普帕尔阶段发育性皮瘤中组织定向和生长动力学的成像与分析

Summary

该协议旨在成像和分析果蝇在果蝇发生变质时，果蝇腹部上皮细胞定向和组织生长动力学。本文描述的方法可用于研究果蝇或其他模型生物体的不同发育阶段、组织和亚细胞结构。

Abstract

在多细胞生物体中，成熟的组织和器官在其组成细胞的空间排列中表现出高度的秩序。感官上皮给出了一个显著的例子，其中相同或不同身份的细胞通过细胞粘附性（显示高度组织的平面模式）聚集在一起。单元格以相同的方向相互对齐，并在较大距离内显示等效极性。成熟的上皮体组织是在形态形成过程中建立的。为了理解成熟上皮的平面排列是如何实现的，在体内发育过程中以高时空保真度跟踪细胞方向和生长动力学至关重要。强大的分析工具对于识别和描述本地到全球的过渡也至关重要。果蝇小狗是一个理想的系统，用于评估定向细胞形状变化的基础上皮形态发生。上皮发育的皮毛构成不动体的外表面，允许对完整动物进行长期成像。此处描述的协议旨在成像和分析在皮球腹部表皮生长时全球和局部水平的细胞行为。所述方法可轻松适应其他发育阶段、组织、亚细胞结构或模型生物体的细胞行为成像。

Introduction

为了发挥自身的作用，上皮组织完全依赖于其细胞成分的空间组织。在大多数上皮上，细胞不仅相互挤合，以形成精确的鹅卵石层，而且相对于身体轴的方向。

精确组织组织的功能重要性在感觉上皮中显而易见，如脊椎动物内耳和视网膜。在第一种情况下，头发和支撑细胞以特定的轴向方向对齐，以有效感知机械输入，如声音和运动^11、22。同样，光受体细胞空间组织对于通过视网膜³实现最佳光学特性至关重要。因此，细胞位置和方向的空间控制对于适当的生理功能具有特别重要的意义。

果蝇是一种全息昆虫，通过蜕变，对幼虫体结构进行完全转化，导致其成年组织。果蝇pupa是一个优秀的模型，用于各种动态事件的非侵入性活成像，包括发育细胞迁移^4、细胞分裂和生长动力学^5、肌肉收缩^6、细胞死亡^7、伤口修复⁸和细胞定向^9。在成人果蝇中，外部上皮表现出高度的秩序。这很容易观察到的三角....

Protocol

注:该协议分为五个步骤:（1） 暂存小狗，（2） 准备小狗成像，（3） 生长的腹部上皮的活成像，（4） 生成遗传马赛克，（5） 数据处理和分析（包括描述如何从细胞结轮廓分析细胞方向动力学和细胞克隆的生长动力学的部分）。

1. 成像前分期使用果蝇小狗

1. 产卵（AEL）后，在25°C（±12小时）的塑料小瓶中培养标准基的相应基因型，5天（±12小时）。
   注:在幼虫形成（APF）后，在120 h AEL下，在第三颗恒星幼虫的禁闭范围内开始蜕变。这种过渡很容易识别，因为幼虫停止喂食和移动，并在0-12 h APF下形成操作区域（图1A）。紫杉最初是软和白色的，但逐渐变硬和晒黑。
2. 使用湿润的画笔将白色预食 （0 h APF） 转移到新鲜的塑料小瓶中。动物可以保持在不同的温度根据设计的实验，直到所需的年龄。
   注:Pupa形成（即，小狗）发生在12小时APF，当成人苍蝇的头部和附属物完全被避开时（图1A）。此时，pupal 大小箱与 pupa 完全分离，允许其完全删除（图 1A）。

....

Results

上述协议包括为长期活体成像制备果蝇小狗，以及分析腹部表皮细胞取向和生长动力学的程序。通过应用这种方法，可以生成发育中的普帕的高分辨率电影，时间长达48小时，而不会显著光漂白或光毒性。图4显示了描绘不同时间点和从不同角度方向的pupae的腹部表皮（例如，组织爆炸和LECs）的快照。对这些电影的后续分析能够识别和量化在扩容和更换LEC期间调整的主要几何和形状参数中局部和全局变化的动态。这些分析可以在不同的场景和特定的突变背景中执行。它们还可用于基因表达改变的克隆，导致功能条件的自主丧失或增益。这将允许探索周围细胞中的非自主反应，促进交叉通话或细胞通信机制的识别（图5）。这种方法最近被用于识别脂肪/达奇苏/四个连接通路作为关键元素指导和定向细胞对齐期间部署的平面极性模式的腹部表皮^{的成人9。}

Discussion

远程顺序是大多数功能性生理单元的基本特征。在形态生成过程中，通过集成以高时空精度实现的复杂指令来实现顺序。多级和多级约束被集成到定型的组织安排中。

极性和定向性对于开发过程中的有序空间排列至关重要。极性意味着在开发过程中对称性断裂。实现不对称是必要的，以确定胚胎前背（A/P）和多索温托（D/V）轴和成人组织^26。除了这种早期作用之外，局部不对称对于各级的形态多样性至关重要。定向性是形态发生过程中不对称和极性的重要补充。全局顺序是通过单元以精确感知或定向在细胞到细胞基座上感应和传输信号的能力实现的。单细胞不对称通过定位空间特定方向的位置或运动，随着时间的推移协同协调。细胞通信涉及分泌因子、细胞接触和机械输入。信号作用于首先在本地进行然后全局修改其行为的单元格区域^27。

本文提出了一种简单的方法来分析单个细胞的协调行为，包括其平面方向和组织秩序发展过程中的生长参数。与其它等效型号（如细菌带延伸/回缩^2.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
分析软件	-	ImageJ	分析数据
Drosophila<	em>Atpa：：GFP		-Strains用于数据收集
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	用于数据收集的菌株
Dumont 5 镊子	FST	11251-20	直径 1.5 毫米，用于解剖
玻璃底板	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	用于数据收集的安装蛹
卤烃油 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	安装蛹
倒置共聚焦显微镜	蔡司	LSM700	数据收集
立体显微镜	Leica	DFC365FX	解剖过程中蛹的可视化