通过高分辨率共聚焦显微镜表征抗转移抑制剂对三维肿瘤球体侵袭的影响

摘要

通过高分辨率共聚焦显微镜，表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在三维（3D）侵袭实验中对胶质瘤癌细胞迁移的抗迁移作用。

摘要

癌症研究中的药物发现与开发正越来越多地基于三维（3D）形式的药物筛选。研究人员正在发现并评估一些新型抑制剂，这些抑制剂靶向癌细胞的迁移和侵袭能力，从而抑制疾病的转移扩散，可作为胶质瘤等高度侵袭性癌症的辅助治疗手段。因此，亟需获得能够在药物处理后对三维环境中细胞行为进行详细分析的数据。本文所述的方法结合了类球体侵袭实验、高分辨率图像采集以及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的数据分析，实现了对潜在抗迁移抑制剂MI-192作用下胶质瘤细胞效应的深入表征。类球体由细胞系在低黏附96孔板中生成，用于侵袭实验，随后制备用于CLSM分析。该实验流程相较于其他常用的类球体生成技术，具有操作简便且可重复性高的优势。此外，共聚焦显微镜相比传统宽场显微镜可获得更高的图像分辨率，从而能够在三维环境中识别并分析使用迁移抑制药物MI-192处理后迁移细胞发生的显著形态学变化。

引言

三维球状体技术在临床前药物发现及潜在抗癌药物开发中的应用正日益受到青睐，逐渐取代传统的药物筛选方法；因此，针对抑制细胞迁移和侵袭的抗转移药物（migrastatic drugs）的研发也越来越多。这一癌症治疗领域发展的背后逻辑十分明确：三维球状体检测能够更真实地模拟三维肿瘤结构，比单层细胞培养更能准确反映药物与肿瘤之间的相互作用（动力学），并可在与肿瘤相关的环境中表征药物活性，因而为潜在抗癌药物的筛选提供了更为可靠的模型。此外，多种癌症类型对化疗毒性药物产生耐药性的现象日益普遍，且由于癌细胞具有向远端部位迁移的能力，导致转移频发，癌症患者死亡率居高不下，这也进一步支持将靶向癌细胞迁移能力的化疗药物作为辅助治疗手段纳入未来的临床癌症试验中¹。这一需求在高度侵袭性癌症中尤为突出，例如高级别胶质母细胞瘤（GBM）。GBM的治疗通常包括手术、放疗和化疗。然而，即使采用联合治疗，大多数患者在初次诊断后1年内即复发，中位生存期仅为11至15个月^2,3。近年来，三维技术领域取得了显著进展：旋转系统、微加工结构、三维支架以及其他独立检测方法正不断优化，以实现大规模常规化检测^4,5,6,

方案

1. 细胞球体的生成

第1天

1. 根据所研究的细胞系要求配制标准培养基。
2. 所有与组织培养相关的操作均须在组织培养超净台内进行，并采用无菌操作技术。
3. 用胰酶消化并计数癌细胞。每孔加入20 mL细胞悬液。将细胞悬液置于明确标记的无菌通用管中保存。
4. 向每个孔中加入预定数量的细胞。初始接种细胞数量及最终所需类球体大小取决于所研究细胞系的增殖速率。
   注意：对于U251和KNS42等已建立的胶质瘤细胞系^9,10，每毫升接种5 × 10³个细胞，经4天培养后可形成显微镜下可见的类球体（直径200或800 µm）。
5. 通过轻柔颠倒混匀通用管中的细胞悬液，避免细胞结团。用移液器将200 µL细胞悬液加入96孔板的每孔中。若无需使用全部孔位，建议在每个空孔中加入200 µL的1×PBS，以防止蒸发。
6. 将细胞置于37 °C培养箱中正常培养。
   注意：胶质瘤细胞系等细胞在24小时内即可形成类球体。为使三维细胞结构充分形成，建议继续培养类球体72小时。

....

结果

三维球状体技术正在推动对药物-肿瘤相互作用的理解，因为它更能代表癌症特异性的微环境。球状体的生成可通过多种方式实现；本方案采用低黏附96孔板。在测试了多个不同厂家的产品后，选择本实验所用的培养板，因其在球状体成功形成率和均一性方面始终表现最佳。更换步骤（即将培养基替换为胶原基质）是本方案的关键环节；必须小心操作，在不扰动球状体本身的条件下尽可能移除大部分培养基。可采用自动化成像结合宽场显微镜对药物诱导效应进行表征，以消除操作者主观偏差，但目前市面上可用的自动化设备成本仍显著高于本文所述的成像方法。

宽场落射荧光显微镜可用于观察药物活性对细胞迁移和侵袭的影响。然而，宽场显微镜所获得的分辨率不足以对药物对细胞形态的影响进行详细的结果解读（图1）。本文描述了通过可轻松重复的染色方案制备胶质瘤类球体及迁移细胞的过程，随后使用共聚焦显微镜进行成像。从宽场显微镜图像分析中可以明显看出，经MI-192抑制剂.......

讨论

本文介绍了一种利用高分辨率共聚焦显微镜鉴定抗迁移药物活性的新型肿瘤细胞球体构建方法。相较于悬滴法等其他技术¹⁵，使用低吸附培养板有助于生成可重复且均一的细胞球体，适用于胶原迁移与侵袭实验。本实验方案的关键步骤包括：在将细胞球体包埋于胶原基质前，需彻底移除96孔板中的生长培养基；此后需小心操作含有球体的胶原凝胶块。目前已有数字微流控等新技术出现¹⁶，尽管成本较高，但可作为人工更换培养基和液体的替代方案。本方法的主要局限在于，当逐个对单个细胞球体进行明场显微镜成像并手动分析以评估抑制剂药物活性时，过程较为耗时。此外，该流程各步骤所需的试剂价格昂贵，且必须配备高分辨率共聚焦显微镜等专用设备。在开展胶原侵袭实验前，还需预先确定接种所需的最适细胞数量以及形成目标大小细胞球体所需的时间。

靶向癌细胞的药物研发、大规模药物筛选以及药物活性表征以用于药物优化与改进，正日益依赖于三维细胞检测技术。本实验方案可进一步优化并适用于其他实验检测方法，以及多种在其他疾病体系中具有重要意义的细胞类型。迄今为止，显微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原蛋白 I，大鼠尾部，100 mg	Corning	354236	用于胶质瘤侵袭实验；该产品由多家供应商/制造商提供，需根据预期实验类型和所用细胞系进行选择。对于胶质瘤细胞系，推荐使用大鼠尾部I型胶原蛋白（例如 Corning）。胶原蛋白应于4 °C避光保存，直至使用。不建议混合不同批次的胶原蛋白，以免影响聚合后胶原的一致性。
盖玻片	多种	多种	用于显微镜成像
DMEM粉末	Sigma	D5648	用于制备胶质瘤侵袭实验中胶原溶液所需的5倍浓度培养基；  可购买粉末形式，用双蒸水配制，并根据最终生长培养基的组成添加所需添加剂。完整的5倍浓度溶液在使用前应通过注射器滤器系统（0.22 μm）过滤。
胎牛血清	Sigma	F7524-500ML	用于胶质瘤细胞系的细胞培养
载玻片	多种	多种	用于显微镜成像
高糖DMEM	Gibco	41965062	用于胶质瘤细胞系的细胞培养
抑制剂	Tocris	多种	根据实验设计选择不同种类；抑制剂可从Selleckchem和Tocris等厂家购买。这些厂家提供抑制剂特性的详细说明、相关文献链接以及推荐工作浓度。与所有抑制剂一样，它们可能具有潜在毒性，应按照健康与安全指南操作。抑制剂应按照制造商建议配制成储备液。例如，我们使用迁移抑制剂MI-192来演示此类抑制剂的应用。我们已通过此方法测试了多种迁移抑制剂，并获得了可比的结果。
封片剂	多种	多种	用于显微成像
NaOH（1 M）	多种	多种	NaOH可直接购买所需摩尔浓度的溶液，或由固体配制而成。配制后的溶液应使用注射器滤器系统进行过滤除菌。1 M NaOH具有腐蚀性，在配制过程中应小心操作。
多聚甲醛	多种	多种	用于固定类球体和细胞；配制成4%溶液，注意健康危害，确保在制备侵袭实验用胶原溶液时遵守健康与安全规定
移液管（刻度移液管，3 mL）	多种	多种	用于侵袭实验和溶液移除
PBS，无菌组织培养级	Sigma	D1408-500ML	用于胶质瘤细胞系的细胞培养及染色洗涤
青霉素/链霉素（抗生素）	Sigma	P4333	用于胶质瘤细胞系的细胞培养
一抗、二抗、DAPI、鬼笔环肽	多种	多种	这些试剂有多个厂家供应，对于标记的二抗，我们推荐使用Alexa Fluor（Molecular Probes）。本实验中，一抗使用小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体（1/100，Abcam），二抗使用1/500稀释的抗小鼠Alexa Fluor 488标记抗体（Molecular Probes）。细胞核染色使用DAPI（多个厂家），肌动蛋白染色使用鬼笔环肽（多个厂家），两者均按推荐稀释比例1/500使用。
碳酸氢钠	Sigma	S5761	用于制备胶质瘤侵袭实验中5倍浓度的胶原溶液
丙酮酸钠	Sigma	P5280	用于制备胶质瘤侵袭实验中5倍浓度的胶原溶液
胰蛋白酶	Sigma	T4049	用于胰酶消化
超低吸附培养板	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	用于胶质瘤侵袭实验；需要低吸附性培养板，优先选用96孔板以便对研究中的化合物进行大规模筛选。市面上有多种低吸附性培养板可供选择；建议测试多种培养板以获得最佳类球体生成效果。根据我们的经验，Costar超低吸附圆底带盖培养板在胶质瘤癌细胞形成类球体方面表现最佳，可实现100%类球体形成且具有良好的可重复性。这些培养板在我们实验室也成功用于患者来源材料、膀胱癌和卵巢癌细胞的胶质瘤类球体制备。此外，干细胞或前体神经球也可用于此类培养板，以促进标准化神经球-类球体的生成
移液管（血清移液管，无菌，5 mL和10 mL）	多种，例如 Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	用于组织培养和胶原制备
多种多通道（50 - 250 μL）和单通道移液器（10 μL、50 μL、200 μL、1 mL）	多种	多种	用于细胞和类球体操作
宽场显微镜	多种	多种	用于观察类球体生成及类球体成像；本实验中使用EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher Scientific）采集宽场荧光图像
配备Plan Apochromat 63x 1.4 NA油镜的Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）	Zeiss	厂家报价	使用配备Plan Apochromat 63x 1.4 NA油镜的Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）采集共聚焦图像。采用二极管405 nm、458/488/514 nm氩多线激光器和HeNe 594 nm激光器分别激发Phalloidin 594、Alexa Fluor 488和DAPI。每张图像均采集一个代表性光学切片，所有设置（图像采集前后）均保持一致以确保可比性。所有图像随后使用配套的Zen成像软件和Adobe Photoshop进行处理。