本方案旨在对细胞取向和组织生长动态进行成像与分析 果蝇 果蝇在变态过程中腹部上皮的变化。本文所述方法可应用于研究不同发育阶段、组织及亚细胞结构 黑腹果蝇 或其他模式生物。
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摘要
摘要
在多细胞生物中，成熟的组织和器官在其组成细胞的空间排列上表现出高度有序性。一个显著的例子是感觉上皮，其中相同或不同身份的细胞通过细胞间黏附聚集在一起，形成高度有序的平面模式。这些细胞相互对齐，朝向相同方向，并在较大范围内表现出一致的极性。这种成熟上皮的组织结构是在形态发生过程中逐步建立的。为了理解成熟上皮平面排列的形成机制，关键在于在体内发育过程中以高时空分辨率追踪细胞的方向性和生长动态。同时，也需要强大的分析工具来识别和表征从局部到整体的转变过程。Drosophila 蛹期是一个理想的系统，可用于评估驱动上皮形态发生的定向细胞形态变化。蛹期发育中的上皮构成了静止身体的外表面，使得对完整动物进行长期成像成为可能。本文所述的实验方案旨在对蛹腹部表皮在生长过程中细胞行为的全局和局部水平进行成像与分析。所描述的方法可轻松适用于其他发育阶段、组织、亚细胞结构或模式生物中细胞行为的成像研究。
引言
为了实现其功能，上皮组织完全依赖其细胞组分的空间排列。在大多数上皮组织中，细胞不仅紧密排列形成精确的鹅卵石样层状结构，还会相对于身体轴线进行定向排列。
精确的组织结构在感觉上皮中具有明显的功能重要性，例如脊椎动物的内耳和视网膜。在内耳中，毛细胞和支持细胞沿特定的轴向排列，以高效感知声音和运动等机械刺激1,2。类似地，感光细胞的空间排列对于视网膜实现最佳光学特性至关重要3。因此，细胞位置和方向的空间调控对于正常的生理功能尤为关键。
Drosophila 是一种完全变态昆虫，其幼虫体结构通过变态过程发生彻底转变，从而形成成体组织。Drosophila 蛹是进行多种动态事件无创活体成像的理想模型，包括发育过程中的细胞迁移4、细胞分裂与生长动态5、肌肉收缩6、细胞死亡7、伤口修复8以及细胞取向9。在成体 Drosophila 中，外部上皮表现出高度有序的结构，这在其体表广泛分布的刚毛（即由单个上皮细胞产生的细胞突起）和感觉刚毛的排列方式中清晰可见10。事实上，刚毛呈平行排列，有助于引导气流11。成体上皮的形态发生及单个细胞的有序排列始于胚胎发生期，并在蛹期达到高峰。在胚胎期，细胞分裂、细胞嵌合以及细胞形状变化均会降低组织有序性12,13，而在发育后期，尤其是接近成熟的蛹期，这一趋势被逆转9。
不动的 Drosophila 蛹为研究细胞形态和方向变化提供了一个理想的系统。蛹腹部表皮具有特殊优势：虽然成体头部、胸部、生殖器及附肢的前体从幼虫阶段就开始生长并形成模式，但整合在幼虫表皮中的组织母细胞仅在化蛹时才开始生长和分化14。这一特性使得能够完整追踪组织有序性建立过程中涉及的所有时空事件9。
成虫腹部背侧表皮来源于位于每个预定腹部节段背外侧区域的成组织细胞巢，这些成组织细胞在胚胎发育期间于各节段的对侧位置被确定15,16。当成组织细胞扩展并取代幼虫上皮细胞（LECs）时，左右对侧的成组织细胞巢在背侧中线处融合，形成连续的细胞层17,18,19,20。
本研究描述了1）一种用于解剖、固定及长期活体成像的 黑腹果蝇 蛹，以及2）以高时空分辨率研究细胞取向与生长动态的分析方法。本文提供了详细的实验方案，涵盖从蛹的初始准备（即分期与成像）到方向性及取向特征的提取与量化所需的所有步骤。我们还描述了如何通过细胞克隆分析推断局部组织特性。所述所有步骤均具有最小侵入性，可实现长期活体分析。此处描述的方法可轻松调整并应用于其他发育阶段、组织或模式生物。
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方案
注意：本实验方案分为五个步骤：（1）蛹的分期，（2）为成像准备蛹，（3）活体成像观察腹部上皮的生长，（4）遗传嵌合体的构建，（5）数据处理与分析（包括如何从细胞连接轮廓分析细胞取向动态，以及从细胞克隆分析生长动态的章节）。
1. 分期 果蝇 成像前的蛹
- 在卵孵化后（AEL）5天（±12小时）内，将适当基因型的果蝇于25 °C条件下，在塑料试管中的标准培养基上进行培养。
注意：变态过程始于三龄幼虫在孵化后120小时（AEL）至蛹壳形成后0小时（APF）期间被包裹于蛹壳内。这一转变易于识别，因为幼虫在此时停止摄食和运动，并在APF 0–12小时期间形成口器区（图1A）。蛹壳最初柔软且呈白色，随后逐渐硬化并变为褐色。 - 使用湿润的画笔将白色未成熟蛹（APF 0小时）转移至新的塑料试管中。根据实验设计需求，可将样品在不同温度条件下保存至所需年龄。
注意：蛹的形成（即化蛹）发生在APF 12小时，此时成虫的头部和附肢完全外翻（图1A）。此时蛹壳已完全与蛹体分离，可完整去除（图1A）。
2. 准备用于活体成像的蛹
注意：分期后，按以下方法解剖并制备蛹（另见图1）。
- 用镊子将已发育至适当阶段的蛹从试管壁上取下。
- 将每只蛹的腹面粘附在覆盖有双面胶带的载玻片上。用镊子尖轻轻敲击蛹头部的气门（即口器区）及蛹的背侧表面，以确保蛹壳牢固粘附于胶带上（图1A,B）。
注意：应使蛹的背侧朝上，以便后续解剖蛹壳并取出蛹体。 - 在体视显微镜下开始解剖，用镊子轻轻将蛹壳上的口器部分（operculum）移除（图1C）。
- 将镊子的一端以较小角度从口器开口处插入蛹壳与蛹体之间的间隙。从头部向尾部横向撕开蛹壳，操作可分一次或多次完成，注意避免夹伤蛹体（图1D）。随着操作向后端推进，将裂开的蛹壳向两侧翻折（图1E）。
注意：蛹壳质地较硬，容易破裂。在高湿度环境或某些特定基因型背景下，蛹壳会变软，撕裂难度增加。此时可用镊子尖刺破蛹壳边缘的自由端，辅助其裂开。 - 将镊子小心插入已打开的蛹壳下方，轻轻上提，将蛹从壳中取出（图1F）。蛹会粘附在镊子尖端（图1G−H）。
- 用镊子将蛹转移至玻璃底培养皿中，并将其置于一小滴透气性卤代烃油液滴上（图1I）。操作时应轻握蛹的腹面，避免对组织造成损伤。
注意：卤代烃油液滴应较小，直径约为蛹长度的一半以下。此用量足以通过毛细作用使蛹粘附于玻璃表面，同时适用于油浸物镜的光学校正。 - 在培养皿边缘放置卷好的湿润滤纸条以维持湿度，并加盖防止蛹在成像过程中脱水。
注意：雌性和雄性蛹均可用于成像实验。建议选用第三腹节（AIII）作为参考腹节，因其在两性之间大小、形状和模式几乎相同。
3. 腹部上皮组织生长的活体成像
注意：使用配备40倍/1.3数值孔径油浸物镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜对处于不同发育阶段的蛹进行成像。
- 根据待评估的区域和过程，将蛹置于玻璃底培养皿的油滴上适当定位（例如，若需长时间活体成像观察背侧巢结构的早期扩展，则采用背外侧朝下；若需观察其晚期扩展及组织重塑，则采用背侧朝下）。参见图1J,K和图4。
- 将固定好蛹的玻璃底培养皿转移至显微镜载物台上，使用透射光聚焦于腹部表面。
注意：尽管本方案已针对倒置显微镜成像进行了优化，但也可在正置显微镜上进行成像。此时，应将样品放置于显微镜载物台上，使玻璃底面朝上。卤代烃油可使每个蛹稳定停留在弯月面之上。 - 设置采集参数：1）Z轴层数通常设置为20−40层，以实现腹部表皮适当的二维（2D）重建；2）每层之间的步进距离（例如，1微米）；3）图像采集的时间间隔（5分钟间隔适用于细胞取向动态的高保真分析）；4）帧分辨率（例如，1024 x 1024）。
- 开启相应的激光器（例如，488 nm和561 nm激光分别用于观察GFP和RFP荧光标记），并调节激光功率以及增益/偏移设置，以清晰显示标记细胞。应使用尽可能低的激光功率（通常在5%−20%范围内），以最大限度减少光漂白和光毒性。
- 利用配套的电动载物台及显微镜多点采集软件，手动为多个蛹设置成像位置及合适的Z轴扫描范围。
4. 生成遗传嵌合体以追踪细胞克隆的行为
注意：我们采用有丝分裂重组，通过位点特异性重组（FLP/FRT系统21,22）在腹部上皮中诱导遗传嵌合体（图2）。
- 将携带热休克诱导型 Flippase 转基因（hs-FLP）、特定基因组位置上的 FLP 识别靶位点（FRT 位点，例如位于第 2 号染色体 L 臂 40A 位置的 FRT 位点）以及位于 FRT 位点远端的可识别细胞标记（例如 Ubi-RFP.nls 或 Ubi-GFP.nls）的处女雌蝇，与在相同基因组位置携带 FRT 位点的突变雄蝇进行杂交（图 2A−C）。
注：可通过位于 FRT 位点远端的特定隐性等位基因，研究任何基因功能缺失在克隆内或克隆外的自主性与非自主性效应。 - 通过在杂交后代的三龄幼虫阶段进行热休克处理，诱导组织干细胞（histoblasts）中产生 FLP/FRT 体细胞克隆。具体操作为：在三龄游走幼虫（LIII）阶段，将盛有动物的塑料小瓶浸入 37 °C 水浴中持续 45 分钟至 1 小时。
注：有丝分裂重组的敏感时期为细胞周期的 G2 期。在整个幼虫发育过程中，组织干细胞均停滞于 G2 期。 - 从 16 小时成蛹后（APF）开始，检测荧光蛋白标记的双子克隆：观察标记信号的缺失（即突变细胞）或增强（即野生型双斑细胞）情况（图 2D）。
注：通常情况下，37 °C 处理 45 分钟至 1 小时，每个目标区域（例如腹部半体节）平均仅产生约 2−3 个双子克隆。若蛹中克隆密度过高（例如每个半体节超过四个双子克隆），则应排除其用于后续定量分析。 - 在确定克隆后，按照前一节所述方法，在所需发育阶段和时间长度对活体蛹进行成像。
5. 数据处理与分析
注意：数据使用 ImageJ（imagej.nih.gov/ij/）进行处理。
- 区分细胞取向动态与细胞连接轮廓。
- 使用 ImageJ 的最大强度投影（MIP）功能将共聚焦显微镜获取的 Z 轴层切片投影为二维图像。
注：每栈的切片数量应尽量减少，以避免由表皮下巡逻的巨噬细胞产生的离焦噪声。 - 建立一个平面坐标系，识别可靠的组织标志（例如，前后区室边界），用于每组数据集的分析（图 3A）。
注：对每组数据集使用相同的平面参考，可实现多个测量结果之间的比较。 - 在局部细胞边缘上使用 ImageJ 的OrientationJ插件（bigwww.epfl.ch/demo/orientation/）23,24，以获得定性和定量的取向值。该插件基于局部取向在输入图像上生成颜色编码的叠加图，并在定量模式下提供数值结果（图 3B−B'' 和 图 C−C''''）。
注：OrientationJ 插件基于结构张量，即由梯度和方向导数推导出的 2×2 特征值矩阵（详见参考文献23,24中的详细描述）。 - 使用OrientationJ 分布选项，相对于设定的平面坐标系对细胞边缘取向进行颜色编码（即细胞边缘取向图）（图 3B）。该分布选项位于 ImageJ 插件菜单下。推荐设置如下：高斯窗口 sigma = 1 像素；Cubic Spline = Gradient；最小一致性 = 20%；最小能量 = 1%。细胞边缘取向以颜色编码图像显示，使用插件的Color Survey选项（色调 = 取向；饱和度 = 一致性；亮度 = 输入图像）。
注：包含背景荧光的区域不提供任何方向信息，必须手动从分析中排除。较高的阈值设置会减少处理图像中被考虑的像素数量。 - 使用OrientationJ 测量选项量化细胞取向和细胞间方向性排列（即一致性）（图 3C）。该测量选项位于 ImageJ 插件菜单下。在组织母细胞占据的区域内生成大小一致、相邻且不重叠的兴趣区域（ROI，64 × 64 像素，约 20 µm × 20 µm）（图 3C）。
- 根据 ROI 计算主导局部取向（即邻近细胞间平均的细胞边缘取向图）和一致性。软件将计算每个 ROI 内的主要取向和局部一致性（图 3C）。
注：OrientationJ 估算的结构张量的最大和最小特征值用于计算一致性，即其差值与和值的比值。一致性取值范围为 0−1。值为 1 表示完全对齐的均匀性，值为 0 表示各向同性区域，无对齐性。 - 使用免费软件包（如 PAST25）对来自多张图像的取向和一致性值进行统计分析。取向值（以度为单位）等轴向数据应采用方向性统计方法进行描述。
- 通过软件计算每组取向分布的平均方向和圆形方差。不同基因型或条件下取向分布差异的统计显著性通过非参数 Mardia-Watson-Wheeler 检验（W 检验）判断分布是否相等。
- 应用非参数 Kolmogorov-Smirnov 检验（K-S 检验）计算一致性差异的统计显著性。可根据需要以图形方式展示数据（极坐标图、柱状图、箱线图等）。
- 使用 ImageJ 的最大强度投影（MIP）功能将共聚焦显微镜获取的 Z 轴层切片投影为二维图像。
- 基于细胞克隆的生长动态
注：以下步骤用于从包含目标克隆的二维 MIP 图像中提取细胞的几何和形态参数。在比较多个克隆时，图像必须在相同设置下获取。- 使用 ImageJ 的自由手选择工具绘制克隆区域的轮廓，以分割克隆区域。
- 通过 ImageJ 分析菜单下的设置测量工具计算几何和形态参数。启用面积、周长、拟合椭圆和形态描述符选项。
注：这将获得多种几何参数，包括面积（克隆内像素总和）、周长（克隆边界像素总和）、长宽比（AR，最佳拟合 Legendre 椭圆的长轴与短轴之比，该椭圆内接于克隆边界）以及取向角（即克隆长轴相对于前后边界的夹角）。 - 通过这些测量值计算无量纲比值，以获得形态参数。这些参数包括圆度（4 × [面积] / π × [长轴]2）、粗糙度（实心度 - 面积 / 凸包面积）和圆形度（4π × [面积] / [周长]2）。
注：每个形态参数代表克隆偏离理想形状（如圆形或凸包）的程度，所有参数取值范围均为 0 至 1。值为 1 表示最大对称性（即最小复杂度）。 - 使用 Microsoft Excel 和/或 PAST 对不同基因型或条件下的几何和形态参数进行统计分析。组间差异的统计显著性通过双尾非配对 Student t 检验（均值相等）或非参数 Kolmogorov-Smirnov K-S 检验（分布相等）判断。数据可根据需要以图形方式展示（如柱状图、箱线图等）。见图 5。
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结果
上述方案涵盖了黑腹果蝇（Drosophila）蛹期样本的制备，用于长期活体成像，以及对腹部表皮细胞取向和生长动态进行分析的操作流程。通过应用该方法，可在长达48小时的时间内获得发育中蛹期组织的高分辨率动态影像，且不会出现明显的光漂白或光毒性。在不同时间点以及以不同角度定位的蛹中所拍摄的腹部表皮（例如组织母细胞和大表皮细胞）图像快照如图4所示。对这些影像的后续分析可识别并量化组织母细胞扩张及大表皮细胞被取代过程中所调控的局部与全局几何形态参数的动态变化。此类分析可在不同实验条件或特定突变背景下进行，也可应用于基因表达发生改变的克隆，从而产生细胞自主性的功能缺失或功能获得状态。该方法还可用于探究周围细胞中的非自主性响应，有助于揭示细胞间的相互作用或细胞通讯机制（图5）。近期，该方法已被成功用于鉴定Fat/Dachsous/Four-jointed信号通路，证实其在成体果蝇腹部表皮平面极性模式建立过程中对细胞排列方向的调控起关键作用
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讨论
长程有序是大多数功能性生理单元的基本特征。在形态发生过程中，通过高度精确的时间和空间调控来整合复杂的指令，从而实现有序结构。多种多层次的约束条件被整合到刻板的组织排列中。
极性和方向性在发育过程中的有序空间排列中至关重要。极性意味着发育过程中对称性的打破。实现不对称性对于确定胚胎的前后（A/P）轴和背腹（D/V）轴以及成体的结构组织是必要的26。除了这一早期作用外，局部的不对称性在各个层次的形态多样性中均起着关键作用。方向性是形态发生过程中不对称性和极性的重要补充。全局有序性通过细胞在细胞间局部感知和传递信号的能力得以实现，这种信号传递具有精确的方向或取向。单个细胞的不对称性通过在特定空间方向上协调位置或运动，随时间推移而协同一致。细胞通讯涉及分泌因子、细胞间接触以及机械输入。这些信号作用于细胞群体，首先在局部、继而在整体上改变其行为方式27。
本研究介绍了一种分析单个细胞协调行为的简便方法，包括在组织有序发育过程中细胞的平面取向和...
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致谢
我们感谢Martín-Blanco实验室成员提供的有益讨论。同时感谢Nic Tapon（英国伦敦Crick研究所）、布卢明顿果蝇资源中心（美国印第安纳大学）以及FlyBase（ 果蝇 基因注释）。Federica Mangione 获得 JAE-CSIC 博士前奖学金的支持。Martín-Blanco 实验室的研究由国家优秀科学与技术研究促进计划（BFU2014-57019-P 和 BFU2017-82876-P）以及拉蒙·阿雷塞斯基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析软件 | - | ImageJ | 数据分析 |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | 用于数据采集的品系 |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | 用于数据采集的品系 |
| Dumont 5 镊子 | FST | 11251-20 | 直径 1.5 mm，用于解剖 |
| 玻璃底培养板 | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | 固定蛹以进行数据采集 |
| 卤碳油 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | 用于固定蛹 |
| 倒置共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM700 | 数据采集 |
| 体视显微镜 | Leica | DFC365FX | 解剖过程中观察蛹 |
参考文献
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