细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

摘要

本文介绍一种筛选大肠杆菌（E. coli）生物素蛋白连接酶BirA新变体的方法，这些变体能够特异性地对目标肽段进行生物素化修饰。该实验方案详细描述了用于在细菌表面展示目标肽段的质粒构建、BirA文库的构建、BirA变体的筛选及其表征过程。

摘要

生物素化是一种理想的蛋白质翻译后修饰，可为蛋白质的分离与检测提供高效的标记。大肠杆菌（E. coli）生物素蛋白连接酶BirA介导的酶促生物素化具有高度特异性，能够在天然环境中实现靶蛋白的生物素化；然而，目前BirA介导的生物素化需要靶蛋白中包含一段合成的受体肽（AP）。因此，该技术的应用仅限于经过基因工程改造、含有AP的蛋白质。本实验方案的目的是利用源自未修饰靶蛋白的肽段在细菌表面展示，筛选能够对该肽段进行生物素化的BirA突变体。该系统基于一个单一质粒，可同时表达BirA突变体以及用于肽段在细菌表面展示的支架蛋白。本方案详细描述了将靶肽插入展示支架、构建BirA文库、筛选具有活性的BirA突变体以及对分离获得的BirA突变体进行初步表征的操作流程。该方法提供了一种高效的选择系统，可用于分离新型BirA突变体，进而推动能够对复杂溶液中天然蛋白质进行生物素化的生物素蛋白连接酶的定向进化研究。

引言

对蛋白质进行生物素化可为其亲和纯化和检测提供一个强有力的标签。蛋白质的酶促生物素化是一种由生物素-蛋白连接酶催化的高度特异性的翻译后修饰。大肠杆菌（E. coli）的生物素-蛋白连接酶BirA具有极高的特异性，仅在特定赖氨酸残基上共价修饰少数天然存在的蛋白质¹。目前，通过将目标蛋白与一段短小的人工合成的15个氨基酸组成的生物素受体肽（AP）融合，可有效利用BirA催化的生物素化优势；该融合肽可被高效生物素化²，并通过共表达或外源添加BirA实现体内和体外高效、特异的生物素化^3,4,5。尽管BirA催化的体内和体外生物素-蛋白连接是一种理想的标记策略，但其应用仅限于含有AP融合蛋白的样本。本方法旨在开发新型的生物素-蛋白连接酶突变体，使其能够选择性地对天然未修饰的蛋白质进行生物素化，从而拓展酶促生物素化策略的应用范围。

蛋白质功能可以通过对具有所需功能的基因变异体进行多轮迭代的基因突变、筛选和扩增来实现进化。强有力的高效筛选策略对于定向进化至关重要，而生物素-蛋白质连接酶（BirA）活性由于生物素与链霉亲和素及其同源物之间的强结合能力，易于被筛选出来⁶。噬菌体展示技术可用于筛选展示生物素化肽段的噬菌体^7,8。然而，由于分离出的噬菌体需要感染细菌宿主才能扩增，使用链霉亲和素进行噬菌体筛选时会形成瓶颈，因为在非变性条件下，生物素与链霉亲和素的高亲和力结合几乎是不可逆的。为实现生物素化噬菌体的可逆结合，曾采用亲和力较低的单体亲和素，但仅实现了约10倍的适度富集⁷。我们近期开发了一种细菌展示方法，用于分离新型BirA变异体，该方法无需从亲和基质上洗脱，从而消除了以往BirA筛选系统中的瓶颈⁹。事实上，我们的细菌展示系统在单次筛选步骤中即可实现>1,000,000倍的活性克隆富集⁹，因而为新型BirA变异体的定向进化提供了一种高效的筛选系统。

我们的细菌展示系统包含两个组分：带有C端6xHis标签的BirA，以及一种可实现目标肽段表面展示的支架蛋白。我们采用的是增强型环状重排外膜蛋白X（eCPX）作为支架蛋白，因为在此蛋白的N端和C端均能有效展示肽段^10,11。将目标肽序列与eCPX的C端融合，可确保表达有活性BirA变体的细菌被生物素化。由于生物素化的肽段展示在细菌表面，因此可实现高效的链霉亲和素筛选（图1a）。

本方法旨在筛选出能够生物素化天然蛋白质中存在的肽序列的新型BirA变体。该系统由质粒pBAD-BirA-eCPX-AP上的基因编码，该质粒包含一个由阿拉伯糖诱导的启动子（araBAD）控制的BirA表达元件，以及一个由T7启动子控制的eCPX⁹表达元件（图1b）。本实验方案详细描述了以下步骤：1）将来源于目标蛋白的肽段插入eCPX的C末端；2）通过易错PCR构建BirA的突变文库；3）利用磁性激活细胞分选技术（MACS）筛选能够结合链霉亲和素的细菌；4）定量分析细菌富集情况；5）对分离得到的克隆进行初步表征。

方案

1. 将肽编码序列插入 pBAD BirA-eCPX-AP

注意：为了筛选能够生物素化天然靶蛋白的BirA变体，首先需在该蛋白的初级序列中鉴定出一段包含至少一个赖氨酸（K）残基的15个氨基酸肽段序列。

1. 前往序列操作套件¹²。
2. 将以 FASTA 格式编写的15个氨基酸肽序列粘贴到输入框中，然后点击 提交。
3. 选择并复制该肽序列的45个核苷酸反向翻译序列。
4. 从 http://n2t.net/addgene:121907 下载 pBAD-BirA-eCPX-AP 的 GenBank 文件。
5. 在质粒编辑器（例如 ApE）中加载该文件，并在特征窗口中选择标注为 "AviTag(TM)" 的 AP 序列。
6. 在DNA序列窗口中右键单击高亮显示的 AP 序列，并在上下文菜单中选择 粘贴反向互补序列（Paste Rev-Com）。
   注意：eCPX 的编码序列位于反向链，因此肽编码序列应以反向互补形式粘贴。
7. 右键单击高亮的序列，选择 新建特征（New Feature）。
8. 为插入的序列添加描述性名称，然后点击 确定。
9. 在 文件 菜单中选择 另存为，保存修改后的文件。
10. 设计正向引物时，应包含肽编码序列反向互补链的最后30个核苷酸，并在其5’端添加质粒结合核苷酸序列（3’-GCGGCCGCCTGC-5’）。
11. 设计反向引物时，应包含肽编码序列反向互补链的前30个核苷酸，并在其5’端添加质粒结合核苷酸序列（3’- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5’）。
12. 在薄壁PCR管中加入 表1 所列试剂，配制20 µL PCR反应体系。
13. 将PCR管转移至热循环仪，运行以下程序：98 °C 预变性30 s，30个循环 [98 °C 变性15 s，60 °C 退火15 s，72 °C 延伸3 min]，72 °C 最终延伸2 min，然后4 °C 保存。
14. 取5 µL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，确认是否扩增出约6 kb的PCR产物。
    注意：若未观察到PCR产物，应根据试剂生产商的说明优化PCR条件。此步骤可暂停。
15. 向PCR反应体系中加入1 µL DpnI，37 °C 孵育1小时。
16. 取2 µL经DpnI消化的PCR产物转化感受态 E. coli，涂布于LB/氨苄青霉素（Amp）平板，37 °C 过夜培养。
17. 挑取单菌落接种于5 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
    注意：建议至少检测6个克隆。
18. 向每份过夜培养物中加入甘油至终浓度15%，制备850 µL冻存菌种，-80 °C 保存。
19. 使用质粒小提试剂盒从剩余的4 mL培养物中提取质粒DNA。
20. 使用T7末端引物（GCTAGTTATTGCTCAGCGG）进行DNA测序，确认肽编码序列插入正确。

2. BirA 文库的构建

注意： 初始的BirA突变文库（图1c，步骤1）通过易错PCR构建。其他方法也可能适用于生成BirA突变文库。

1. 使用 BirA-6xHis 正向引物（ATGAAGGATAACACCGTGCC）和反向引物（TCAATGATGATGATGATGATGTTT），以含有目标肽序列的 pBAD-BirA-eCPX（在步骤 1.20 中制备并验证）1 ng 作为模板，按照生产商说明书进行 35 个 PCR 循环（退火温度为 60 °C），合成突变型大引物。
2. 取 5 µL 扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以确认扩增出 984 bp 的 PCR 产物。
3. 使用商业化的 PCR 纯化试剂盒从剩余的 45 µL 扩增反应产物中纯化 PCR 产物，并用分光光度计测定 DNA 产量。
   注意： 从单次 45 µL 扩增反应中纯化通常可获得足够产量（>250 ng）。
4. 在薄壁 PCR 管中加入 表 2 所列试剂，制备样品反应体系。
5. 将反应混合物转移至热循环仪，使用步骤 2.3 中制备的突变型大引物进行 PCR 扩增，程序如下：95 °C 预变性 1 min，随后进行 25 个循环（95 °C 变性 50 s，60 °C 退火 50 s，68 °C 延伸 12 min），反应结束后将样品置于 4 °C 保存。
6. 向扩增反应体系中直接加入 1 µL DpnI 限制性内切酶，轻轻混匀。
7. 短暂离心收集反应液，于 37 °C 孵育 2 小时。
8. 取 2 µL DpnI 消化产物转化至 T7 Express lysY/Iq 感受态 E. coli 细胞中。
9. 将转化后的细胞接种于 100 mL 含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中，于 37 °C、200 rpm 振荡培养过夜。
10. 取过夜培养物 10 mL 与 15% 甘油混合，制备冻存菌种，于 -80 °C 保存。

3. 筛选表达生物素化肽的细菌

注意：本实验方案的这一部分涵盖图1c中的步骤2-5。强烈建议使用pBAD-BirA-eCPX-AP和pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)分别作为阳性和阴性对照来建立筛选方法。

1. 在含有1%葡萄糖和100 µg/mL氨苄青霉素的100 mL LB培养基中接种1 mL BirA文库，并于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
2. 在含有1%葡萄糖和100 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中接种100 µL过夜培养物。
3. 继续培养2小时30分钟，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到约0.5。
4. 加入0.2%（w/v）L-阿拉伯糖、100 µM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和100 µM生物素以诱导eCPX和BirA的表达，并于37 °C、200 rpm振荡培养1小时。
5. 将菌液在5,000 ×g条件下离心10分钟，弃去上清液。
6. 用1 mL预冷的PBS重悬菌体，在5,000 × g条件下离心5分钟。
7. 弃去上清液，将菌体重悬于400 µL预冷的PBS中，并将菌液置于冰上保存。
8. 取10 µL重悬的菌液，置于标记为"Input"的1.5 mL离心管中，冰上保存。
9. 用1 mL预冷的PBS洗涤20 µL链霉亲和素磁珠，将离心管置于台式磁性粒子分离器中，小心吸除上清液。
10. 将链霉亲和素磁珠重悬于20 µL预冷的PBS中，转移至第3.8步中得到的390 µL重悬菌液中。
11. 轻轻吹打混匀，然后在4 °C孵育30分钟。
    注意：避免涡旋，以免裂解细胞。当展示生物素化肽段的细菌数量较多时，常可观察到磁珠聚集现象。
12. 将装有铁磁性微球的层析柱置于磁性粒子分离器中，用5 mL预冷的PBS洗涤。
13. 将菌液和链霉亲和素磁珠混合物转移至固定在分离器中的层析柱中。
14. 待层析柱储液室排空后，加入500 µL预冷的PBS，重复此步骤，直至层析柱总共用5 mL预冷的PBS洗涤完毕。
15. 将层析柱从分离器中取出，放入一个1.5 mL离心管中。
16. 向层析柱中加入1 mL预冷的PBS，使用配套的推杆推动，洗脱磁标记的细胞。
17. 将1.5 mL离心管置于台式磁性分离器中，用1 mL预冷的PBS洗涤磁标记的细胞。
18. 将磁标记的细胞轻轻重悬于1 mL预冷的PBS中，取10 µL重悬液转移至标记为"Output"的1.5 mL离心管中，保存于冰上。
19. 将磁标记的细胞接种至100 mL含有1%葡萄糖和100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
20. 次日，取10 mL过夜培养物与含15%甘油的LB培养基混合制备冻存菌种，于-80 °C保存；另取1 mL过夜培养物用于下一轮筛选，即步骤3.2。
    注意：通常建议进行3–5轮筛选，以富集能够结合链霉亲和素的细菌。

4. 富集程度的定量分析

注意： 活细菌的定量分析 "输入“和 "在每轮筛选后，通过将样品进行连续稀释后涂布平板，并随后计数菌落形成单位（CFUs），以获得“输出”样品的结果。

1. 向输入样品（来自步骤 3.8）和输出样品（来自步骤 3.18）中各加入 990 µL 冰冷的 PBS，并将离心管分别标记为 "Input 10^-2" 和 "Output 10^-2"。
2. 用冰冷的 PBS 对 "Input 10^-2" 和 "Output 10^-2" 样品进行 10 倍系列稀释，直至输入样品达到 10^-10 的最终稀释度，输出样品达到 10^-4 的最终稀释度。
3. 取 100 µL 的 "Input 10^-6"、"Input 10^-8"、"Input 10^-10"、"Output 10^-2"、"Output 10^-3" 和 "Output 10^-4 样品，分别涂布于 LB/Amp 平板上，于 37 °C 过夜培养。
4. 计数菌落分布清晰可辨的平板上的菌落数量。将菌落数乘以稀释倍数，得到每 100 µL 的细菌浓度（菌落形成单位数）。
5. 通过将细胞浓度分别乘以输入体积（400 µL）和输出体积（1 mL），计算输入和输出样品中的总细菌数，并通过将输出细胞数除以输入细胞数来估算富集倍数。
   注意： 经过 3–5 轮筛选后，应能观察到显著的富集效果。

5. 筛选所得BirA突变体的表征

注意： 可在从第一个BirA文库中筛选出BirA变体后进行表征；然而，这些BirA变体通常对肽的活性较低。因此，在表征前还可额外进行一轮突变与筛选。通常从最终筛选轮次中分离出10个克隆用于进一步表征。

1. 从最终筛选轮次中挑选克隆，接种于5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。此外，将含有pBAD-BirA-eCPX-AP质粒的T7 Express lysY/Iq E. coli 菌株接种于5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，作为后续所述Western blot的阳性对照。
2. 在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
3. 向每种过夜培养物中加入甘油至终浓度为15%，制备850 µL的冻存菌种。于-80 °C保存。
4. 取100 µL过夜培养物接种至5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37 °C、200 rpm振荡条件下培养2小时。
5. 使用商业化的小量质粒DNA提取试剂盒从剩余的4 mL培养物中提取质粒DNA。使用pBAD引物（ATGCCATAGCATTTTTATCC）和pTrcHis rev引物（CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG），对BirA变体进行正向和反向测序。
6. 向第5.4步的培养物中加入0.2% w/v L-阿拉伯糖、100 µM IPTG和100 µM生物素，在37 °C、200 rpm振荡条件下继续培养1小时，以诱导eCPX和BirA变体的表达。
7. 取65 µL培养物转移至含有25 µL上样缓冲液和10 µL还原剂的1.5 mL离心管中。
8. 在95 °C孵育5分钟。
9. 将样品（包括阳性对照）连同样品蛋白分子量标记物一起上样至12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在200 V电压下电泳约45分钟，直至20、25和37 kDa的标准条带清晰分离。
10. 将凝胶从玻璃板中取出，并组装转膜“三明治”结构，将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上。
11. 在冰浴条件下以35 V电压电转2小时。
12. 取出PVDF膜，置于封闭缓冲液[PBS、0.05% Tween-20、3%脱脂奶粉]中，在室温下振荡孵育1小时。
13. 用PBST将链霉亲和素-HRP按1:1,000稀释，配制生物素检测溶液。
    注意：封闭缓冲液中含有生物素，因此不得用于链霉亲和素-HRP的稀释。
14. 弃去封闭缓冲液，用PBST[PBS、0.05% Tween-20]快速洗涤膜，然后加入生物素检测溶液，在室温下振荡孵育1小时。
15. 弃去生物素检测溶液，用PBST在室温下轻轻振荡彻底洗涤膜，每次5分钟，共两次，再洗涤10分钟一次。
16. 弃去PBST，加入2 mL ECL显色液，振荡孵育1分钟。
17. 将膜迅速在滤纸上吸干，并在X光胶片或数字凝胶成像系统中显影。
    注意：在加载阳性对照的泳道中，应清晰可见两条不同的链霉亲和素反应条带：一条为30 kDa的内源性表达蛋白经生物素化修饰后的条带，另一条为约22 kDa的eCPX-AP条带。若所选10个菌落能够对展示的肽段进行生物素化修饰，则应可见一条约22 kDa的条带。这些条带的信号强度通常低于阳性对照，因此可能需要更长的曝光时间。 

结果

表达 pBAD-BirA-eCPX-AP 的细菌的 Western 印迹显示一条约 22 kDa 的与链霉亲和素反应的条带，与 eCPX 的分子量一致（图 2a）。与 BirA-6xHis 不同，生物素化的 eCPX-AP 在未诱导和诱导的培养物中均存在（图 2a），这是由于即使在未诱导的培养物中，T7 启动子仍具有一定程度的活性，导致内源性 BirA 对 AP 进行了后续的生物素化。在表达 BirA-eCPX-AP(K10A) 的培养物中，未检测到生物素化的 eCPX 条带（图 2a）。表达 eCPX-AP 的细菌表面发生强烈生物素化，加入链霉亲和素磁珠后会引起聚集，并在管底形成沉淀（图 2b）。而在表达 eCPX-AP(K10A) 的细菌中，则未观察到链霉亲和素磁...

讨论

与所有筛选方法一样，洗涤步骤的严谨性至关重要。由于在扩增被筛选克隆之前无需将细菌从磁珠上洗脱，因此可利用生物素与链霉亲和素之间的高亲和力结合，替代此前噬菌体展示系统中使用的亲和力较低的亲和素，用于筛选BirA突变体^7,8。这可确保筛选出稀有克隆，并淘汰未生物素化的细菌。相较于噬菌体展示，细菌展示的另一优势在于其具有定量性¹¹，因而能够根据酶活性对细菌进行筛选。

在本实验方案中，我们使用磁珠分选技术（MACS）对细菌进行筛选，建立了一种基于表面是否存在生物素的二元筛选系统。然而，若改用定量荧光激活细胞分选技术，则有望筛选出表达活性最高的BirA变体的细菌。这一方法对未来新型BirA变体的开发至关重要，因为它能够有效筛选出活性最高的BirA变体。

迄今为止，我们已使用了14种不同肽段的细菌展示，其中13种获得了明显的富集

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 预制聚丙烯酰胺凝胶	Bio-Rad	4561033
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A1593
ApE - 质粒编辑器 v2.0	NA	NA	从 http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ 下载
阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256
生物素	Sigma-Aldrich	B4501
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x)，无钙，无镁	ThermoFischer Scientific	14200083
DpnI 限制性内切酶	New England BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute 质粒小量提取试剂盒	Sigma-Aldrich	PLN350
GeneMorph II EZClone 结构域突变试剂盒	Agilent Technologies	200552
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P PVDF 膜	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alpha 感受态 E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE 样品还原剂 (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	用作模板和阳性对照
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)	Addgene	121908	阴性对照
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0491	用于在 pBAD-BirA-eCPX-AP 中插入肽序列，任何高保真聚合酶均可
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976
脱脂奶粉	Sigma-Aldrich	70166
链霉亲和素-HRP	Agilent Technologies	P0397
T7 Express lysY/Iq 感受态 E. coli	New England BioLabs	C3013
胰蛋白胨	Millipore	T9410
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625