本文介绍一种筛选大肠杆菌（E. coli）生物素蛋白连接酶BirA新变体的方法，这些变体能够特异性地对目标肽段进行生物素化修饰。该实验方案详细描述了用于在细菌表面展示目标肽段的质粒构建、BirA文库的构建、BirA变体的筛选及其表征过程。
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本文内容
摘要
摘要
生物素化是一种理想的蛋白质翻译后修饰，可为蛋白质的分离与检测提供高效的标记。大肠杆菌（E. coli）生物素蛋白连接酶BirA介导的酶促生物素化具有高度特异性，能够在天然环境中实现靶蛋白的生物素化；然而，目前BirA介导的生物素化需要靶蛋白中包含一段合成的受体肽（AP）。因此，该技术的应用仅限于经过基因工程改造、含有AP的蛋白质。本实验方案的目的是利用源自未修饰靶蛋白的肽段在细菌表面展示，筛选能够对该肽段进行生物素化的BirA突变体。该系统基于一个单一质粒，可同时表达BirA突变体以及用于肽段在细菌表面展示的支架蛋白。本方案详细描述了将靶肽插入展示支架、构建BirA文库、筛选具有活性的BirA突变体以及对分离获得的BirA突变体进行初步表征的操作流程。该方法提供了一种高效的选择系统，可用于分离新型BirA突变体，进而推动能够对复杂溶液中天然蛋白质进行生物素化的生物素蛋白连接酶的定向进化研究。
引言
对蛋白质进行生物素化可为其亲和纯化和检测提供一个强有力的标签。蛋白质的酶促生物素化是一种由生物素-蛋白连接酶催化的高度特异性的翻译后修饰。大肠杆菌（E. coli）的生物素-蛋白连接酶BirA具有极高的特异性，仅在特定赖氨酸残基上共价修饰少数天然存在的蛋白质1。目前，通过将目标蛋白与一段短小的人工合成的15个氨基酸组成的生物素受体肽（AP）融合，可有效利用BirA催化的生物素化优势；该融合肽可被高效生物素化2，并通过共表达或外源添加BirA实现体内和体外高效、特异的生物素化3,4,5。尽管BirA催化的体内和体外生物素-蛋白连接是一种理想的标记策略，但其应用仅限于含有AP融合蛋白的样本。本方法旨在开发新型的生物素-蛋白连接酶突变体，使其能够选择性地对天然未修饰的蛋白质进行生物素化，从而拓展酶促生物素化策略的应用范围。
蛋白质功能可以通过对具有所需功能的基因变异体进行多轮迭代的基因突变、筛选和扩增来实现进化。强有力的高效筛选策略对于定向进化至关重要，而生物素-蛋白质连接酶（BirA）活性由于生物素与链霉亲和素及其同源物之间的强结合能力，易于被筛选出来
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方案
1. 将肽编码序列插入 pBAD BirA-eCPX-AP
注意：为了筛选能够生物素化天然靶蛋白的BirA变体，首先需在该蛋白的初级序列中鉴定出一段包含至少一个赖氨酸（K）残基的15个氨基酸肽段序列。
- 前往序列操作套件12。
- 将以 FASTA 格式编写的15个氨基酸肽序列粘贴到输入框中，然后点击 提交。
- 选择并复制该肽序列的45个核苷酸反向翻译序列。
- 从 http://n2t.net/addgene:121907 下载 pBAD-BirA-eCPX-AP 的 GenBank 文件。
- 在质粒编辑器（例如 ApE）中加载该文件，并在特征窗口中选择标注为 "AviTag(TM)" 的 AP 序列。
- 在DNA序列窗口中右键单击高亮显示的 AP 序列，并在上下文菜单中选择 粘贴反向互补序列（Paste Rev-Com）。
注意：eCPX 的编码序列位于反向链，因此肽编码序列应以反向互补形式粘贴。 - 右键单击高亮的序列，选择 新建特征（New Featur....
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结果
表达 pBAD-BirA-eCPX-AP 的细菌的 Western 印迹显示一条约 22 kDa 的与链霉亲和素反应的条带，与 eCPX 的分子量一致（图 2a）。与 BirA-6xHis 不同，生物素化的 eCPX-AP 在未诱导和诱导的培养物中均存在（图 2a），这是由于即使在未诱导的培养物中，T7 启动子仍具有一定程度的活性，导致内源性 BirA 对 AP 进行生物素化。在表达 BirA-eCPX-AP(K10A) 的培养物中，未检测到生物素化的 eCPX 条带（图 2a）。表达 eCPX-AP 的细菌表面发生强烈生物素化，加入链霉亲和素磁珠后会引起聚集，并在管底形成沉淀（图 2b）。而在表达 eCPX-AP(K10A) 的细菌中，未观察到链霉亲和素磁珠的聚集和.......
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讨论
与所有筛选方法一样，洗涤步骤的严谨性至关重要。由于在扩增被筛选克隆之前无需将细菌从磁珠上洗脱，因此可利用生物素与链霉亲和素之间的高亲和力结合，替代此前噬菌体展示系统中使用的亲和力较低的亲和素，用于筛选BirA突变体7,8。这可确保筛选出稀有克隆，并淘汰未生物素化的细菌。相较于噬菌体展示，细菌展示的另一优势在于其具有定量性11，因而能够根据酶活性对细菌进行筛选。
在本实验方案中，我们使用磁珠分选技术（MACS）对细菌进行筛选，建立了一种基于表面是否存在生物素的二元筛选系统。然而，若改用定量荧光激活细胞分选技术，则有望筛选出表达活性最高的BirA变体的细菌。这一方法对未来新型BirA变体的开发至关重要，因为它能够有效筛选出活性最高的BirA变体。
迄今为止，我们已使用了14种不同肽段的细菌展示，其中13种获得了明显的富集
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Mohamed Abdullahi Ahmed 提供的专业技术协助。本工作获得了来自 Lundbeck 基金会、Novo Nordisk 基金会、丹麦肾脏协会、Aase og Ejnar Danielsen 基金会、A.P. Møller 医学科学促进基金会以及 Knud 和 Edith Eriksen 纪念基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 预制聚丙烯酰胺凝胶 | Bio-Rad | 4561033 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - 质粒编辑器 v2.0 | NA | NA | 从 http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ 下载 |
| 阿拉伯糖 | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x)，无钙，无镁 | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI 限制性内切酶 | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute 质粒小量提取试剂盒 | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone 结构域突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200552 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF 膜 | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha 感受态 E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE 样品还原剂 (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | 用作模板和阳性对照 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | 阴性对照 |
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | New England BioLabs | M0491 | 用于在 pBAD-BirA-eCPX-AP 中插入肽序列，任何高保真聚合酶均可 |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| 脱脂奶粉 | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| 链霉亲和素-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq 感受态 E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| 胰蛋白胨 | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 |
参考文献
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J.
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重印与许可
