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方法文章

小鼠肌腱的生物力学测试

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DOI：

10.3791/60280

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2019年10月15日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

本文内容

摘要

本方案描述了利用定制的3D打印夹具对小鼠肌腱进行高效且可重复的拉伸生物力学测试方法。

摘要

肌腱疾病十分常见，可影响各个年龄段的人群，且常导致严重功能障碍。常规治疗方法（如抗炎药物、康复治疗和手术修复）往往效果不佳。为了明确肌腱功能并验证新疗法的有效性，必须准确测定动物模型中肌腱的力学特性。目前，小鼠动物模型已广泛用于研究肌腱疾病及评估新的肌腱病治疗方法；然而，测定小鼠肌腱力学特性的过程仍存在挑战。本研究开发了一种新的肌腱力学测试系统，该系统包含3D打印的夹具，可分别精确匹配肱骨和跟骨的解剖结构，用于对冈上肌腱和跟腱进行力学测试。这些夹具基于天然骨骼解剖结构的3D重建、实体建模和增材制造技术而设计。新方法消除了人为夹持失效现象（例如在生长板处断裂而非肌腱本身断裂），缩短了整体测试时间，并提高了实验的可重复性。此外，该新方法可便捷地适用于其他小鼠肌腱以及其他动物肌腱的测试。

引言

肌腱疾病在老年人群、运动员及活跃人群中十分常见且患病率很高1,2,3。在美国，每年报告的结缔组织损伤达1640万例4，占所有与损伤相关门诊就诊次数的30%3,5,6,7,8。最常受累的部位包括肩袖、跟腱和髌腱9。尽管已探索了多种非手术和手术治疗方法，包括抗炎药物、康复治疗和手术修复，但治疗效果仍不理想，功能恢复有限，且失败率较高5,6。这些不尽人意的临床结果推动了基础与转化研究，以期深入理解肌腱病的发病机制，并开发新的治疗策略。

拉伸生物力学性能是定义肌腱功能的主要定量指标。因此，对肌腱病及其治疗效果的实验室表征必须包括对肌腱拉伸性能的严格测试。已有大量研究描述了测定大鼠、绵羊、狗和兔等动物模型肌腱生物力学性能的方法10,11,12。然而，针对小鼠肌腱生物力学性能的研究较少，主要原因是小鼠组织体积小，难以在拉伸测试中有效夹持。由于小鼠模型在肌腱病机制研究中具有诸多优势，包括可进行基因操作、试剂选择广泛以及成本低廉，因此亟需建立准确且高效的小鼠组织生物力学测试方法。

为了准确测试肌腱的力学性能，必须有效夹持组织，避免在夹持界面发生滑脱或人为撕裂，以及生长板断裂。在许多情况下，尤其是对于较短的肌腱，一端夹持骨骼，另一端夹持肌腱。通常通过将骨骼包埋在环氧树脂13或聚甲基丙烯酸甲酯14,15等材料中来固定骨骼。肌腱通常被夹在两层砂纸之间，用氰基丙烯酸酯胶水粘合，并使用压缩夹具固定（若横截面较扁平）或在冷冻介质中固定（若横截面较大）15,16,17。这些方法已被用于小鼠肌腱的生物力学测试，但由于样本尺寸微小以及生长板具有持续的弹性且永不骨化18，实际操作中仍存在挑战。例如，小鼠肱骨头的直径仅有几毫米，使得骨骼夹持极为困难。具体而言，小鼠冈上肌肌腱-骨样本的拉伸测试常常导致生长板处发生断裂，而非肌腱本身或肌腱止点处断裂。同样，跟腱的生物力学测试也具有挑战性。尽管小鼠跟腱比其他小鼠肌腱更大，但跟骨较小，使得该骨骼的夹持困难。可选择去除骨骼后直接夹持两端肌腱；然而，这种方法无法测试肌腱与骨连接处的力学性能。其他研究团队报道了使用定制夹具夹持跟骨19,20、通过夹钳锚定21、包埋于自固化塑料骨水泥中22或采用锥形槽结构22等方法，但这些已有方法仍受限于重复性差、夹持失败率高以及制备过程繁琐等问题。

本研究的目的是建立一种准确且高效的实验方法，用于小鼠肌腱的拉伸生物力学测试，以冈上肌腱和跟腱为例进行说明。通过结合源自天然骨解剖结构的三维重建、实体建模和增材制造技术，开发出一种新型的骨端夹持方法。这些夹具可有效固定骨骼，防止骨骺生长板损伤，缩短样本制备时间，并提高测试的可重复性。该新方法可轻松适用于其他小鼠肌腱，以及大鼠和其他动物肌腱的测试。

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方案

动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用的小鼠品系为 C57BL/6J，购自杰克逊实验室（美国缅因州巴尔港）。小鼠饲养于无病原体屏障环境中，并可自由获取食物和水。

1. 用于夹持骨骼的定制化3D打印夹具的开发

  1. 骨图像采集与三维骨模型构建
    1. 解剖目标骨骼，为创建三维模型和打印三维骨夹具做准备；本方案以肱骨和跟骨为例。
      注意：用于力学测试的骨-肌腱-肌肉标本的详细解剖步骤见第2.1.1节。以下步骤应遵循以分离骨骼，用于制作3D打印骨夹具。
      1. 肱骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除上肢皮肤，清除肱骨表面所有肌肉，分离肘关节和盂肱关节，并小心去除附着在肱骨上的所有结缔组织。
      2. 跟骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除下肢皮肤，分离跟腱-跟骨连接处以及跟骨与其他足部骨骼之间的关节，并小心去除附着在跟骨上的所有结缔组织。
    2. 对完整骨骼进行显微计算机断层扫描（microcomputed tomography），例如扫描肱骨和跟骨样本。
      注意：根据所用扫描仪不同，设置参数会有所差异。在本研究使用的扫描仪（材料表）中，推荐设置为：55 kVP能量，Al 0.25滤光片，分辨率为6 μm。
      1. 将琼脂糖粉末加入超纯水中，微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。建议先加热30–45秒，停止并摇匀，再继续加热至沸腾。将琼脂糖填充至冻存管体积的四分之三。让琼脂糖冷却约5–10分钟。
      2. 将骨骼插入琼脂糖凝胶中（以防止扫描过程中产生运动伪影）。将装有骨骼的冻存管放入扫描仪中。
        注意：在本研究使用的扫描仪中，所有扫描均使用16位自动样品更换器。该扫描仪可根据样品的大小和形状自动选择放大倍数。 
    3. 将显微CT扫描的投影图像重建为横截面图像。使用实验人员扫描仪/软件组合推荐的参数。
      注意：在本研究使用的程序（材料表）中，建议使用以下重建参数：平滑度：0–2，束硬化校正：45，环状伪影减少：4–9，并以16位TIFF格式重建切片。
    4. 创建三维 模型，并保存为大多数3D打印机和快速原型系统兼容的标准STL格式。在本研究使用的程序（材料表）中，执行以下操作：
      1. 选择命令 文件 > 打开 以打开文件数据集。打开对话框 文件 > 首选项，并选择 高级 选项卡。
      2. 使用自适应渲染算法构建三维模型。该算法可最小化面片三角形数量，并提供更平滑的表面细节。将局部性参数设为10；该参数定义用于寻找物体边界的邻近点的像素距离。将容差最小化至0.1，以减小文件大小。
        注意：打开数据集后，图像将显示在“原始图像”页面中。
      3. 为指定感兴趣体积（VOI），手动选择两张图像，作为所选VOI范围的顶部和底部。
      4. 进入第二页 感兴趣区域。在单张横截面图像上手动选择感兴趣区域。
        注意：所选区域将以红色高亮显示（即肱骨横截面积）。
      5. 每隔10–15张横截面图像重复上一步骤。
      6. 进入第三页 二值选择。在直方图菜单中，点击 来自数据集。将显示数据集中所有图像的亮度直方图分布。同样在直方图菜单中，点击 创建3D模型 文件菜单。
    5. 将骨骼的三维模型以STL文件格式保存。
    6. 优化网格：调整网格以减小STL文件大小，并使其与任何实体建模计算机辅助设计程序兼容。在本研究使用的程序（材料表）中，按以下步骤操作：
      1. 导入网格并全选以进行编辑。从 编辑 工具集中选择 减少 。然后，从“减少目标”工具集中选择  三角形预算。减少三角形数量并确认更改。 通过选择“导出为…”将新减小的文件以STL格式重新保存。
  2. 定制化骨夹具设计
    1. 冈上肌腱-肱骨
      1. 使用实体建模计算机辅助设计程序创建与肱骨匹配的定制夹具模型（图1，补充文件）。
        注意：本研究使用的程序列于 材料表 中。
      2. 在实体建模程序中打开肱骨的STL格式文件，并保存为零件文件。
        注意：在本研究使用的软件（材料表）中，三维骨对象以SLDPRT格式保存。
      3. 打开零件文件，并手动创建三个解剖学相关的平面（即矢状面、冠状面、横断面）。
        1. 手动定义矢状面，使其穿过大结节处的冈上肌腱附着点。确保三维块体包含该矢状面作为对称平面。如有需要，可添加或切除块体材料以实现此目的。
          注意：该对称平面可确保当标本插入夹具时，肌腱及其附着点位于夹具的中心轴上。
      4. 沿三个平面（即高度、宽度、长度）测量骨骼的尺寸。
      5. 测量3D打印夹具将要安装的力学测试夹具的尺寸。
      6. 首先设计一个实心块体零件（例如实心圆柱体）。
        1. 确保块体的每个尺寸至少比肱骨尺寸大5 mm。
        2. 考虑力学测试夹具的设计限制（即确保3D打印夹具可在力学测试夹具中自由组装和拆卸）。
      7. 创建一个包含两个组件的装配体模型：实心块体和右侧或左侧肱骨。定义骨骼在块体内的方向（即肌腱与骨骼之间的角度）。确保整个骨骼体积完全位于块体内。
      8. 使用肱骨作为模具在块体中创建空腔。若使用 材料表 中指定的软件，请按以下步骤操作：
        1. 将设计零件（肱骨）和模具基体（圆柱块）插入临时装配体中。在装配体窗口中，选择块体，然后从 装配体 工具栏中点击 编辑组件。
        2. 点击 插入 > 特征 > 空腔。选择 统一缩放，并将各方向的缩放值设为0%。
      9. 抑制骨骼零件，并将装配体保存为零件。
      10. 打开零件（带空腔的圆柱体）。沿矢状面切割该零件，以创建两个对称组件，分别从前侧和后侧贴合骨骼（例如两个半圆柱体，如 图1 所示）。
        注意：设计两个组件，分别从前侧和后侧贴合骨骼。前侧组件包括一个从肱骨头前侧延伸至冈上肌腱附着点的半球形空腔。后侧组件的空腔形状与肱骨后部一致（即肱骨头后侧、三角肌粗隆、内上髁和外上髁）。
      11. 将每个组件保存为独立的零件文件。
      12. 对于前侧组件，通过定义适当的公差，确保肱骨头完全嵌入零件的空腔中。
        注意：在本研究中，使用 材料表 中指定的软件，建议按以下步骤操作：
        1. 创建旋转切除以平滑空腔的网格几何形状。通过模拟空腔几何形状并添加定位间隙来绘制切除草图。
          注意：该间隙允许骨骼与前侧组件之间自由组装和拆卸。
      13. 修改后侧组件，模仿空腔几何形状创建带有间隙的切除，如前侧组件所述。
      14. 从后侧组件顶部开始，沿横断面进行切割，直至大/小结节的嵴部。
        注意：如 图1 和 图2 所示，后侧组件包含一个在肌腱附着处形成开口的切割。
      15. 在两个组件之间创建紧密配合，以实现自由组装和拆卸。
        注意：在本研究中，夹具设计采用了具有松动运行间隙的孔-轴配合。
      16. 为对侧肢体（即左侧或右侧）的夹具每个组件创建三维镜像模型。
      17. 在夹具底部添加刻痕，以区分左右侧。
      18. 将所有夹具零件以STL标准文件格式保存，为3D打印做准备。
    2. 跟腱-跟骨
      1. 遵循上述冈上肌腱-肱骨头夹具的相同步骤。
        注意：由于左右跟骨的解剖结构几乎对称，因此仅需一套夹具即可用于跟腱-跟骨连接。

2. 小鼠肌腱的生物力学测试

  1. 标本制备与横截面积测量
    1. 解剖目标肌肉-肌腱-骨骼标本，为拉伸力学测试做准备。本研究中，从8周龄C57BL/6J小鼠中分离出冈上肌-肌腱-肱骨标本（N=10，5只雄性，5只雌性）和腓肠肌-跟腱-跟骨标本（N=12，6只雄性，6只雌性）。
      1. 冈上肌-肌腱-肱骨标本的解剖
        1. 按照IACUC批准的程序处死小鼠。将小鼠置于俯卧位，在前肢肘部上方至肩部的皮肤处做切口。
        2. 用钝性解剖法小心去除皮肤，使肩部肌肉组织暴露。去除肱骨周围的组织，直至暴露骨骼，并能用镊子牢固夹持。
        3. 用镊子夹住肱骨，小心去除三角肌和斜方肌，以暴露喙肩弓。识别肩锁关节，并用手术刀片小心将锁骨与肩峰分离。
        4. 注意不要损伤冈上肌腱及其骨性附着点，使用手术刀片将其从肩胛骨附着处分离。继续注意保护冈上肌腱及其骨性附着点，将肱骨头从关节盂中分离；使用手术刀片切开关节囊以及小圆肌、肩胛下肌和冈下肌的肌腱。
        5. 解离肘关节，使肱骨与尺骨、桡骨分离。分离出肱骨-冈上肌腱-肌肉标本，并清除肱骨及肱骨头上的多余软组织。
      2. 跟腱-跟骨标本的解剖
        1. 按照IACUC批准的程序处死小鼠。将小鼠置于俯卧位。注意不要损伤跟腱及其骨性附着点，用钝性解剖法去除皮肤，使踝关节和膝关节周围的肌肉组织暴露。
        2. 使用手术刀片，从跟腱-跟骨附着点开始，小心地将腓肠肌从其近端附着点分离。
        3. 小心地将跟骨与周围相邻骨骼解离。分离出跟腱-跟骨标本，并清除多余的软组织。
    2. 使用显微计算机断层扫描（microcomputed tomography）测定肌腱的横截面积。
      注：本研究使用的扫描仪（材料表）推荐设置为：55 kVP能量下扫描，Al 0.25滤波器，分辨率为5 μm。
      1. 将琼脂糖粉末溶于超纯水中，微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。建议先微波加热30–45秒，暂停并摇匀，再继续加热至沸腾。将琼脂糖注入冻存管至约四分之三满。让琼脂糖冷却约5–10分钟。
      2. 将标本倒置插入冻存管中，使其悬浮于琼脂糖内。
        注：仅骨骼部分应浸入琼脂糖凝胶中，肌腱和肌肉应悬于凝胶外部。
    3. 扫描完成后，使用手术刀片小心去除肌腱上的肌肉组织。将标本插入3D打印夹具中。
      注：夹具可重复使用。切勿在夹具中使用胶水或环氧树脂；骨骼通过过盈配合固定。
    4. 将肌腱夹在折叠的薄层滤纸（2 cm × 1 cm）之间并用胶水固定，再使用薄膜夹具夹紧该结构。将带有标本的3D打印夹具安装至测试夹具中。
    5. 将样品及夹具置于37 °C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）测试浴中（即小鼠体温23）。
  2. 拉伸测试
    1. 在材料试验机上进行拉伸力学测试。
      注：本研究使用的试验机（材料表）推荐测试方案如下：
      1. 将标距长度定义为肌腱附着点至上方夹具的距离。
      2. 在0.05 N至0.2 N之间进行5次预加载循环。
      3. 保持120秒。
      4. 以0.2%/s的速率进行至断裂的拉伸测试。
    2. 采集载荷-变形数据。
    3. 将应变计算为相对于肌腱初始标距长度的位移。
    4. 将应力计算为力除以肌腱初始横截面积（由microCT测量获得）。
    5. 若关注黏弹性行为，可在断裂拉伸测试前进行应力松弛实验，并利用数据计算准线性黏弹性模型中的参数，如A、B、C、tau1和tau224。
    6. 从载荷-变形曲线中计算刚度（曲线线性部分的斜率）、最大载荷以及屈服功（曲线下至屈服载荷的面积）。
      1. 通过在载荷-变形曲线上选择一段使线性最小二乘回归的R2值最大化的数据点窗口，确定线性部分25。
      2. 将刚度确定为载荷-位移曲线线性部分的斜率25,26。
    7. 从应力-应变曲线中计算模量（曲线线性部分的斜率）、强度（最大应力）和回弹性（曲线下至屈服应力的面积）。
      注：采用RANSAC算法，屈服应变（x值）定义为拟合曲线偏离预期应力值（y值）超过0.5%时的第一个点。屈服应力为对应于屈服应变的y值。
      注：除本研究中描述的单调拉伸至断裂外，循环加载可提供有关肌腱疲劳和/或黏弹性特性的关键信息。例如，Freedman等人报道了小鼠跟腱的疲劳特性27。
    8. 完成拉伸测试后，对整个骨骼进行显微计算机断层扫描，例如扫描肱骨和跟骨样本。
      注：本研究使用的扫描仪（材料表）推荐设置为：55 kVP能量下扫描，Al 0.25滤波器，分辨率为6 μm。
      1. 重复步骤1.1.2.1–1.1.2.2。
    9. 重复步骤1.1.3。
    10. 使用与扫描仪兼容的3D可视化软件，生成扫描对象的容积渲染3D模型。
      注：本研究使用的软件列于材料表中。
    11. 通过观察3D模型确定失效模式及失效部位面积。
  3. 统计分析：所有样本结果以均值±标准差（SD）表示。组间比较采用双尾非配对学生t检验。显著性水平设为 p < 0.05。
    注：本研究使用的统计软件列于材料表中。

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结果

采用3D打印夹具对8周龄小鼠的冈上肌腱和跟腱进行力学测试。所有经过机械测试的样本均在止点处发生断裂，这一结果通过显微CT扫描、肉眼观察以及拉伸试验后的视频分析得以确认。图3展示了本实验室此前与当前用于冈上肌腱测试方法的一一对应比较。在先前的方法28,29,30中，将肱骨嵌入环氧树脂中，并在肱骨头上方放置一个回形针，以期防止骨骺板骨折。环氧树脂完全固化需要4–6小时（图3），因此在典型的一天内仅能完成6–8个样本的测试。该方法的另一局限性在于，回形针放置效果依赖操作者技术，从而影响对骨骺板骨折的防护。使用这些早期方法所得测试结果变异程度较高，大多数参数的变异系数高达约30%，且骨骺板断裂的发生率约为10%–20%。如图3所总结，采用新方法后，样本制备时间缩短至5–10分钟，使得...

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讨论

小鼠动物模型常用于研究肌腱疾病，但其力学特性的表征在文献中仍具有挑战性且鲜有报道。本实验方案的目的是描述一种高效且可重复的小鼠肌腱拉伸测试方法。新方法将测试单个样本所需时间从数小时缩短至数分钟，并消除了以往方法中常见的主要夹持伪影。

本方案中描述的多个步骤对于有效固定小鼠冈上肌腱和跟腱以进行力学测试至关重要。首先，步骤 1.1.4 对于创建所需骨骼的三维模型是必要的；然而，由于该扫描通常使用高分辨率，生成的文件可能过大，无法直接用于实体建模程序。本方案所用软件成功减小了文件大小（步骤 1.1.6），同时保留了对象的几何结构，尽管其他软件也可能实现类似效果。其次，每个解剖部位在设计夹具时均有特定的设计要求。对于冈上肌腱夹具的设计，关键在于：(i) 固定肱骨头以防止生长板在测试中发生破坏（步骤 1.2.1.12）；(ii) 设计合适的间隙配合，避免测试过程中肱骨从模具中脱出（步骤 1.2.1.12.1）；以及 (iii) 调整肱骨的方向，使其长轴与肌腱长轴形成 180° 角（步骤 1.2.1.7）。对于跟腱夹具的设计，关键在于：(i) 设计合适的间隙配合，能够牢固夹持较小的跟骨，防止测...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH / NIAMS）资助（项目编号：R01 AR055580，R01 AR057836）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖费希尔科技BP160-100将1g琼脂糖溶解于100 ml超纯水中，配制成1%琼脂糖溶液 
Bruker microCT Bruker BioSpin CorpSkyscan 1272 作者使用
ElectroForce TA Instruments3200测试平台
乙醇 200 证明费希尔科技A4094稀释至70%，并按方案建议使用
用于连接夹具的固定装置定制作者使用
Kimwipes金佰利公司 S-8115按方案建议使用
MicroCT CT-Analyser (Ctan)Bruker BioSpin Corp作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 
MilliQ水（超纯水）默克生命科学QGARD00R1（或相关纯化系统）100 ml 
Meshmixer欧特克公司http://www.meshmixer.com/作者使用的免费工程软件，用于优化网格
Objet EDEN 260VS Stratasys LTD精密原型制作
Objet StudioStratasys LTD作者与3D打印机配合使用
PBS - 磷酸盐缓冲液赛默飞世尔科技100100312.5 L 的10% PBS 
S&T 镊子精细科学工具公司00108-11作者使用
手术刀片 - #11精细科学工具公司10011-00作者使用
手术刀柄 - #3精细科学工具公司10003-12作者使用
SkyScan 1272Bruker BioSpin Corp作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 
Skyscan CT-VoxBruker BioSpin Corp作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 
SkyScan NReconBruker BioSpin Corp作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 
SolidWorks CADDassault SystèmesSolidWorks 研究订阅版作者使用的实体建模计算机辅助设计软件
超级胶水乐泰234790按方案建议使用
测试浴槽定制作者使用
薄膜夹具 定制作者使用
VeroWhitePlusStratasys LTDNA作者使用的3D打印材料
WinTest WinTest 软件作者用于数据采集

参考文献

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