙醇/冰醋酸（3:1）固定液中，在4 °C下固定至少24小时。29然后弃去固定液，加入75%乙醇，确保样品完全浸没于溶液中。样品可在4 °C条件下在此溶液中保存至使用。8,17,30,31,32.
  3. 通过体外花粉萌发评估花粉活力
    1. 准备萌发培养基时，称取25 g蔗糖、0.075 g硼酸（H3BO3) 和 0.075 克硝酸钙（Ca(NO3)2)33.
    2. 将培养基各组分加入250 mL蒸馏水中，充分溶解。
    3. 加入2 g琼脂糖以凝固培养基，并通过旋涡混匀。
    4. 使用pH计检测培养基的pH值，并用NaOH或HCl溶液调节至7.0。
    5. 将混合物进行高压灭菌以灭菌培养基。
    6. 高压灭菌后，在无菌超净工作台中将培养基冷却并分装至培养皿中。
    7. 将用于控制授粉的相同品种的花粉粒撒在固化的花粉萌发培养基上，24小时后在显微镜下观察6.
      注意：为对超净工作台进行灭菌，需使用70%乙醇清洁台面，并开启紫外灯照射10分钟。
    8. 将培养皿置于4 °C冰箱中保存，直至使用。
  4. 显微镜观察
    1. 用蒸馏水清洗柱头3次，每次1小时，然后将其置于4 °C的5%亚硫酸钠溶液中。24小时后，在1 kg/cm²压力下进行高压灭菌2 在亚硫酸钠中处理10分钟以软化组织34.
    2. 将灭菌后的雌蕊置于载玻片上，借助解剖刀去除子房周围的毛状体，以更清晰地观察花粉管。然后用盖玻片压片。
    3. 配制0.1%（v/v）苯胺蓝染液：将0.1 mL苯胺蓝与100 mL 0.1 N三碱基磷酸钾（K3PO4)。在制片上滴加一滴苯胺蓝，以染色花粉管生长过程中胼胝质的沉积。
    4. 使用340-380带通和425长通滤光片，在配备紫外落射荧光装置的显微镜下观察花柱中的花粉管。

2. DNA 提取

  1. 春季在田间采集2-3片叶片样本。建议采集幼嫩叶片，因为与老叶相比，幼叶提取的DNA质量更高，且酚类化合物含量较低。
  2. 按照 commercially available kit（见材料表）中所述步骤提取基因组DNA。
  3. 使用紫外-可见分光光度计（260 nm）分析DNA浓度的数量和质量。

3. S-等位基因鉴定

  1. PCR 反应的设置
    1. 将每个 DNA 提取样品用蒸馏水稀释至 50 ng/μL。
    2. 缓慢融化 PCR 试剂，并将其置于冰上。DNA 聚合酶在使用前应保留在冷冻柜中。
    3. 使用不同组合的引物准备扩增反应。按照 表 1 中的组分配制 PCR 反应混合液。充分涡旋混匀 PCR 反应混合液，并将对应不同引物组合所需体积分配至 PCR 板的各个孔中。然后，向每孔加入 1 μL DNA 稀释液。
    4. 将 PCR 板放入热循环仪中，运行 表 1 所示的相应 PCR 程序。
  2. 分析扩增片段。PCR 扩增片段主要有两种分析方法：使用荧光标记引物进行毛细管电泳（CE），或使用未标记引物通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
    1. 毛细管电泳
      1. 配制上样缓冲液：将 35 μL 去离子甲酰胺与 0.45 μL 标记的大小标准品混合。涡旋混匀试剂后，取 35.5 μL 加入到读板仪的孔中。
      2. 向孔中加入 1 μL PCR 产物。此外，加入一滴矿物油以防止水分蒸发。
      3. 向分离板中加入分离缓冲液，准备分离板。
      4. 使用基因分析仪配套的商业软件（见 材料表）。创建新的样品板，并保存板上所有孔的样品名称。
      5. 选择分析方法。本实验中，样品在 90 °C 变性 120 秒，以 2.0 kV 注入 30 秒，然后以 6.0 kV 分离 35 分钟。
      6. 将两块板插入基因分析仪中。用蒸馏水填充毛细管阵列。
      7. 加载专利线性聚丙烯酰胺（LPA）凝胶。最后，点击 运行。
    2. 凝胶电泳
      1. 配制 1% 琼脂糖凝胶：将 1.5 g 分子生物学级琼脂糖加入 150 mL 1x TAE（Tris-乙酸-EDTA）电泳缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）中，微波加热 2–3 分钟使琼脂糖完全溶解。
      2. 为观察 DNA，加入 4 μL 核酸染料（见材料表），并轻轻混匀。
      3. 将带有足够孔数（用于加样梯度、对照和样品）的凝胶梳插入凝胶托盘中，然后缓慢将混合液倒入托盘中央，避免产生气泡。
      4. 室温下冷却 30–45 分钟，直至凝胶完全凝固。将凝胶放入电泳槽中，取出凝胶梳，并加入足够的 1x TAE 缓冲液，使液面完全覆盖凝胶。
        注意：检查凝胶放置方向。加样孔应靠近负极，因为带负电荷的 DNA 会向阳极迁移。
      5. 向 PCR 产物中加入 5 μL 上样缓冲液（0.1% (v/v) 溴酚蓝），充分混匀。
      6. 为估算条带大小，加入 5 μL DNA 分子量标准（见 材料表）。
      7. 将样品加入凝胶的其余孔中。
      8. 所有样品和 DNA 分子量标准加样完成后，在 90 V 电压下电泳 1–1.5 小时，直至蓝色染料前沿迁移至凝胶长度约 75% 处。
      9. 在核酸凝胶成像系统中观察条带。

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结果

进行杏树授粉研究时，需使用开花前一天处于晚期花蕾期的花朵（图1A）。此时期被认为是采集花粉和雌蕊的最适阶段，因为此时花部结构已接近成熟，但花药尚未开裂。这可以避免非目标花粉的干扰，不仅防止了同一朵花内的自花花粉污染，也阻止了其他花朵的花粉传入，因为闭合的花瓣可阻隔携带外来花粉的昆虫进入。将花药在室温或略加温条件下置于纸片上放置24小时后，即可通过细筛轻松筛出花粉粒（图1B）。同样，使用镊子或指甲去除花瓣、萼片和雄蕊后，可从花蕾期的花朵中获取雌蕊（图1C）。随后可用细毛刷对雌蕊进行自花或异花授粉（图1D）。

杏的两性花具有5枚暗红色萼片和5枚白色花瓣（图1...

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讨论

传统上，大多数欧洲商业栽培的杏品种均为自交亲和型36。然而，在过去几十年中，由于在育种项目中使用了北美自交不亲和型品种作为亲本，导致越来越多自交不亲和型新品种被推出，而这些品种的授粉需求尚不明确7,8,37。因此，确定杏品种间的自交及种间（不）亲和关系变得日益重要。在一些冬季冷量逐渐减少的地区，这一问题尤为突出，因为每年开花时间存在较大变异，导致许多品种与其授粉品种的花期难以相遇，特别是那些需冷量较高的品种38。本文所述的方法结合了人工授粉、显微观察和遗传分析，对于判定各品种的自交（不）亲和性以及确定其潜在的授粉品种具有重要价值。

授粉需求可通过果园条件下的田间对照实验来确定11,39。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由西班牙科学、创新与大学部—欧洲区域发展基金、欧盟（AGL2016-77267-R 和 AGL2015-74071-JIN）；国家农业与食品技术研究所（RFP2015-00015-00，RTA2017-00003-00）；阿拉贡自治区政府—欧洲社会基金、欧盟（Grupo Consolidado A12_17R）、生物多样性基金会以及 Agroseguro S.A. 公司资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低电渗琼脂糖 D1Conda8010.22
BIOTAQ DNA 聚合酶试剂盒BiolineBIO-21060
明场显微镜Leica MicrosystemsDM2500
CEQ 系统软件Beckman Coulter
DNeasy 植物小量试剂盒QIAGEN69106
dNTP 试剂组，4 × 25 µmolBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA 片段大小标准品试剂盒 - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP 基因分析系统Beckman Coulter
GenomeLab 分离缓冲液Beckman Coulter608012
GenomeLab 分离胶 LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
图像分析系统Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 系统 Bio-Rad170-8640
NanoDrop One 分光光度计Thermo Fisher Scientific13-400-518
pH 计 BASIC 20Crison
Phusion 高保真 PCR 试剂盒Thermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 T 电源装置Biometra
正向引物Isogen Life Science
反向引物Isogen Life Science
Quantity One 软件Bio-Rad
体视显微镜Leica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GT 电泳槽Bio-Rad
SYBR Safe DNA 凝胶染料Thermo Fisher ScientificS33102
T100 梯度 PCR 仪Bio-Rad1861096
Taq DNA 聚合酶QIAGEN201203
垂直式高压灭菌器JP Selecta

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自交不亲和性荧光显微镜PCR分析S等位基因鉴定毛细管电泳苯胺蓝染色花粉管生长不亲和性群组杏树栽培品种
结合人工授粉、显微观察与遗传分析的杏自交与杂交亲和性关系测定
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