本方案描述了利用定制的3D打印夹具对小鼠肌腱进行高效且可重复的拉伸生物力学测试方法。
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本文内容
摘要
摘要
肌腱疾病十分常见，可影响各个年龄段的人群，且常导致严重功能障碍。常规治疗方法（如抗炎药物、康复治疗和手术修复）往往效果不佳。为了明确肌腱功能并验证新疗法的有效性，必须准确测定动物模型中肌腱的力学特性。目前，小鼠动物模型已广泛用于研究肌腱疾病及评估新的肌腱病治疗方法；然而，测定小鼠肌腱力学特性的过程仍存在挑战。本研究开发了一种新的肌腱力学测试系统，该系统包含3D打印的夹具，可分别精确匹配肱骨和跟骨的解剖结构，用于对冈上肌腱和跟腱进行力学测试。这些夹具基于天然骨骼解剖结构的3D重建、实体建模和增材制造技术而设计。新方法消除了人为夹持失效现象（例如在生长板处断裂而非肌腱本身断裂），缩短了整体测试时间，并提高了实验的可重复性。此外，该新方法可便捷地适用于其他小鼠肌腱以及其他动物肌腱的测试。
引言
肌腱疾病在老年人群、运动员及活跃人群中十分常见且患病率很高1,2,3。在美国，每年报告的结缔组织损伤达1640万例4，占所有与损伤相关门诊就诊次数的30%3,5,6,7,8。最常受累的部位包括肩袖、跟腱和髌腱9。尽管已探索了多种非手术和手术治疗方法，包括抗炎药物、康复治疗和手术修复，但治疗效果仍不理想，功能恢复有限，且失败率较高5,6。这些不尽人意的临床结果推动了基础与转化研究，以期深入理解肌腱病的发病机制，并开发新的治疗策略。
拉伸生物力学性能是定义肌腱功能的主要定量指标。因此，对肌腱病及其治疗效果的实验室表征必须包括对肌腱拉伸性能的严格测试。已有大量研究描....
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方案
动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用的小鼠品系为 C57BL/6J，购自杰克逊实验室（美国缅因州巴尔港）。小鼠饲养于无病原体屏障环境中，并可自由获取食物和水。
1. 用于夹持骨骼的定制化3D打印夹具的开发
- 骨图像采集与三维骨模型构建
- 解剖目标骨骼，为创建三维模型和打印三维骨夹具做准备；本方案以肱骨和跟骨为例。
注意：用于力学测试的骨-肌腱-肌肉标本的详细解剖步骤见第2.1.1节。以下步骤应遵循以分离骨骼，用于制作3D打印骨夹具。- 肱骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除上肢皮肤，清除肱骨表面所有肌肉，分离肘关节和盂肱关节，并小心去除附着在肱骨上的所有结缔组织。
- 跟骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除下肢皮肤，分离跟腱-跟骨连接处以及跟骨与其他足部骨骼之间的关节，并小心去除附着在跟骨上的所有结缔组织。
- 对完整骨骼进行显微计算机断层扫描（microcomputed tomography），例如扫描肱骨和跟骨样本。
注意：根据所用扫描仪不同，设置参数会有所差异。在本研究使用的扫描仪（材料表）中，推荐设置为：55 kVP能量，Al 0.25滤光片，分辨率为6 μm。- 将琼脂糖粉末加入超纯水中....
- 解剖目标骨骼，为创建三维模型和打印三维骨夹具做准备；本方案以肱骨和跟骨为例。
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结果
采用3D打印夹具对8周龄小鼠的冈上肌腱和跟腱进行力学测试。所有经过机械测试的样本均在止点处发生断裂，这一结果通过显微CT扫描、肉眼观察以及拉伸试验后的视频分析得以确认。图3展示了本实验室此前与当前用于冈上肌腱测试方法的一一对应比较。在先前的方法28,29,30中，将肱骨嵌入环氧树脂中，并在肱骨头上方放置一个回形针，以期防止骨骺板骨折。环氧树脂完全固化需要4–6小时（图3），因此在典型的一天内仅能完成6–8个样本的测试。该方法的另一局限性在于，回形针放置效果依赖操作者技术，从而影响对骨骺板骨折的防护。使用这些早期方法所得测试结果变异程度较高，大多数参数的变异系数高达约30%，且骨骺板断裂的发生率约为10%–20%。如图3所总结，采用新方法后，样本制备时间缩短至5–10分钟，使得.......
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讨论
小鼠动物模型常用于研究肌腱疾病，但其力学特性的表征在文献中仍具有挑战性且鲜有报道。本实验方案的目的是描述一种高效且可重复的小鼠肌腱拉伸测试方法。新方法将测试单个样本所需时间从数小时缩短至数分钟，并消除了以往方法中常见的主要夹持伪影。
本方案中描述的多个步骤对于有效固定小鼠冈上肌腱和跟腱以进行力学测试至关重要。首先，步骤 1.1.4 对于创建所需骨骼的三维模型是必要的；然而，由于该扫描通常使用高分辨率，生成的文件可能过大，无法直接用于实体建模程序。本方案所用软件成功减小了文件大小（步骤 1.1.6），同时保留了对象的几何结构，尽管其他软件也可能实现类似效果。其次，每个解剖部位在设计夹具时均有特定的设计要求。对于冈上肌腱夹具的设计，关键在于：(i) 固定肱骨头以防止生长板在测试中发生破坏（步骤 1.2.1.12）；(ii) 设计合适的间隙配合，避免测试过程中肱骨从模具中脱出（步骤 1.2.1.12.1）；以及 (iii) 调整肱骨的方向，使其长轴与肌腱长轴形成 180° 角（步骤 1.2.1.7）。对于跟腱夹具的设计，关键在于：(i) 设计合适的间隙配合，能够牢固夹持较小的跟骨，防止测.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH / NIAMS）资助（项目编号：R01 AR055580，R01 AR057836）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | 费希尔科技 | BP160-100 | 将1g琼脂糖溶解于100 ml超纯水中，配制成1%琼脂糖溶液 |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | 作者使用 |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | 测试平台 |
| 乙醇 200 证明 | 费希尔科技 | A4094 | 稀释至70%，并按方案建议使用 |
| 用于连接夹具的固定装置 | 定制 | 作者使用 | |
| Kimwipes | 金佰利公司 | S-8115 | 按方案建议使用 |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | 作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 | |
| MilliQ水（超纯水） | 默克生命科学 | QGARD00R1（或相关纯化系统） | 100 ml |
| Meshmixer | 欧特克公司 | http://www.meshmixer.com/ | 作者使用的免费工程软件，用于优化网格 |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | 精密原型制作 | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | 作者与3D打印机配合使用 | |
| PBS - 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 10010031 | 2.5 L 的10% PBS |
| S&T 镊子 | 精细科学工具公司 | 00108-11 | 作者使用 |
| 手术刀片 - #11 | 精细科学工具公司 | 10011-00 | 作者使用 |
| 手术刀柄 - #3 | 精细科学工具公司 | 10003-12 | 作者使用 |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | 作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | 作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | 作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像 | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks 研究订阅版 | 作者使用的实体建模计算机辅助设计软件 |
| 超级胶水 | 乐泰 | 234790 | 按方案建议使用 |
| 测试浴槽 | 定制 | 作者使用 | |
| 薄膜夹具 | 定制 | 作者使用 | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 作者使用的3D打印材料 |
| WinTest | WinTest 软件 | 作者用于数据采集 |
参考文献
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechani....
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重印与许可
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