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方法文章

利用光声流式细胞术检测卵巢癌

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⸱

DOI：

10.3791/60279

⸱

2020年1月17日

 ,  , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

本文内容

摘要

本研究提出了一种利用定制的光声流式系统和靶向叶酸包被的硫化铜纳米颗粒检测循环卵巢肿瘤细胞的方案。

摘要

许多研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）的计数有望成为卵巢癌的一种预后工具。目前检测CTCs的策略包括流式细胞术、微流控装置以及实时聚合酶链式反应（RT-PCR）。尽管近年来取得进展，但用于检测早期卵巢癌转移的方法仍缺乏临床转化所需的灵敏度和特异性。本文介绍了一种利用定制的三维（3D）打印系统（包括流动室和注射泵）通过光声流式细胞术（PAFC）检测卵巢癌循环肿瘤细胞的新方法。该方法采用叶酸封端的硫化铜纳米颗粒（FA-CuS NPs）作为靶向探针，通过PAFC识别SKOV-3卵巢癌细胞。本研究验证了这些对比剂对卵巢癌细胞的亲和性。结果通过纳米颗粒表征、PAFC检测以及荧光显微镜观察纳米颗粒摄取情况，证明了该新型系统在生理相关浓度下检测卵巢癌CTCs的潜力。

引言

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤之一，2018年全球约有184,800人因此死亡1。多项研究已表明卵巢癌的进展（即转移）与循环肿瘤细胞（CTCs）的存在密切相关2,3,4。目前检测和分离CTCs最常用的方法是Cellsearch系统，该系统以EpCam受体为靶点5。然而，在上皮-间质转化过程中，EpCam的表达会下调，而这一过程与癌症转移相关6。尽管已有技术进步，现有的临床技术仍存在准确性低、成本高和操作复杂等不足。由于这些局限性，开发用于发现和计数卵巢癌CTCs的新技术已成为重要的研究领域。

近年来，光声流式细胞术（PAFC）已成为一种有效的无创检测癌细胞、分析纳米材料和鉴定细菌的方法7,8,9。PAFC与传统的荧光流式细胞术不同，它利用光声效应来检测流动中的分析物。当激光被材料吸收后，引发热弹性膨胀，从而产生声波，该声波可由超声换能器检测到，这一过程即为光声效应10,11。相较于传统流式细胞术，PAFC具有操作简便、易于向临床转化以及能够在患者样本中以空前深度检测循环肿瘤细胞（CTCs）等优势12,13。最近的研究已采用PAFC系统，利用内源性和外源性对比剂进行细胞检测14,15。近红外（NIR）光吸收型对比剂，如吲哚菁绿染料以及金属纳米颗粒（例如金和CuS），已被用于与光声成像结合，实现对细胞和组织的选择性标记16,17,18。由于NIR光在生物组织中具有更优的穿透深度，因此光声检测可在更深的组织层次进行，适用于临床应用。鉴于其在临床应用中的巨大潜力，靶向性NIR对比剂与PAFC的结合在循环肿瘤细胞（CTCs）检测方面已引起广泛关注。

光声流式细胞术（PAFC）结合靶向对比剂为患者样本的高通量分析提供了更优的方法，可提高准确性并实现对循环肿瘤细胞（CTCs）的靶向检测。针对CTCs的主要检测策略之一是特异性靶向目标细胞表面存在的膜蛋白。卵巢来源CTCs的一个显著特征是其外膜上叶酸受体的过表达19。由于体内正常表达叶酸受体的细胞多为管腔上皮细胞，通常不直接暴露于血液循环中，因此靶向叶酸受体成为在血液中识别卵巢CTCs的理想策略20。近年来，硫化铜纳米颗粒（CuS NPs）因其能够靶向结合癌细胞表面表达的叶酸受体而受到关注21。这些纳米颗粒对比剂具有良好的生物相容性、易于合成，并可在近红外区（NIR）深层吸收光能，因此与PAFC技术联用时，是检测卵巢CTCs的理想靶向手段。

本研究描述了叶酸修饰的硫化铜纳米颗粒（FA-CuS NPs）的制备及其在光声流动系统中检测卵巢癌细胞的应用。CuS 纳米颗粒经叶酸修饰后可特异性靶向卵巢循环肿瘤细胞（CTCs），并在1,053 nm激光激发下产生光声信号。实验结果表明，在光声流式细胞检测系统（PAFC）中，使用这些光声对比剂孵育的卵巢癌细胞可被成功检测。该方法可实现对低至1个细胞/µL浓度的卵巢癌细胞的检测，且荧光显微镜结果证实SKOV-3卵巢癌细胞成功摄取了这些纳米颗粒22。本文详细介绍了FA-CuS NPs的合成方法、用于荧光显微镜观察的样品制备流程、光声流动系统的构建过程以及卵巢癌细胞的光声检测步骤。所提出的方法实现了在流动条件下利用FA-CuS NPs对卵巢癌CTCs的成功识别。未来的研究将聚焦于该技术在卵巢癌转移早期诊断中的临床应用。

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方案

1. 纳米颗粒的合成与功能化

注意：FA-CuS 纳米颗粒的合成采用一锅法，该方法改编自先前发表的方案21。
警告：所有合成操作均须在通风良好的化学通风橱中进行。

  1. 合成前，将约 300 mL 去离子水（DI）通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤。
  2. 用洗涤剂溶液清洗一个 250 mL 玻璃圆底烧瓶，并用去离子水冲洗。将 0.0134 g CuCl2 加入 100 mL 去离子水中，配制成 1 mM 溶液。
  3. 将 0.015 g 叶酸（FA）加入 CuCl2 溶液中，使用磁力搅拌子搅拌约 5 分钟。
  4. 用 200 µL 移液枪在约 10 秒内将 Na2S·9H2O（0.024 g 溶于 100 µL 去离子水）加入反应混合物中。
    注意：加入 Na2S·9H2O 后，溶液颜色将由浅黄色变为深棕色。
  5. 密封反应体系，放入设定为 90 °C 的油浴中，继续用磁力搅拌子搅拌。大约 15 分钟后，或当油浴温度达到 85−90 °C 时，再继续反应 1 小时。混合物应逐渐变为深绿色。
    注意：加热反应混合物时，务必对系统进行排气，以避免压力积聚。
  6. 从油浴中取出反应容器，在室温下短暂冷却约 10 至 15 分钟，然后转移至冰浴中。
  7. 待反应混合物冷却至 20 °C 以下后，用 1 M NaOH 调节 pH 至 10，使残留的叶酸完全溶解。
  8. 使用 30 kDa 超滤离心柱纯化 FA-CuS 反应混合物。每次向离心柱中加入 15 mL 溶液，以 3,082 × g 离心 15 分钟。
  9. 待全部反应混合物浓缩完成后，合并浓缩组分，并在 30 kDa 超滤离心柱中用 15 mL pH 10 的 NaOH 溶液洗涤 4 次。
  10. 进行质量测定时，取三分之一的溶液（约 66 µL），分装至三个玻璃小瓶中。在真空度约为 27 mmHg 的条件下，于 40 °C 真空烘箱中干燥过夜。
  11. 将剩余三分之二的浓缩溶液溶于 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C 保存以备后续使用。
  12. 在使用 FA-CuS 纳米颗粒前，将其置于超声波清洗器中，高功率超声处理 30 分钟。

2. 纳米颗粒表征

  1. 进行动态光散射（DLS）检测：取10 µL步骤1.1.14中制备的FA-CuS纳米颗粒（NPS）PBS浓缩液，加入2 mL去离子水中。在进行DLS表征前，将样品置于高功率超声清洗器中超声处理30分钟，并通过0.2 µm无菌滤膜过滤，以去除残留灰尘。
  2. 进行透射电子显微镜（TEM）检测：取10 µL FA-CuS NPS的PBS浓缩液滴加至一张蜡纸上。将覆有聚乙烯醇缩甲醛膜（formvar）的铜网小心倒置在液滴表面，静置2分钟。用铜网边缘轻触滤纸以吸除多余液体，随后自然晾干。使用透射电子显微镜在80 kV加速电压下对铜网进行成像。
    注意：FA-CuS NPS表征的典型结果见图1。

3. 细胞培养

  1. 本方案使用 SKOV-3 细胞。除非另有说明，使用添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 McCoy's 5A 培养基培养 SKOV-3 细胞，并在 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱中维持培养。

4. 用于显微镜观察的 FA-CuS 纳米颗粒荧光标记

  1. 将 Texas-Red-X 琥珀酰亚胺酯（0.2 mg 溶于 DMSO，浓度为 10 mg/mL）加入含有 2 mg FA-CuS 纳米颗粒的 1 mL 0.1 M NaHCO3（pH ~9）缓冲液中。
  2. 在室温避光条件下，使用磁力搅拌子搅拌反应混合物 1 小时。
  3. 将反应混合物转移至 4 mL 截留分子量为 30 kDa 的离心浓缩柱中，在 4,000 × g 条件下离心 10 分钟，进行浓缩。
  4. 在离心浓缩柱中用 4 mL 0.1 M NaHCO3 缓冲液（pH ~9）洗涤浓缩后的溶液 3 次，随后用 4 mL 去离子水洗涤 3 次，或持续洗涤至紫外-可见光检测流出液中仅残留微量荧光为止。

5. 卵巢癌细胞对 FA-CuS 纳米颗粒的摄取

  1. 在与FA-CuS NPs孵育之前，将SKOV-3细胞置于T75培养瓶中，加入8−15 mL不含叶酸的RPMI-1640培养基（含10% FBS和1%青霉素/链霉素），培养至少24 h。
  2. 将细胞以0.1 × 106 个细胞/mL的密度接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640完全生长培养基。
  3. 次日，将细胞与400 µg/mL的FA-CuS NPs在0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640完全生长培养基中孵育2 h。
  4. 孵育结束后，加入0.5 mL含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，随后加入至少1 mL不含叶酸的RPMI-1640完全生长培养基以中和胰蛋白酶活性，并在123 × g 条件下离心6 min。
  5. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL PBS中，并在123 × g 条件下离心6 min。重复此洗涤步骤2次，以去除未结合的NPs。
  6. 将细胞重悬于含2% Tween溶液的1−2 mL PBS中。
  7. 使用血细胞计数板和台盼蓝对细胞进行计数。若细胞浓度过高，需进一步稀释。将细胞用含2% Tween的PBS稀释至选定的检测浓度。
  8. 细胞现已准备好用于PAFC系统的分析。

6. FA-CuS 纳米颗粒摄取的荧光显微镜观察

  1. 重复步骤5.1中列出的操作，并继续执行以下显微镜检测方案。
  2. 在24孔板中的玻璃盖玻片上，以0.1 × 106 个细胞/mL的密度接种细胞，每孔加入0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640完全培养基。
  3. 次日，在不含叶酸的RPMI-1640完全培养基中，将细胞与荧光标记的FA-CuS NPs在0.5 mL体积下分别以100 µg/mL、200 µg/mL、300 µg/mL和400 µg/mL的浓度进行三重复孵育。
  4. 将细胞在37 °C培养箱中与纳米颗粒共同孵育2小时。
  5. 孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次。
    注意：所有洗涤步骤中，应小心将溶液沿孔板侧壁加入，避免扰动细胞。加入后，轻轻倾斜孔板并从孔侧吸出溶液。
  6. 加入0.5 mL含3.7%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，固定细胞15分钟，随后将玻璃盖玻片转移至新的24孔板中。
    警告：PFA为已知致癌物。所有固定操作应在通风良好的化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。
  7. 将细胞在含3.7% PFA和0.1% Triton-X的PBS溶液中继续孵育5分钟。
  8. 用0.5 mL PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，并将盖玻片转移至新的孔板中。
  9. 避光条件下，加入0.5 mL含DAPI的PBS溶液（染色使用20 µL/mL的0.5 mg/mL母液）孵育5分钟。
  10. 用PBS洗涤细胞3次。
  11. 最后一次PBS洗涤后，将盖玻片用封片剂封固于载玻片上。
  12. 细胞样本现已准备就绪，可进行荧光显微镜成像。图2展示了通过荧光显微镜进行典型细胞表征的示例。

7. 流体系统架构

  1. 流动池构建
    注意：可在补充材料中找到用于3D打印流动池的SolidWorks文件。
    1. 使用提供的SolidWorks文件，采用ABS热塑性塑料或PLA塑料3D打印流动池。若无法使用SolidWorks，可参考下方提供的尺寸。图3A展示了该模型的示意图。流动池本体尺寸为2.5 cm × 1.5 cm × 7.5 cm。流动池两端设有直径约5 mm的孔，用于容纳毛细管的导管插入。
      注意：流动池上设有一个直径为1 cm的孔，该孔垂直于毛细管的方向，用于放置超声换能器。一个与该孔内径相同的圆柱形凸起向池内延伸6 mm。为实现实时成像，流动池在毛细管正下方设有一个1 mm × 3 mm的狭缝。
    2. 3D打印完成后，清洗并组装系统以供使用。
    3. 将玻璃盖玻片覆盖在流动系统中的1 mm × 3 mm狭缝和1 cm孔上。
    4. 小心地用硅胶密封，防止泄漏。
    5. 将毛细管插入已固化的硅胶导管中，并从流动池侧面插入流动池，使玻璃毛细管正好位于3 mm狭缝和1 cm孔的上方及前方。
    6. 用硅胶密封导管，防止泄漏。
  2. 光声流动系统的搭建
    注意：图3B和图3C展示了流动系统结构的示例。
    1. 将换能器连接至超声脉冲发生器/接收器，并将信号增益设为59 dB进行放大。
    2. 将滤波器的输出端连接至配备内置现场可编程门阵列（FPGA）的多功能可重构示波器。
    3. 将从流动池引出的一根导管连接至一个T型接头，T型接头的两个分支分别连接两台注射泵。
    4. 将其中一台注射泵中装入空气，另一台装入待分析样品。将装有空气的泵流速设为40 µL/min，装有样品的泵流速设为20 µL/min。由此产生的两相流将生成体积为1 µL的样品段塞。在此流速下，系统每分钟可检测约6.4个样品。
      注意：为保持细胞分布均匀，每次检测前应立即轻轻涡旋混匀样品。此外，每隔几分钟应旋转注射器一次，以防止细胞在溶液中沉降。
    5. 将从流动系统引出的另一根导管连接至含有10%次氯酸钠的废液容器，用于处理流出系统的细胞。
      注意：在使用流动系统前，应检查是否存在泄漏，因为泄漏会影响流体稳定性。为确保生物安全，整个操作过程中细胞必须处于封闭系统内。
    6. 3D打印的流动池设计可实现换能器与激光光源之间的一致且可重复的对准，且所需校准极少。当毛细管在定制流动池中正确放置时，石英毛细管可确保换能器与激光精确对齐。
    7. 将石英毛细管的一段与换能器精确对齐，并置于显微镜视野范围内，以便将光纤精确放置在样品上方，使其能够照亮毛细管的整个宽度。
    8. 使用光纤引导波长为1,053 nm的二极管泵浦固体激光器照射样品。照射样品的激光束以及用于检测光声效应的换能器均未聚焦。
    9. 照射样品的激光能量约为8 mJ，激光重复频率为10 Hz，足以在样品通过系统时对其进行多次照射。
    10. 将流动系统置于倒置显微镜上方，确保在样品通过流动系统时，激光脉冲和样品路径均可见。使用显微镜连接的相机记录流动过程。
    11. 使用数据采集软件（见材料表）记录超声信号采集。通过FPGA触发超声信号和脉冲激光。分别使用含2% Tween的PBS缓冲液和含100 µg/mL FA-CuS纳米颗粒的2% Tween PBS缓冲液作为阴性对照和阳性对照。
    12. 利用显微镜连接的相机，同时记录激光发射和样品通过流动系统的过程。这些录像将用于将换能器记录的声学信号与激光发射时间相关联。当样品经过激光照射区域时，可将信号与相应的光声信号关联以进行分析。在10 Hz的采样频率下，每个样品段塞将被多次照射。

8. 后续处理

  1. 对于每次信号采集 s(t)，计算其希尔伯特变换 H[s(t)]，以生成解析信号。
  2. 通过计算解析信号的幅度来创建复包络 se(t)，即 显示信号处理的公式，包含平方根和希尔伯特变换项的数学表达式，并对包络进行积分，以测量每次采集所产生的总信号。使用 R 统计软件中的 t 检验比较各测试组（即 PBS、标记细胞、FA-CuS 纳米颗粒、单独细胞）的信号。原始光声信号及其希尔伯特变换如图 4所示。
  3. 进行图像重建时，根据整个运行过程中最大的峰值对复包络进行归一化。若比较一系列运行结果，则使用该系列中所有运行的最大峰值对复包络进行归一化。归一化后，将每次采集转换为一系列像素值，并将每组像素值序列表示为图像重建中的一列。PBS 和 FA-CuS 纳米颗粒信号的代表性重建结果如图 5所示，两幅图像均使用两次运行中的最大峰值进行归一化。

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结果

图1A展示了所合成纳米颗粒的典型透射电子显微镜（TEM）图像。典型纳米颗粒的平均尺寸约为8.6 nm ± 2.5 nm。纳米颗粒的测量在ImageJ软件中进行，应用了阈值和分水岭函数以分离颗粒用于测量。每个颗粒的水平和垂直直径相互垂直测量，然后取平均值。对于动态光散射（DLS）测量，图1B展示了代表性结果，这些颗粒的平均水动力学直径为73.6 nm。硫化铜纳米颗粒具有特征性的吸收曲线，其吸收范围延伸至近红外区（NIR），如图1C所示。在850 nm附近存在轻微的仪器伪影，这是由于分光光度计切换激光器所致。

与荧光标记的纳米颗粒共同孵育的细胞的荧光显微镜图像见

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讨论

本方案是一种利用光声流式细胞术（PAFC）和靶向硫化铜（CuS）对比剂检测卵巢循环肿瘤细胞（CTC）的简便方法。目前已有多种方法被用于检测卵巢循环肿瘤细胞，包括微流控装置、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光流式细胞术23,24,25。这些方法在复杂性、成本和准确性方面各不相同，限制了其在临床环境中的有效性。相较于这些传统方法，PAFC在检测循环肿瘤细胞方面具有多项优势，包括能够在患者样本中直接检测循环肿瘤细胞，并且易于转化为体内应用。已有研究证明，PAFC在结合靶向对比剂后，可在体外和体内准确检测循环肿瘤细胞26,27。

在本研究中，评估了FA-CuS纳米颗粒造影剂在生理相关浓度下提高循环肿瘤细胞（CTC）检测准确性的能力。实验使用悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中的分离SKOV...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Madeleine Howell 在合成方面的帮助，Matthew Chest 在流动系统设计方面的协助，以及 Ethan Marschall 在 SolidWorks 方面的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含EDTA的0.025%胰蛋白酶Corning25-053-Cl
0.2 µm 1,000 mL真空过滤装置VWR10040-440用于过滤大量去离子水。
0.2 µm无菌注射器滤器VWR28145-477
3D打印储液罐定制
采集卡National InstrumentsPXIe-5170R250 MS/s，8通道，14位
AlconoxSigma-Aldrich242985-1.8KG用于清洗玻璃器皿的洗涤剂。
Amicon Ultra-15离心过滤器MilliporeUFC903024
Amicon Ultra-4离心过滤器MilliporeUFC803024
Bright-Line血细胞计数板Hausser Scientific1492
氯化铜(II)ACROS ORGANICS206532500
耦合物镜ThorlabsLMH-10x-532用于将脉冲光耦合至光纤。
耦合平台NewportF-91-C1-T用于将脉冲光耦合至物镜的平台。可固定FP-1A和LMH-10x-532
CPX系列数字超声波清洗浴Fisherbrand型号 CPX3800
数据采集软件National InstrumentsNI LabVIEW 2017 (32位)使用LabVIEW同步激光脉冲与数据采集。
数据处理软件MathworksMatlab R2016a使用Matlab软件进行图像重建和绘图。
FBSSigma-AldrichF2442-500ML
光纤夹具NewportFPH-DJ用于固定裸光纤。
光纤耦合器NewportFP-1A三轴平台，用于将光纤夹具和光纤精确定位于物镜焦点处。
叶酸Sigma-AldrichF7876-10G
Formvar包被透射电镜网格Electron Microscopy SciencesFCF300-CU-SB
Masterflex管路Cole ParmerEW-96420-14
McCoy's 5A培养基ATCC30-2007
Norm-Ject 10 mL注射器HENKE SASS WOLF4100-X00V0
光纤ThorlabsFG550LEC用于将样品暴露于脉冲光下。
PBSAlfa AesarJ62036
青霉素-链霉素GIBCO15140-122
脉冲激光器RPMC Lasers IncQuantus-Q1D-1053脉冲激光光源，参数为1053 nm，8 ns脉冲，最高10 Hz。
脉冲发生/接收器Olympus5077PR接收、滤波并放大光声信号。工作增益为59 dB。
石英毛细管Sutter InstrumentQF150-75-10
RPMI 1640培养基（1×），无叶酸Gibco27016-021
硅胶Momentive Performance Materials, Inc.GE284
SKOV-3细胞ATCCHTB-77
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
碳酸钠Sigma-AldrichS7795-500G
氢氧化钠珠粒BDHBDH9292-500G
九水合硫化钠Sigma-Aldrich431648-50G
注射泵New Era Pump Systems IncDUAL-1000
Texas Red-X-琥珀酰亚胺酯Invitrogen1949071
换能器OlynmpusV214-BB-RM超声探测器，中心频率为50 MHz，-6 dB分数带宽为82%。
0.4%台盼蓝溶液AmrescoK940-100ML
吐温20Sigma-AldrichP7949-100ML
超声耦合凝胶Parker Laboratories Inc.Aquasonic 100用于换能器耦合的超声凝胶

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