小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

摘要

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。

摘要

肝脏在损伤后的再生是哺乳动物的一项重要特征，可在暴露于环境毒素后防止器官立即衰竭和死亡。深入理解再生过程中基因表达的变化，有助于识别可用于促进肝脏损伤后功能恢复的治疗靶点。然而，由于缺乏特异性细胞标志物、细胞数量有限以及这些细胞的脆弱性，特异性分离再生肝细胞的方法受到限制。将核糖体亲和纯化（TRAP）技术与Fah^-/-小鼠模型相结合，可在模拟肝脏损伤的背景下实现肝细胞再生过程的重现，从而对再生中的肝细胞进行基因表达谱分析。利用TRAP技术，可快速高效地分离特定细胞类型的正在翻译的mRNA。我们建立了一种方法，结合TRAP技术，通过亲和法从特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体蛋白（RP）GFP:RPL10A的肝细胞中分离正在翻译的mRNA。TRAP技术避免了传统荧光激活细胞分选所需较长时间可能引起的基因表达谱改变。此外，由于只有再生中的肝细胞表达GFP:RPL10A融合蛋白，所分离的mRNA不会受到周围受损肝细胞及其他肝内细胞类型的污染。经亲和纯化获得的mRNA质量高，可用于后续基于PCR或高通量测序的基因表达分析。

引言

作为脊椎动物的主要代谢器官，肝脏负责葡萄糖稳态、血清蛋白合成、胆汁酸分泌以及外源性物质的代谢与解毒。当暴露于毒素时，肝脏具有非凡的能力，可再生受损的实质组织，以防止发生急性肝功能衰竭¹。然而，在对乙酰氨基酚或酒精过量摄入的情况下，肝脏再生可能失败，从而导致急性肝衰竭²。此外，由病毒性肝炎感染、脂肪肝疾病以及脂肪性肝炎引起的慢性肝损伤可导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌³。目前针对终末期肝病唯一有效的治疗方法是肝移植，但受限于器官供体短缺，无法为所有患者提供有效的治疗⁴。因此，深入理解毒性肝损伤后的恢复过程，对于开发能够促进足够再生以恢复病变器官功能的治疗策略至关重要。

研究肝脏再生最广泛应用的模型系统是啮齿类动物的部分肝切除术，即切除大部分肝脏以刺激肝细胞快速增殖⁵。然而，部分肝切除术并不能模拟毒性肝损伤后所引发的肝细胞增殖过程，因为在人类急性肝损伤中常见的免疫细胞浸润和肝细胞坏死在该模型中并不发生⁶。一种更适用于模拟此类器官再生的系统是Fah^-/-小鼠模型，该小鼠缺乏功能性的延胡索乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,....

方案

所有涉及小鼠使用的方法均符合宾夕法尼亚大学动物福利办公室IACUC提供的指南。

1. 试剂准备

1. 放线菌酮
   1. 配制 500 µL 浓度为 0.1 g/mL 的放线菌酮溶液：将 50 mg 放线菌酮溶于 500 µL 甲醇中。
      注意：放线菌酮对环境具有极高毒性，可导致先天性畸形。所有含放线菌酮的废液和缓冲液均应收集并妥善处理。
      备注：放线菌酮可在 4 °C 下保存最多 1 天。放线菌酮可抑制翻译过程。
2. 二硫苏糖醇（DTT）
   1. 配制 1 mL 浓度为 1 M 的 DTT 溶液：将 0.15 g DTT 粉末溶于无 RNase 水中。
      注意：DTT 可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。
      备注：DTT 是一种去垢剂。DTT 可在 -20 °C 下保存。建议将 1 M DTT 分装为每份 50 µL 的单次使用 aliquot。
3. 脱氧胆酸盐（DOC）
   1. 配制 10% DOC 溶液：取 1 g DOC 粉末置于 50....

结果

为了分析Fah^-/-小鼠中再生肝细胞的基因表达谱，通过水动力注射法将包含转座子的质粒（TRAP载体）⁸递送至肝脏，该质粒共携带Gfp:Rpl10a融合基因和Fah转基因（图1A）。撤除尼替西农可诱导产生毒性肝损伤，从而形成选择压力，促使稳定表达FAH的肝细胞增殖并重建受损的肝实质⁹。免疫荧光染色显示，在肝脏再生两周后，再生肝细胞中FAH与GFP:RPL10A融合蛋白共表达（图1B）。

在以下代表性实验中，使用静息状态和再生中的小鼠肝细胞进行了TRAP-seq分析。首先，为了从静息肝细胞中获得GFP标.......

讨论

TRAP-seq 是一种通过表位标记的核糖体实现细胞类型特异性翻译中 mRNA 分离的技术，可作为流式细胞分选（FACS）方法的替代方案，避免了 FACS 所需时间较长等局限性⁹。TRAP 技术能够直接从大量组织中快速高效地分离 RNA，有助于避免基因表达的任何改变。TRAP-seq 特别适用于再生的 Fah^-/- 小鼠肝脏研究，因为在停用尼替西农后，肝细胞的扩增是细胞自主性的，从而可以对整合了转基因的肝细胞亚群进行基因表达谱分析。TRAP 载体还可与基因激活或沉默分子¹⁷共表达，包括 cDNA、短发夹 RNA 和向导 RNA，以研究特定基因激活或抑制对全局基因表达的影响。另外，Rosa^LSL-GFP-L10A 转基因小鼠可用于对任何具有 Cre 重组酶活性的细胞进行基因表达谱分析。由于 GFP:RPL10A 可在表达 Cre 的细胞中特异性表达，因此可借此研究肝脏损伤和再生过程中其他肝内细胞类型的作用。例如，将 CK19-Cre 小鼠与 TRAP 转基因小鼠杂交.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 组织研磨器，Potter-Elv，涂层	DWK生命科学（Wheaton）	358007
Absolutely RNA Miniprep试剂盒	安捷伦	400800
抗GFP抗体	纪念斯隆-凯特琳抗体 & 生物资源中心	GFP 抗体 #19C8 和 GFP 抗体 #19F7
无IgG、无蛋白酶的牛血清白蛋白	杰克逊免疫研究实验室	001-000-162
cOmplete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11836170001
环己酰亚胺	Millipore Sigma	C7698
脱氧胆酸，DOC	Millipore Sigma	D2510
D-葡萄糖，右旋糖	Fisher Scientific	D16
DL-二硫苏糖醇	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	赛默飞世尔科技	65602
Fisherbrand 带透明盖培养皿	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS（10倍浓度），含钙、含镁，不含酚红	赛默飞世尔科技	14065-056
HEPES，1 M 溶液，pH 7.3，分子生物学级，超纯，Thermo Scientific	赛默飞世尔科技	AAJ16924AE
氯化镁，MgCl2	Millipore Sigma	M8266
甲醇	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	赛默飞世尔科技	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA 磁珠分离模块	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）	New England BioLabs	E7530S
壬基苯基聚乙二醇，NP-40。IGEPAL CA-630	默克生命科学	I8896
无核酸酶水，非DEPC处理水	Ambion	AM9932
顶置式搅拌器	DWK生命科学（Wheaton）	903475
PBS缓冲液（10倍浓度），pH 7.4	Ambion	AM9625
Pierce 重组蛋白 L，生物素化	赛默飞世尔科技	29997
氯化钾，KCl	默克生命科学	P4504
RNA 6000 Pico试剂盒 &和试剂	安捷伦	5067-1513
RNaseZap RNase 去污染溶液	Invitrogen	AM9780
RNasin 核糖核酸酶抑制剂	Promega	N2515
叠氮化钠，NaN3	Millipore Sigma	S2002
碳酸氢钠，NaHCO₃3	Millipore Sigma	S6297
SUPERase·在RNase抑制剂中	Invitrogen	AM2694