利用共聚焦显微镜监测跨物种生物膜中的胞外pH

摘要

本方案描述了由白色念珠菌（Candida albicans）和变异链球菌（Streptococcus mutans）组成的跨域生物膜的培养方法，并介绍了一种基于共聚焦显微镜的技术，用于监测这些生物膜内部的胞外pH值。

摘要

由真菌和细菌细胞共同组成的跨域生物膜参与多种口腔疾病的发生，例如根管感染、牙周炎、黏膜感染，尤其是儿童早期龋齿。在所有这些情况下，生物膜基质中的 pH 值影响微生物与宿主之间的相互作用，从而影响疾病进展。本方案描述了一种基于共聚焦显微镜的方法，用于监测包含白色念珠菌（Candida albicans）和变异链球菌（Streptococcus mutans）的跨域生物膜内部的 pH 动态变化。该方法利用比率型探针 C-SNARF-4 的 pH 依赖性双发射光谱及其染色特性，检测生物膜胞外区域 pH 值的下降。使用该探针进行 pH 比率测定需要仔细选择成像参数、对染料进行充分校准，并对图像数据进行基于阈值的精细后处理。若操作得当，该技术可快速评估生物膜不同区域的胞外 pH 值，从而实现对水平和垂直方向 pH 梯度随时间变化的监测。尽管共聚焦显微镜的应用将 Z 轴剖面分析限制在厚度不超过 75 µm 的较薄生物膜范围内，但 pH 比率测定法非常适用于无创研究跨域生物膜中这一重要毒力因子。

引言

由真菌和细菌物种共同组成的跨界生物膜参与了口腔中的多种病理状况。Candida spp. 已频繁从根管感染¹以及牙周病变中分离得到^2,3。在黏膜感染中，属于轻链球菌组（mitis group）的链球菌物种已被证明可在体外和小鼠模型中增强真菌生物膜的形成、组织侵袭及播散能力^4,5,6,7。尤为引人注意的是，已有研究证实儿童口腔中携带 Candida spp. 与龋齿的患病率相关⁸。啮齿类动物模型研究表明，Streptococcus mutans 与 Candida albicans 之间存在共生关系，可增加胞外多糖的产生，导致形成更厚且更具致龋性的生物膜^9,10。

在上述所有情况下，尤其是婴幼儿龋齿中，生物膜的pH值对疾病进展具有重要意义，而生物膜基质在形成产酸微环境中的关键作用¹¹，促使人们需要发展能够研究跨域生物膜内部pH变化的方法。目前已开发出基于共聚焦显微镜的简单且准确的方法，用于监测细菌¹²和真菌¹³生物膜内部的pH值。利用比率型染料C-SNARF-4结合基于阈值的图像后期处理技术，可实时测定生物膜三维空间中胞外pH值¹⁴。与其他已发表的基于显微镜的生物膜pH监测技术相比，使用C-SNARF-4进行pH比率测定更为简便且成本低廉，因其无需合成包含参比染料的颗粒或化合物¹⁵，也无需使用双光子激发¹⁶。仅使用一种染料可避免探针区室化、荧光串色以及选择性漂白等问题^16,17,18，同时仍能可靠地区分胞内与胞外pH值。最后，染料孵育在生物膜生长完成后进行，因此可用于研究实验室培养和原位生长的生物膜。

本研究的目的是扩展pH比率测定法的应用，并提供一种用于研究跨物种生物膜中pH变化的方法。作为概念验证，该方法被用于监测由S. mutans和C. albicans组成的双物种生物膜在暴露于葡萄糖时的pH变化。

方案

唾液采集方案已通过奥胡斯县伦理委员会（M-20100032）的审查和批准。

1. 跨界生物膜的培养

1. 培养 S. mutans DSM 20523 和 C. albicans NCPF 3179 在37 °C、有氧条件下于血琼脂平板上培养。
2. 将每种生物的单个菌落转移至装有5 mL脑心浸液（BHI）的试管中，在37 °C有氧条件下培养18 h。
3. 将过夜培养物在 1,200 x g 5 分钟。弃去上清液，用生理盐水重悬细胞，并调整 OD_{550 nm} 至 0.5 C. albicans (~10⁷ 细胞/毫升）和 S. mutans (~10⁸ 细胞/毫升）。稀释 S. mutans 1:10 悬液，用无菌生理盐水配制（约10⁷ 细胞/毫升
4. 移取50 µL根据de Jong等人的方法制备的无菌唾液溶液¹⁹，加入至光学底96孔板的孔中用于显微镜观察。在37 °C孵育30分钟。用100 µL无菌生理盐水洗涤孔板3次。弃去孔内液体。
5. 加入 100 µL 的 C. albicans 将悬液加入每孔中，37 °C 孵育 90 分钟，用无菌生理盐水洗涤 3 次。
   注意：洗涤过程中切勿将孔内液体完全吸干，保留20 µL的残留液体，以避免产生过大的剪切力。
6. 每孔加入 100 µL 热灭活的胎牛血清（56 °C 灭活 30 分钟）。37 °C 孵育 2 小时。用无菌生理盐水洗板 3 次。弃去液体，每孔保留 20 µL 储液。
7. 加入 100 µL 的 S. mutans 将悬液（步骤1.3中制备）加入各孔中，每孔加入含5%蔗糖的150 µL BHI培养基。37 °C孵育24小时或更长时间。培养较老的生物膜时，每日更换新鲜BHI培养基。在跨域生物膜生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤5次。

2. 比值法pH成像

注意：在生物膜生长完成后，必须立即进行比率法 pH 成像。

1. 进行比率法pH成像时，使用配备63倍油镜或水镜、543 nm激光线和光谱成像系统（例如META探测器）的倒置共聚焦激光扫描显微镜，以实现重叠荧光信号的成像。使用培养箱将显微镜载物台预热至35 °C。
2. 设置探测器，确保检测576−608 nm范围内的绿色荧光，同时检测629−661 nm范围内的红色荧光。选择合适的激光功率和增益，避免图像过曝或欠曝。
   注意：图像曝光情况最好通过伪彩调色板图像进行观察。
3. 将针孔大小设置为1个艾里单位（Airy Unit），或光学切片厚度约为0.8 µm。将图像尺寸设为512 × 512像素，扫描速度设为2。选择2次线平均，采用均值模式。
   注意：在一系列实验开始前，应检查所选显微镜设置是否能清晰区分细菌细胞、真菌细胞壁、生物膜基质和真菌细胞质。
4. 准备100 µL含0.4%（w/v）葡萄糖的无菌生理盐水，并将pH滴定至7。配制C-SNARF-4储备液（1 mM，溶于二甲基亚砜）。将染料加入至终浓度为30 µM。
   警告：操作比率法染料时需佩戴腈手套。
5. 取出一个含有跨物种生物膜的孔中液体，保留20 µL的残留体积。加入含葡萄糖和比率法染料的无菌生理盐水。将96孔板置于显微镜载物台上，开始对生物膜进行成像。
6. 在生物膜的不同位置采集单张图像或Z轴层扫图像。在显微镜软件中标记X-Y位置，以便随时间追踪特定视野内的pH变化。定期在关闭激光的情况下采集图像，以校正探测器偏移。
7. 对在不同孔中培养的每个生物膜重复步骤2.4–2.6。

3. 比值染料的校准

注意：染料的校准及校准曲线的拟合可与比率法 pH 成像在不同日期进行。

1. 配制一系列在35 °C下用50 mM 2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液滴定至pH 4.0–7.8、以0.2 pH单位为间隔的缓冲溶液。将每种缓冲液各150 µL加入光学底96孔板的孔中，用于显微镜观察。
2. 向96孔板中含缓冲液的孔中加入染料，使其终浓度为30 µM。平衡5分钟。
3. 将显微镜载物台预热至35 °C。选择与比率法pH成像相同的显微镜设置。将96孔板置于显微镜载物台上，聚焦于孔的底部。在距孔底5 µm处，对所有缓冲液采集两幅图像（绿色和红色通道）。定期在激光关闭状态下采集图像，以校正探测器偏移。
4. 重复三次校准实验。
5. 将所有图像导出为TIF文件，并导入专用图像分析软件（例如ImageJ²⁰）。通过点击Process | Image Calculator | Subtract，将缓冲液图像减去对应激光关闭时采集的图像。
   注意：如有必要，可通过使用Image | Crop进行矩形选区裁剪图像，以消除图像边缘的人工伪影。
6. 将绿色通道图像除以红色通道图像，并通过点击Analyze | Histogram计算所得图像中的平均荧光强度。
7. 根据三次重复实验，绘制平均绿/红荧光比值随pH变化的曲线。使用专用软件对校准数据拟合函数（例如MyCurveFit）。

4. 数字图像分析

注意：在染料校准和比率法 pH 成像完成后，可在任意时间点进行数字图像分析。

1. 将绿色和红色通道的生物膜图像分别存储在不同的文件夹中，并将两组文件重命名为连续的数字编号（例如，GREEN_0001）。将图像导入专用的图像分析软件（如 ImageJ）。点击 分析 | 直方图，确定激光关闭时拍摄图像的平均荧光强度，并通过点击 处理 | 数学 | 减去，从生物膜图像中减去该数值。
2. 将两组图像导入专用的图像分析软件（例如 daime²¹）。对红色通道图像执行基于阈值的分割（分割 | 自动分割 | 自定义阈值）。将“低”阈值设置在真菌细胞质荧光强度之上，将“高”阈值设置在真菌细胞壁和细菌荧光强度之下。
   注意：当选择合适的阈值后，仅细胞外区域会被识别为对象。
3. 将分割后图像序列的对象层转移至绿色通道图像序列。操作方式为点击 分割 | 转移对象层。
   注意：如果在单个颜色通道中，细胞外区域与真菌细胞质之间的对比度过弱，可在分割前通过点击 编辑 | 图像计算器 | 加法，将绿色通道图像序列添加到红色通道序列中。按步骤 4.2 所述进行分割，并将分割后图像序列的对象层同时转移至绿色通道和红色通道图像序列。
4. 使用对象编辑器删除红色和绿色通道图像序列中的非对象像素（可视化 | 对象编辑器 | 所有图像 | 删除非对象像素）。此时，生物膜图像中的细菌和真菌细胞均已清除。将处理后的图像序列导出为 TIF 文件。
5. 将两组图像序列导入 ImageJ。ImageJ 会为所有非对象像素分配强度值 0。通过将红色图像序列（R1）除以其自身（处理 | 图像计算器 | 图像 1：R1；操作： 除法；图像 2：R1），然后将结果图像序列（R2）与原始红色图像序列相乘（处理 | 图像计算器 | 图像 1：R1；操作： 乘法；图像 2：R2），来移除这些像素。生成第三个图像序列（R3），其与 R1 相同，但 R1 中所有强度为 0 的像素在 R3 中被赋值为 NaN。对绿色通道图像序列以相同方式处理。
6. 对红色和绿色通道图像序列应用“均值”滤波器（处理 | 滤波器 | 均值 | 半径 | 1 像素），以补偿探测器噪声。将绿色通道图像序列除以红色通道图像序列（处理 | 图像计算器 | 图像 1：G3；操作： 除法；图像 2：R3）。所得图像序列（G3/R3）显示所有对象像素的绿/红比值。
7. 计算每幅图像的平均比值（分析 | 直方图）。应用伪彩着色以更清晰地可视化图像中的比值（图像 | 查找表）。利用步骤 3.6 中拟合的函数，将绿/红比值转换为 pH 值。

结果

24 小时和 48 小时后，多孔板中形成了稳定的跨界生物膜。C. albicans 表现出不同程度的丝状生长，而 S. mutans 形成了高达 35 µm 的致密菌簇。S. mutans 的单个细胞和链状结构聚集在真菌菌丝周围，较大的细胞间隙表明存在大量胞外基质（图 S1）。

比率染料的校准产生一条不对称的S形曲线^13,14。在不同显微视野中，生物膜的胞外pH在葡萄糖暴露后的最初5分钟内迅速下降，下降速率各不相同。此后，酸化过程减缓，通常在15分钟后达到5.5–5.8的pH值（图1）。重复实验的生物膜表现出相似的趋势，平均pH值仅有轻微差异（图S2）。

pH 计算的准确性在很大程度上取决于采集过程中图像参数的仔细选择。对于所研究的...

讨论

先前已有多种关于涉及C. albicans与Streptococcus spp.的跨域生物膜培养方案的描述^{9,22,23,24,25}。然而，本实验设计侧重于简单的培养条件、与常规工作日相适应的时间安排、均衡的物种组成，以及形成体积较大的生物膜基质。此外，使用唾液溶液对96孔板进行包被，以在一定程度上模拟口腔中的黏附条件。

使用C-SNARF-4进行pH比率测定是一种经济、快速测定生物膜pH值的方法，其优缺点已在其他文献中详细讨论^12,26。简而言之，该技术可用于评估生物膜内部不同位置的pH值...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血琼脂平板	Statens Serum Institut	677
脑心浸出液培养基	Oxoid	CM1135
脑心浸出液培养基 + 5% 蔗糖	BDH 实验室用品公司	10274
白色念珠菌	国家病原真菌保藏中心	NCPF 3179
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
daime：微生物生态学中的数字图像分析	Universität Wien	N/A	免费软件；版本 2.1；https://dome.csb.univie.ac.at/daime
二甲基亚砜	Life Technologies	D12345
胎牛血清	Gibco Life Technologies	10270
GS-6R 冷冻离心机	Beckman	N/A
ImageJ	美国国立卫生研究院	N/A	免费软件；版本 1.46r；https://imagej.nih.gov/ij
Java	Oracle	N/A	运行 ImageJ 所需的免费软件；版本 8.0；https://java.com/en/download
µ-96 孔黑色微孔板	Ibidi	89626
MyCurveFit	MyAssays Ltd.	N/A
2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 缓冲液	Bioworld	700728
PHM210 pH 计	Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x 油浸物镜	Zeiss	N/A	NA=1.4
SNARF®-4F 5-(和-6)-羧酸	Life Technologies	S23920
无菌生理盐水	VWR	6404
变形链球菌	德国微生物与细胞培养保藏中心	DSM 20523
Vis-V-3000PC 可见光分光光度计	VWR	N/A
XL 培养箱	PeCON	N/A
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A