使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

摘要

本实验方案的目的是在哺乳动物胃肠道中观察白色念珠菌（Candida albicans）的细胞形态及其定位。

摘要

Candida albicans 是人类及许多其他哺乳动物肠道微生物群中的真菌组分。尽管在大多数定植宿主中 C. albicans 不引起症状，但这种共生菌库仍可作为感染性疾病的储存源，且肠道内真菌高滴度与炎症性肠病相关。本文介绍一种在稳定胃肠道定植的小鼠模型中可视化 C. albicans 细胞形态及其定位的方法。通过向经口服抗生素处理的动物单次给予 C. albicans 建立定植模型。肠道组织片段以特定方式固定，以保存管腔内容物（微生物和黏液）以及宿主黏膜的结构。最后，使用针对真菌rRNA的探针进行荧光原位杂交，以标记 C. albicans 及其菌丝。该方案的一个关键优势在于，能够在胃肠道定植过程中同时观察 C. albicans 的细胞形态及其与宿主结构的空间关系。

引言

Candida albicans 是一种真菌共生体，同时也是一种机会性人类病原体。这种酵母菌缺乏明确的环境生态位，主要在人类和其他哺乳动物的胃肠道（GI）道、皮肤以及泌尿生殖道内增殖¹。尽管早期对 C. albicans 的研究主要集中在其致病潜力上，但近年来多项研究表明，在肠道内以共生方式增殖的微生物可能在宿主正常健康中发挥重要作用，包括宿主免疫系统的发育^2,3,4。为了促进对 C. albicans 在哺乳动物肠道内共生关系的研究，我们建立了一种稳定胃肠道定植的小鼠模型，并开发了一种基于荧光原位杂交（FISH）的方法，用于可视化肠腔内的真菌酵母细胞和菌丝。

除少数例外情况外⁵，实验室饲养的小鼠通常对消化道真菌定植具有抗性。这种定植抗性被认为由特定的细菌种类介导；然而，通过使用抗生素处理动物^6,7，或采用可改变细菌种类组成的化学成分明确的饮食，可克服这种抗性^8,9。类似地，在人类中，广谱抗生素的使用与C. albicans的过度生长和播散相关¹⁰。我们的小鼠定植模型利用广谱抗生素在免疫功能正常、常规饲养的小鼠中建立C. albicans的定植。在经口灌胃接种10⁸个菌落形成单位（CFUs）的C. albicans前一周，将青霉素和链霉素加入动物的饮水中，持续给药一周。只要继续提供含抗生素的饮水，C. albicans就会在胃肠道内持续增殖，粪便中的滴度可达10⁶−10⁸ CFUs/g。尽管真菌定植水平较高，动物仍保持健康状态，并且体重增长速度与未感染的对照组相同。该模型已成功用于筛选和鉴定多种C. albicans共生相关因子^11,12。

与其他真菌界成员一样，C. albicans 具有极强的形态可塑性¹³。在体外条件下，已观察到其可在至少六种单细胞酵母形态之间转换，同时还可形成多细胞的菌丝和假菌丝。其中，酵母相向菌丝相的转化是其最明确的毒力特征之一，且在大多数哺乳动物疾病模型以及人类感染组织中，菌丝和假菌丝均占主导地位。为了确定 C. albicans 在小鼠消化道内的定位及其细胞形态，我们开发了一种荧光原位杂交（FISH）技术，用于对固定组织切片中的酵母和菌丝进行染色。该技术所用探针为荧光标记的DNA寡核苷酸，可与真菌23S核糖体RNA（rRNA）杂交，而rRNA广泛分布于真菌细胞质中。由于宿主组织以保留肠道三维结构的方式进行固定，包括宿主黏膜、消化内容物、肠道腔内的细菌微生物群以及黏液层，因此在染色后，该技术可实现真菌细胞相对于这些解剖标志物的精确定位。与传统的真菌组织学染色方法（如过碘酸-希夫染色法（PAS）或戈莫里六胺银染色法（GMS））以及市售的抗真菌抗体相比，该FISH技术具有明显优势，因为这些试剂并不特异针对 C. albicans。此外，常规固定剂会去除黏液层，并破坏肠道腔内其他成分的结构^14,15。

本文提供了建立小鼠胃肠道中高程度 C. albicans 定植的详细操作步骤，包括对安乐死动物进行消化道解剖、以保持管腔结构完整性的方式进行组织固定，以及利用荧光原位杂交（FISH）技术检测宿主组织内的 C. albicans。除了野生型和 C. albicans 突变株外，灌胃技术还可用于递送其他微生物。该组织固定方法适用于任何需要保存肠道内容物的研究。FISH 操作可在一天内完成，并可通过使用多种不同标记的探针来实现多种真菌物种的定位。

方案

以下步骤已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 通过口服灌胃使小鼠胃肠道定植C. albicans

1. 根据当地实验动物管理和使用委员会（IACUC）的批准，为18−21 g的雄性或雌性小鼠（8−10周龄）提供饲养环境。从第一天起使用经高压灭菌的食物和水。
   注意：使用灭菌的笼具、垫料、食物和水可降低与抗生素耐药性环境细菌污染的风险，这些细菌可能将肠道中的C. albicans排挤掉。此外，根据实验目的，应考虑单独饲养动物，因为小鼠具有食粪行为，同笼饲养的动物会共享肠道内容物。
2. 次日，将高压灭菌的饮用水更换为含有5%葡萄糖、1,500 U/mL青霉素G和2 mg/mL链霉素的高压灭菌水。
3. 为方便起见，提前配制200倍抗生素储备液（表1），经滤膜除菌后于-20 °C保存。
4. 让动物持续服用抗生素一周。
   1. 在开始使用抗生素后的第3天和第6天，检测每只动物粪便中是否存在耐抗生素的好氧细菌污染。用一只手固定小鼠，将未加盖的微量离心管靠近肛门，收集至少一个粪便颗粒。
   2. 将每个粪便颗粒重悬于1 mL无菌水中，取100 µL涂布于Luria肉汤（LB）、酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）或脑心浸液（BHI）加血琼脂平板上。在37 °C的标准培养箱（非厌氧条件）中过夜培养，并观察细菌生长情况。
      注意：平板上应仅有极少菌落生长（0−20个菌落）。若从接受青霉素和链霉素处理的动物中回收到>20个细菌菌落，则表明难以建立高水平的C. albicans定植，应终止实验。
5. 灌胃前3天，将冻存的甘油菌种中的C. albicans划线接种至含2%琼脂的YEPD平板，于30 °C培养2天。
6. 灌胃前1天，将待测的每种C. albicans菌株挑取单菌落接种至5 mL液体YEPD培养基中，于30 °C振荡培养过夜。
7. 灌胃当天早晨，将C. albicans饱和培养物用预热至30 °C的100 mL YEPD培养基稀释至600 nm处的光密度（OD₆₀₀）为0.1。在30 °C下以200 rpm振荡培养4至5小时，直至OD₆₀₀达到1（对数中期生长）。
8. 将每份100 mL培养物转移至两个50 mL锥形管中，在室温（RT）下以3,000 × g离心5分钟。
   注意：C. albicans在室温下增殖相对较慢。若将本方案用于其他物种，可能需要将接种物置于冰上以防止继续生长。
9. 弃去上清液，将沉淀细胞用每50 mL培养物体积对应的20 mL无菌生理盐水重悬，并将两份重悬液合并至同一锥形管中。在3,000 × g下离心5分钟。
10. 弃去上清液，用20 mL无菌生理盐水重悬细胞。短暂涡旋混匀，取出20 µL用于OD₆₀₀测定。用无菌生理盐水按1:50稀释后测定。将剩余重悬细胞在3,000 × g下离心5分钟。
11. 弃去上清液。为达到1 × 10⁸ CFU的接种量，根据OD₆₀₀测定估算的浓度，将沉淀细胞重悬于无菌生理盐水中，终浓度约为5 × 10⁸ CFU/mL。
    注意：通常，OD₆₀₀为1时对应约1 × 10⁷酵母细胞/mL。该数值可能因分光光度计不同而有所差异，应进行验证。若需调整其他微生物感染时的接种浓度，应规划接种体积不超过10 µL/g小鼠，以尽量减少动物不适。
12. 通过血球计数板对1:1,000稀释液进行细胞计数，验证接种物浓度。根据血球计数板测定的浓度调整实际灌胃的细胞体积。
13. 使用动物灌胃针（图1A），按照计算好的体积对每只动物进行灌胃。灌胃操作详见步骤1.13.1−1.13.8。
    注意：灌胃操作应由经验丰富的人员进行培训，并提前熟练掌握。单只动物的成功操作通常不超过1分钟。
    1. 将高压灭菌的动物灌胃针连接至1 mL注射器，吸入一个灌胃剂量的液体，并排除所有气泡，以防剂量不准确。将注射器置于无菌表面上。
    2. 固定待灌胃动物。用优势手握住动物尾根部，非优势手沿背部向前滑动至耳后松弛皮肤处。
    3. 用非优势手的食指和拇指紧紧捏住该处松弛皮肤，即“颈背部抓握”（scruff）。提起动物，用同一只手的小指勾住尾巴，使动物固定于手掌中。轻柔地伸展动物头部，使其头、身体（从而颈部和食道）呈一条直线。
       注意：若动物身体弯曲或扭曲时进行灌胃，可能导致食道穿孔等并发症，甚至死亡。
    4. 用优势手拿起注射器，使其垂直于动物，弯曲针头朝下（图1B）。用针头球部轻柔钩住口腔内侧角落，沿口腔侧壁缓慢推进至咽喉后部，最后将针头移至中央位置。
       注意：沿侧向路径插入针头有助于避开动物的牙齿和舌头阻力。
    5. 当针头球部到达咽喉后部时，将针头向上倾斜，使其与动物身体轴线平行（图1C）。
       注意：此时动物会出现吞咽反射，这是针头位置正确的良好迹象，且吞咽动作有助于引导针头进入食道。若无吞咽反射，针头可能误入气管而非食道。应轻柔撤出针头，并返回步骤1.13.1重新操作。
    6. 让动物自然吞咽接种液，直至仅剩几毫米可见（图1D）。平稳推进针头。
       注意：若针头无法推进，切勿用力，以免损伤食道。有时最后半厘米的推进需要动物产生较强的吞咽反射。若感觉针头卡住，应缓慢撤出并从步骤1.13.4重新开始。
    7. 通过轻推活塞测试针头球部是否位于正确位置（胃内）。若无阻力，继续注入接种液。接种完成后，缓慢撤出针头。
    8. 将动物放回笼中，并持续观察5−10分钟，注意是否有呼吸困难或痛苦表现。确认动物在灌胃后很快恢复正常的活动状态。
    9. 若下一动物使用相同的接种液，应用酒精棉片清洁针头，并返回步骤1.13.1。若更换不同接种液，则应使用新针头并返回步骤1.13.1。
       注意：灌胃后第二天必须检查动物状态。出现痛苦症状（如弓背、呼吸困难）的动物应实施人道安乐死，因其很可能发生了食道破裂、肺部损伤或其他无法恢复的内部伤害。
14. 动物灌胃后，对接种物进行系列稀释并涂板，以验证接种剂量。
    1. 制备10倍系列稀释液，最高稀释至1:10⁵。取1:10⁵稀释液的一个灌胃体积涂布于100 mm沙保葡萄糖琼脂平板。
    2. 在30 °C培养2天。计数CFU以确认接种剂量。

2. 组织学用胃肠道组织的制备

注意：本实验方案的此部分改编自 Johansson 和 Hansson¹⁶。

1. 为每2只解剖的动物，在一个大的带螺帽塑料瓶中配制500 mL甲醇-氯仿-醋酸固定液（methacarn溶液，60%甲醇、30%氯仿、10%冰醋酸）。
   注意：甲醇和氯仿吸入后有害，应在化学通风橱中操作。冰醋酸具有腐蚀性，应佩戴适当的个人防护装备进行操作。甲醇、氯仿和冰醋酸应作为危险废物妥善处理。
2. 在实验终点，根据当地IACUC批准的方案对动物实施人道安乐死。
   备注：在抗生素处理的动物中，C. albicans的定植量通常在第5天约为~10⁶ CFU/g，到第25天可达~5 × 10⁷ CFU/g。
3. 用10%次氯酸钠溶液对解剖工具进行灭菌，并用70%乙醇冲洗。
4. 将每只动物腹侧朝上固定在解剖台上。使用30 G针头将四肢固定在解剖台表面（图2A）。用70%乙醇喷洒动物体表，以清洁毛发并减少组织粘连工具。
5. 用钝头镊子以非优势手持镊夹住腹部皮肤的一段，用优势手持剪刀在骨盆基部附近切开皮肤及皮下筋膜。沿腹腔两侧呈U形切口向上延伸至肋骨区域。将皮肤掀开以暴露腹腔。
6. 使用铅笔预先标记用于组织学分析的胃肠道各段对应的组织学包埋盒。例如，为每只动物分别标记为“胃”、“近端小肠”、“中段小肠”、“远端小肠”、“盲肠”和“大肠”的独立包埋盒。在每个包埋盒底部放置一块泡沫垫（图2A）。
   备注：图2B展示了建议放入包埋盒中的组织切片区域。
7. 用钝头镊子轻轻将盲肠从腹腔中取出。使用剪刀切断盲肠与小肠和大肠之间的连接。
   备注：盲肠组织非常脆弱，容易破裂，操作时需格外小心。
8. 将整个盲肠放入组织学包埋盒中，确保其无扭曲且平铺放置（图2C）。在上方覆盖第二块泡沫垫并关闭包埋盒。将包埋盒放入盛有methacarn溶液的螺帽瓶中。
9. 切除一段包含1−2粒粪便颗粒的大肠组织，其长度应小于包埋盒的尺寸。
10. 将组织片段放入包埋盒中，保持组织平展无扭曲。覆盖第二块泡沫垫并关闭包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。
11. 对于需要取样的每一段小肠，切除一段1−2 cm长、含有部分消化内容物的肠段。
12. 将该肠段放入组织学包埋盒中，保持组织平展无扭曲。覆盖第二块泡沫垫并关闭包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。
13. 对于胃组织，切断其与食管和小肠的连接。将胃放入包埋盒中，保持组织平展无扭曲。覆盖第二块泡沫垫并关闭包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。
14. 将包埋盒置于methacarn溶液中，在室温下固定至少3小时，但不超过2周。
    备注：固定后的胃肠道组织可在多个阶段送至商业组织学服务机构处理。这些组织在切片过程中容易因腔内容物扰动而受损，最佳结果需由经验丰富的技术人员完成。如果商业服务机构愿意在石蜡包埋前对组织进行清洗，则可在此阶段将包埋盒连同步骤2.16的操作说明一并寄送。
15. 在预热至70 °C的杂交炉中，将足量石蜡放入大烧杯内开始熔化，确保能覆盖所有组织包埋盒。
16. 固定完成后，取出泡沫垫，将完整组织段重新放回原包埋盒中。在室温下振荡条件下依次用以下溶液洗涤：100%甲醇洗两次，每次35分钟；100%乙醇洗两次，每次25分钟；二甲苯洗两次，每次20分钟。
    注意：二甲苯易燃、有毒，吸入可造成损害。应在化学通风橱中佩戴适当防护装备操作。二甲苯须按危险废物程序处理。
17. 用纸巾轻轻吸干包埋盒表面液体，随后将其置于70 °C杂交炉中的预熔石蜡中浸润2小时。确保包埋盒完全充满石蜡且无气泡残留。
    备注：此步骤使石蜡充分渗透胃肠道组织，稳定组织结构及其内容物。
18. 从石蜡中取出包埋盒，让多余石蜡自然滴落，于室温保存直至包埋成蜡块。含微量二甲苯的废弃石蜡应作为危险废物处理。
    备注：Noble实验室采用商业组织学服务进行组织包埋与切片。为常规观察C. albicans酵母相和菌丝相，使用4 µm厚切片。为评估通常跨越多个切面的菌丝连接性，可使用8 µm厚切片。根据FISH探针在样本中的穿透能力，也可能使用更厚的切片。

3. 新设计探针的验证

注意：以下用于验证 C. albicans 探针的实验方案改编自 Swidsinski 等人¹⁷。

1. 划线 C. albicans SC5314 及其密切相关的对照物种（例如， 都柏林假丝酵母，热带假丝酵母) 转接到 YEPD + 2% 琼脂平板上，在 30 °C 培养 1−2 天。
2. 接种单个菌落至5 mL液体YEPD培养基中。
3. 将1 mL悬浮细胞用移液器转移至微量离心管中，以3,000 x g 5 分钟。弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
5. 用移液器吸取5−10 µL重悬的细胞，滴加到玻璃载片上，铺展成较大的圆形，静置干燥。
   注意： 若细胞不贴壁，应使用多聚-L-赖氨酸包被的载玻片。
6. 用PAP笔圈出细胞点样区域，并加入50 µL含2.5%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液覆盖。室温孵育10分钟。
   警告： PFA 具有可燃性，吸入或与皮肤接触可能引起健康问题。被 PFA 污染的物品应作为危险废物处理。
7. 用 PBS 洗涤 3 次。将液体轻拍至纸巾上，加入 100 µL PBS 覆盖。重复两次。弃去最后一次洗涤液。
8. 为长期保存制备载玻片。若当天进行FISH实验，则无需执行本节步骤，直接进入步骤3.9。
   注意： 最好立即进行杂交，但如果时间紧张，可在储存前先执行步骤3.8。载玻片可在4 °C下保存数天。
   1. 用60%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液。
   2. 用80%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液。
   3. 用100%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液，进行步骤3.9。
9. 将载玻片置于杂交炉中，50 °C下孵育1小时，不加盖。若已执行步骤3.8，则将载玻片于4 °C保存；若未执行，则继续进行步骤4.2，实施杂交实验方案。

4. 消化道组织中的FISH染色

1. 脱蜡石蜡包埋的组织切片。
   1. 在杂交炉中，将装有二甲苯的考林罐预热至 60 °C。
   2. 将载玻片插入装有二甲苯的罐中，于 60 °C 放置 10 分钟。弃去二甲苯洗涤液。保持载玻片在罐内，将二甲苯倒入废液容器中。
   3. 向罐中加入新鲜的室温（RT）二甲苯，于 60 °C 孵育 10 分钟。弃去第二次的二甲苯洗涤液。
   4. 用 100% 乙醇充满罐子，在室温下孵育 5 分钟。将载玻片从罐中取出，空气干燥。
   5. 将杂交炉设定为 50 °C，用于第 4.2 节中的步骤。
2. 使用 FISH 探针染色 C. albicans。
   1. 配制 1 mL 新鲜杂交溶液（20 mM Tris–HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl，0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]，1% 甲酰胺溶于无 RNase 水中）。样品计算参见 表 1。
   2. 将 50 µL 杂交溶液与 1 µL C. albicans 探针（5’ Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3’；50 µg/mL 溶于无 RNase 水中）混合，使每张载玻片最终探针量为 0.5 µg。
      注意：许多实验室培育的小鼠其微生物群中不含任何真菌。在此情况下，可使用广谱真菌探针（5’ Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3’），该探针可识别大多数真菌物种的 23S rRNA，而不仅限于 C. albicans。根据作者经验，广谱真菌探针的染色亮度高于 C. albicans 特异性探针。
   3. 避光保护溶液，并预热至 50 °C。
   4. 使用 PAP 笔，在第 4.1 节的组织切片周围画一圈。
   5. 用移液器吸取 50 μL 含探针的杂交溶液滴加到固定组织上，并用枪头轻轻铺展覆盖整个组织切片。覆盖杂交盖玻片，确保避免产生气泡。
   6. 将载玻片密封于防水杂交盒中，在杂交炉内 50 °C 黑暗条件下孵育 3 小时。
   7. 同时，配制 50 mL FISH 洗涤液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl 溶于无 RNase 水中）。样品计算参见 表 1。
   8. 将洗涤液转移至 50 °C 预热。
   9. 3 小时后，将洗涤液加入考林罐中。然后用镊子小心移除载玻片上的盖玻片，并将载玻片放入洗涤液中。
   10. 用铝箔覆盖罐子，在 50 °C 孵育 20 分钟。
   11. 在此孵育期间，配制黏蛋白-细胞核染色液（20 ng/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]，1.6 µg/mL 异硫氰酸荧光素 [FITC]-凝集素溶于 PBS 中）。样品计算参见 表 1。对于胃和大肠，使用 FITC-Ulex europaeus 凝集素 1（UEA-1）；对于小肠和盲肠，使用 FITC-UEA-1 与 FITC-小麦胚芽凝集素（WGA）的组合。
       注意：来自不同物种的凝集素可识别糖蛋白（如黏蛋白）上不同的糖基修饰。此处推荐的凝集素组合是通过实验确定的，适用于不同胃肠道区段中黏液的最佳染色效果。
   12. 通过倾倒去除 FISH 洗涤液，并用室温 PBS 重新充满罐子。立即倒出 PBS 并再次充满，共进行两次洗涤。
   13. 用精细擦拭纸吸去多余的 PBS，并用 PAP 笔在肠组织切片周围画圈。将载玻片放入不透明塑料容器中，向组织切片加入 50 µL 黏蛋白-细胞核染色液。用铝箔覆盖容器以避光。在 4 °C 孵育 45 分钟。
   14. 将载玻片放入考林罐中，在室温下用 PBS 快速洗涤两次。
   15. 在纸巾上轻拍去除多余 PBS，再用擦拭纸吸去最后的 PBS 液滴。
   16. 在每个切片上滴加一滴封片剂，覆盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。让封片剂在盖玻片下充分展开。如需立即成像，可用指甲油在盖玻片四角固定；如需长期保存，则用指甲油沿盖玻片边缘密封。
   17. 使用荧光显微镜对载玻片进行成像。

结果

按照所提供的操作步骤，该技术的结果将是宿主上皮、黏液以及胃肠道组织切片中 C. albicans 的细胞核呈现荧光标记。野生型 Candida albicans 细胞应表现为圆形的单细胞酵母形态，或为高度伸长、有时分枝的多细胞菌丝形态（菌丝中的细胞分裂不会明显可见）。C. albicans 的突变株还可能表现为较小、轻微伸长的“灰色”酵母，或较大、轻微伸长的“GUT”（胃肠道诱导转变）酵母或“不透明”（opaque）酵母。

图1展示了用于灌胃的喂养针，以及灌胃过程中针头的关键位置。图2展示了一种典型的小鼠器官解剖装置，以及小鼠胃肠道各段的外观。

图3展示了白色念珠菌（C. albicans）不同细胞类型在体外及小鼠模型内增殖后的FISH染色结果。图3A显示了经固定、透化处理的体外增殖菌丝的荧光与相差图像。菌丝的形成是通过在37 °C下使用含2% N-乙酰葡糖胺、pH 6.8的液体Lee培养基诱导的¹⁸。图3B显示了经固定、透化处理的体外增殖酵母细胞的荧光与相差图像。图3C,D分别显示了经固定、透化处理的体外增殖GUT细胞和暗色型（opaque）细胞。GUT细胞与暗色型细胞在形态上难以区分，除非通过扫描电子显微镜观察。请注意，若体外增殖细胞未充分透化，其FISH染色效果将不理想，图3C中即展示了一个染色弱且弥散的示例。为获得最佳结果，应针对每种待研究的细胞类型和物种，通过实验经验确定细胞固定和透化的条件。幸运的是，用于在组织切片中观察C. albicans的推荐方案可实现更一致的透化效果。

图3E-G展示了小鼠大肠内的C. albicans，分别使用C. albicans-特异性探针（图3E）或广谱真菌探针（图3F,G）进行染色。C. albicans在图像中呈红色，宿主细胞核呈蓝色，黏液层呈绿色。大肠中同时存在圆形酵母细胞和高度伸长的菌丝（白色箭头）。请注意，使用广谱真菌探针染色的信号更强。图3G展示了在同一部位中使用广谱真菌探针染色的ume6突变株。Ume6编码一种转录因子，在体外条件下是菌丝形成所必需的¹⁹。有趣的是，该突变株在体外表现出的酵母锁定表型在肠道内并未重现，提示在宿主体内可能存在冗余因子被激活¹²。图4展示了野生型C. albicans在小鼠胃肠道不同区段的形态，包括紧邻宿主黏膜的区域以及肠腔更中心的区域。

图1：灌胃过程中关键的喂食针位置。（A）喂食针。（B）喂食针的球部插入舌侧。（C）喂食针保持直立并插入食管。（D）喂食针插入胃内，鼻部上方可见数毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：解剖布局示例。（A）解剖板与工具。（B）取出的胃肠道。从近端（食管）到远端（肛门）的各段：I. 胃；II. 近端小肠；III. 中段小肠；IV. 远端小肠；V. 盲肠；VI. 大肠。粉红色虚线框标示需固定的组织。（C）组织在包埋盒中的摆放位置。罗马数字与B图中的标注一致。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：FISH染色的代表性图像 C. albicans. (A) FISH检测 C. albicans 在液体Lee培养基中生长的菌丝¹⁸ 含2% N-乙酰葡萄糖胺，pH 6.8。B) 荧光原位杂交（FISH）的 C. albicans 在YEPD + 2% 琼脂平板上培养的圆形酵母细胞。C) FISH检测 C. albicans 在 YEPD + 2% 琼脂平板上培养的 GUT 细胞（ySN1045）。D) 荧光原位杂交（FISH）的 C. albicans 在 YEPD + 2% 琼脂平板上培养的不透明细胞。E野生型 C. albicans （ySN250）在大肠中的表达，经染色后 白色念珠菌-特异性探针。 (F野生型 C. albicans 在用广谱真菌探针染色的大肠中。G) Ume6 大肠中突变体（ySN1479）经全真菌探针染色：红色为 C. albicans，蓝色为宿主上皮细胞核，绿色为黏蛋白。箭头表示菌丝，箭头指示酵母。比例尺 = 20 µm。图像 F 和 G 改编自 Witchley 等人。¹². 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4：FISH 染色的 C. albicans 在不同肠道区段中的形态。 显示野生型 C. albicans 在小鼠胃肠道各指定区段的分布情况。在每个区室中，图像分别展示邻近宿主黏膜的区域和肠道管腔中央区域。染色使用广谱真菌探针进行。比例尺 = 20 µm。图像改编自 Witchley 等人¹²。请点击此处查看该图的放大版本。

抗生素储备液（200倍）
青霉素G	181 mg/mL
链霉素	400 mg/µL
Methacarn
储备液	终浓度	体积	单位
甲醇	60%	300	mL
氯仿	30%	150	mL
冰醋酸	10%	50	mL
杂交溶液
储备液	终浓度	体积	单位
1 M Tris-HCl, pH 7.4	20 mM	20	µL
5 M NaCl	0.9 M	180	µL
10% SDS	0.10%	10	µL
100% 甲酰胺	1.00%	10	µL（使用间期保存于-20 °C的小份 aliquots 中）
无RNase水		780	µL
FISH洗涤液
1 M Tris-HCl, pH 7.4	20 mM	1	mL
5 M NaCl	0.9 M	9	mL
无RNase水		40	mL
黏蛋白-细胞核染色液
DAPI, 10 µg/mL	20 ng/mL	2	µL
凝集素, 40 µg/mL	1.6 µg/mL	40	µL
PBS, pH 7.4		958	µL

表1：本实验方案中常用溶液的体积和浓度。

讨论

此处所述方法可用于可视化 C. albicans 在任何性别或品系的共生定植小鼠的胃肠道中，均可观察到酵母和菌丝。该FISH探针可与分布于真菌细胞质中的23S rRNA杂交。本方法改编自先前报道的用于可视化肠道细菌的实验方案。²⁰。因为 C. albicans 在宿主内形态发生变化，该方法可用于监测真菌细胞形态及定位。例如，我们已利用此方法推翻了酵母菌在整个消化道中占主导地位的假说，并揭示了某些“成丝缺陷型”突变株在体内与体外表型之间的差异¹².

目前存在多种用于研究C. albicans共生定植的小鼠模型。实验室小鼠与人类的微生物群存在显著差异，因此在小鼠中建立稳定的定植需要使用抗生素或特殊饮食。抗生素治疗同样会增强C. albicans在人类中的定植，并且是播散性感染的主要危险因素¹⁰。本研究中使用的抗生素相对便宜，并能可靠地减少细菌微生物群。需注意的是，抗生素的作用是降低拮抗性细菌物种的负荷，而非完全清除动物体内的所有细菌。如果研究人员希望在无细菌条件下研究C. albicans与宿主的相互作用，或希望避免使用抗生素或特殊饮食，可用无菌动物替代常规饲养动物；然而，无菌小鼠存在某些免疫和解剖学异常，因此可能不适用于所有研究目的。

成功的FISH染色有几个关键步骤：推荐的固定方法对于保持胃肠道组织的结构完整性至关重要，特别是肠道腔内容物（如黏液层以及真菌和细菌的三维结构）较为脆弱¹⁶。请注意，许多常用的含水固定液会对腔内结构造成严重破坏。本方案推荐使用的固定剂及后续洗涤溶液均不含水，因此必须避免与水接触造成污染。另一个关键步骤是杂交过程，在杂交炉中孵育载玻片时，必须防止杂交溶液蒸发。我们建议将载玻片置于密封防漏的容器中以避免此问题。此外，也可使用密封的杂交盒，例如最初用于微阵列杂交的杂交盒。

A C. albicans-特异性的FISH探针在本方案中有所描述. 然而，由于许多实验室饲养的小鼠并不含有 C. albicans 或作为其天然肠道微生物群组成部分的其他真菌，泛真菌探针可特异性染色 C. albicans 在实验定植动物中。由于泛真菌探针具有更优的杂交特性和更高的信噪比，使用该探针可能是更理想的选择。若将泛真菌探针用作假特异性探针，则 C. albicans，记录未感染动物中无染色情况非常重要（即，经抗生素处理但未感染的动物） C. albicans). 对未定植的对照动物进行染色也有助于评估背景染色，这种背景染色可能源于FISH探针与食物颗粒的非特异性结合。总体而言，与其他真菌染色方法（如Calcofluor white染色法（可染色几丁质，即细胞壁成分，其在不同细胞类型中可能有所差异）、GMS染色法或市售抗真菌抗体）相比，FISH探针具有更高的特异性。此外，利用针对不同物种特异性rRNA标记的差异化FISH探针，可实现多种生物体的共染色。

该技术的一个局限性在于，某些白色念珠菌（C. albicans）酵母细胞类型在FISH检测中表现得非常相似（例如，不透明型和GUT型细胞类型）。为了区分这些细胞类型，开发针对细胞类型特异性真菌mRNA的杂交探针将具有重要意义。尽管如此，现有的FISH技术已揭示出在体内和体外条件下评估的C. albicans突变株行为之间存在令人意外的差异¹²，表明在自然共生环境中存在复杂的相互作用，而这些相互作用无法被当前的体外实验充分模拟。在更多野生型和突变型宿主中对不同C. albicans菌株进行进一步研究，有望进一步揭示真菌与宿主之间的相互作用机制。特别是，在炎症性肠病模型中对C. albicans进行分析将具有重要指导意义，因为该疾病在人类中与高水平的C. albicans滴度相关²¹，以及其他C. albicans过度生长和疾病模型中的研究。FISH技术还可与免疫组织化学结合，用于标记特定的宿主细胞。总体而言，本文所述方法为确定C. albicans在哺乳动物胃肠道内的定位和形态提供了一种相对快速且可靠的手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	309659	可由任意供应商提供替代品
BHI 血琼脂			可由任意供应商提供替代品
C. albicans FISH 探针	IDT DNA Technologies	定制订购
杂交孵育用腔室			防水腔室，用于减少蒸发
氯仿	Sigma	C2432	>=99.5%
DAPI	Roche	10236276001	可由任意供应商提供替代品
精密擦拭纸巾	Kimberley-Clark	34256CT	Kimwipes
D-葡萄糖	Sigma	G7021-5KG	可由任意供应商提供替代品
乙醇	Sigma	E7023	分子生物学级
饲喂针头	Cadence, Inc.	7910	金属材质；20 X1-1/2" W/2-1/4；可高压灭菌消毒
FITC-UEA-1	Sigma	L9006-1MG	其他荧光染料可选
FITC-WGA	Sigma	L4895-2MG	其他荧光染料可选
泡沫垫	Fisher	22038221	订购适合放入盒式夹具的泡沫垫
甲酰胺	Sigma	47671	分子生物学级
冰醋酸	Macron Fine Chemicals	MK881746	ACS 试剂，>=99.5%
玻璃 Coplin 染色缸	Fisher	08-815	最多可并排容纳 10 张载玻片
组织学盒式夹具	Simport	M512	深型夹具，避免盲肠组织被压扁
杂交盖玻片	Sigma	GBL712222	无 RNase
杂交炉			可由任意供应商提供替代品
LB 培养基			可由任意供应商提供替代品
Lee 培养基			按 Lee 等人 1975 年所述方法配制
甲醇	Sigma	179337	ACS 试剂，>=99.8%
小鼠	Charles River Laboratories	028	成年 BALB/c 小鼠；18–21 克（8–10 周龄）
多聚甲醛	Fisher	50-980-487	16% 溶液
石蜡	Sigma	P3558-1KG	用于组织包埋的 Paraplast 石蜡
PBS，pH 7.4	UCSF 细胞培养设施培养基生产部	CCFAL003	无钙、无镁；可由任意供应商提供替代品
青霉素 G	Sigma	PENNA-100MU
沙保葡萄糖琼脂			可由任意供应商提供替代品
生理盐水	Baxter	2F7123	无菌，可由任意供应商提供替代品
氯化钠 (NaCl)	Sigma	S3014	可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Sigma	L3771	可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase
链霉素	Sigma	S9137-100G
Super PAP 笔	Life Technologies	8899	可由任意供应商提供替代品
Tris-HCl	Sigma	T3253	可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	不含 DAPI
二甲苯	Sigma	214736	试剂级
YEPD 培养基			可由任意供应商提供替代品