利用光声流式细胞术检测卵巢癌

摘要

本研究提出了一种利用定制的光声流式系统和靶向叶酸包被的硫化铜纳米颗粒检测循环卵巢肿瘤细胞的方案。

摘要

许多研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）的计数有望成为卵巢癌的一种预后工具。目前检测CTCs的策略包括流式细胞术、微流控装置以及实时聚合酶链式反应（RT-PCR）。尽管近年来取得进展，但用于检测早期卵巢癌转移的方法仍缺乏临床转化所需的灵敏度和特异性。本文介绍了一种利用定制的三维（3D）打印系统（包括流动室和注射泵）通过光声流式细胞术（PAFC）检测卵巢癌循环肿瘤细胞的新方法。该方法采用叶酸封端的硫化铜纳米颗粒（FA-CuS NPs）作为靶向探针，通过PAFC识别SKOV-3卵巢癌细胞。本研究验证了这些对比剂对卵巢癌细胞的亲和性。结果通过纳米颗粒表征、PAFC检测以及荧光显微镜观察纳米颗粒摄取情况，证明了该新型系统在生理相关浓度下检测卵巢癌CTCs的潜力。

引言

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤之一，2018年全球约有184,800人因此死亡¹。多项研究已表明卵巢癌的进展（即转移）与循环肿瘤细胞（CTCs）的存在密切相关^2,3,4。目前检测和分离CTCs最常用的方法是Cellsearch系统，该系统以EpCam受体为靶点⁵。然而，在上皮-间质转化过程中，EpCam的表达会下调，而这一过程与癌症转移相关⁶。尽管已有技术进步，现有的临床技术仍存在准确性低、成本高和操作复杂等不足。由于这些局限性，开发用于发现和计数卵巢癌CTCs的新技术已成为重要的研究领域。

近年来，光声流式细胞术（PAFC）已成为一种有效的无创检测癌细胞、分析纳米材料和鉴定细菌的方法^7,8,9。PAFC与传统的荧光流式细胞术不同，它利用光声效应来检测流动中的分析物。当激光被材料吸收后，引发热弹性膨胀，从而产生声波，该声波可由超声换能器检测到，这一过程即为光声效应

方案

1. 纳米颗粒的合成与功能化

注意：FA-CuS 纳米颗粒的合成采用一锅法，该方法改编自先前发表的方案²¹。
警告：所有合成操作均须在通风良好的化学通风橱中进行。

1. 合成前，将约 300 mL 去离子水（DI）通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤。
2. 用洗涤剂溶液清洗一个 250 mL 玻璃圆底烧瓶，并用去离子水冲洗。将 0.0134 g CuCl₂ 加入 100 mL 去离子水中，配制成 1 mM 溶液。
3. 将 0.015 g 叶酸（FA）加入 CuCl₂ 溶液中，使用磁力搅拌子搅拌约 5 分钟。
4. 用 200 µL 移液枪在约 10 秒内将 Na₂S·9H₂O（0.024 g 溶于 100 µL 去离子水）加入反应混合物中。
   注意：加入 Na₂S·9H₂O 后，溶液颜色将由浅黄色变为深棕色。
5. 密封反应体系，放入设定为 90 °C 的油浴中，继续用磁力搅拌子搅拌。大约 15 分钟后，或当油浴温度达到 85−90 °C 时，再继续反应 1 小时。混合物应逐渐变为深绿色。
   注意：加热反应混合物时，务必对系统进行排气，以避免压力积聚。
6. 从油浴中取出反应容器，在室温下....

结果

图1A展示了所合成纳米颗粒的典型透射电子显微镜（TEM）图像。典型纳米颗粒的平均尺寸约为8.6 nm ± 2.5 nm。纳米颗粒的测量在ImageJ软件中进行，应用了阈值和分水岭函数以分离颗粒用于测量。每个颗粒的水平和垂直直径相互垂直测量，然后取平均值。对于动态光散射（DLS）测量，图1B展示了代表性结果，这些颗粒的平均水动力学直径为73.6 nm。硫化铜纳米颗粒具有特征性的吸收曲线，其吸收范围延伸至近红外区（NIR），如图1C所示。在850 nm附近存在轻微的仪器伪影，这是由于分光光度计切换激光器所致。

与荧光标记的纳米颗粒共同孵育的细胞的荧光显微镜图像见

讨论

本方案是一种利用光声流式细胞术（PAFC）和靶向硫化铜（CuS）对比剂检测卵巢循环肿瘤细胞（CTC）的简便方法。目前已有多种方法被用于检测卵巢循环肿瘤细胞，包括微流控装置、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光流式细胞术^23,24,25。这些方法在复杂性、成本和准确性方面各不相同，限制了其在临床环境中的有效性。相较于这些传统方法，PAFC在检测循环肿瘤细胞方面具有多项优势，包括能够在患者样本中直接检测循环肿瘤细胞，并且易于转化为体内应用。已有研究证明，PAFC在结合靶向对比剂后，可在体外和体内准确检测循环肿瘤细胞^26,27。

在本研究中，评估了FA-CuS纳米颗粒造影剂在生理相关浓度下提高循环肿瘤细胞（CTC）检测准确性的能力。实验使用悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中的分离SKOV.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含EDTA的0.025%胰蛋白酶	Corning	25-053-Cl
0.2 µm 1,000 mL真空过滤装置	VWR	10040-440	用于过滤大量去离子水。
0.2 µm无菌注射器滤器	VWR	28145-477
3D打印储液罐		定制
采集卡	National Instruments	PXIe-5170R	250 MS/s，8通道，14位
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	用于清洗玻璃器皿的洗涤剂。
Amicon Ultra-15离心过滤器	Millipore	UFC903024
Amicon Ultra-4离心过滤器	Millipore	UFC803024
Bright-Line血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
氯化铜(II)	ACROS ORGANICS	206532500
耦合物镜	Thorlabs	LMH-10x-532	用于将脉冲光耦合至光纤。
耦合平台	Newport	F-91-C1-T	用于将脉冲光耦合至物镜的平台。可固定FP-1A和LMH-10x-532
CPX系列数字超声波清洗浴	Fisherbrand	型号 CPX3800
数据采集软件	National Instruments	NI LabVIEW 2017 (32位)	使用LabVIEW同步激光脉冲与数据采集。
数据处理软件	Mathworks	Matlab R2016a	使用Matlab软件进行图像重建和绘图。
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
光纤夹具	Newport	FPH-DJ	用于固定裸光纤。
光纤耦合器	Newport	FP-1A	三轴平台，用于将光纤夹具和光纤精确定位于物镜焦点处。
叶酸	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Formvar包被透射电镜网格	Electron Microscopy Sciences	FCF300-CU-SB
Masterflex管路	Cole Parmer	EW-96420-14
McCoy's 5A培养基	ATCC	30-2007
Norm-Ject 10 mL注射器	HENKE SASS WOLF	4100-X00V0
光纤	Thorlabs	FG550LEC	用于将样品暴露于脉冲光下。
PBS	Alfa Aesar	J62036
青霉素-链霉素	GIBCO	15140-122
脉冲激光器	RPMC Lasers Inc	Quantus-Q1D-1053	脉冲激光光源，参数为1053 nm，8 ns脉冲，最高10 Hz。
脉冲发生/接收器	Olympus	5077PR	接收、滤波并放大光声信号。工作增益为59 dB。
石英毛细管	Sutter Instrument	QF150-75-10
RPMI 1640培养基（1×），无叶酸	Gibco	27016-021
硅胶	Momentive Performance Materials, Inc.	GE284
SKOV-3细胞	ATCC	HTB-77
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S7795-500G
氢氧化钠珠粒	BDH	BDH9292-500G
九水合硫化钠	Sigma-Aldrich	431648-50G
注射泵	New Era Pump Systems Inc	DUAL-1000
Texas Red-X-琥珀酰亚胺酯	Invitrogen	1949071
换能器	Olynmpus	V214-BB-RM	超声探测器，中心频率为50 MHz，-6 dB分数带宽为82%。
0.4%台盼蓝溶液	Amresco	K940-100ML
吐温20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
超声耦合凝胶	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic 100	用于换能器耦合的超声凝胶