延时活体成像及快速树突分支动态在发育期 Drosophila 神经元中的定量分析

摘要

在此，我们描述了用于在活体样本中成像高度运动性树突丝状伪足的方法 黑腹果蝇 幼虫大脑，以及我们开发的用于定量分析延时三维成像数据集以评估发育中神经元树突动态的实验方案。

摘要

在神经元发育早期阶段，高度运动的树突丝状伪足广泛存在。这些具有探索性的动态分支会采样周围环境，并与潜在的突触伙伴建立初始接触。尽管树突分支动态与突触形成之间的关联已得到充分证实，但发育过程及依赖神经活动的过程如何调控树突分支动态仍不清楚。部分原因在于利用活体系统对这些精细结构进行活细胞成像和定量分析存在技术上的困难。我们建立了一种利用果蝇（Drosophila）幼虫腹外侧神经元（LNvs）研究树突动态的方法，该类神经元可通过遗传手段进行单细胞标记，并适用于活体成像。借助该系统，我们开发了实验流程，通过延时活体成像技术捕捉单个标记LNv完整树突分支结构的动态变化。随后进行图像后处理，包括漂移校正和去卷积，以提升图像质量，再通过标注所有分支末端的空间位置，在单一分支水平上分析其动态行为。最后，我们开发了R语言脚本（补充文件）和特定参数，利用末端轨迹生成的坐标信息对分支动态进行量化。综上所述，该实验方案使我们能够以高时间与空间分辨率，对神经元树突分支结构的动态行为进行详细的定量描述。我们所建立的方法可广泛适用于体外和体内条件下稀疏标记的神经元研究。

引言

树突是神经元中专门用于接收和处理感觉及突触输入的特殊区室。自发现以来，树突分支复杂而高度保守的结构一直受到广泛关注和深入研究。目前已建立多种模型系统用于研究神经元树突的发育、重塑及可塑性，其中包括Xenopus视顶盖神经元、鸡视网膜神经节细胞以及Drosophila系统中的树突分支化（da）神经元^1,2,3,4。Drosophila腹外侧神经元（LNvs）是一类视觉投射神经元，最初因其在调控果蝇行为节律中的重要作用而被发现⁵。研究还揭示，幼虫期的LNvs是幼虫光感受器（PRs）的直接突触后靶细胞^6,7。重要的是，将发育中的幼虫培养于不同光照条件下会显著影响LNvs树突分支的大小，表明LNvs是研究树突可塑性的理想新模型⁷。我们课题组近期的研究进一步表明，LNv树突的大小及其分支的动态行为均表现出依赖于经验的可塑性^8,

方案

警告：本实验方案涉及四类激光器的使用，需接受适当培训并严格遵守安全操作规程。避免眼睛或皮肤暴露于直接或散射的激光光线下。
注意：该实验方案包含六个步骤，工作流程如图1A所示。

1. 使用 Flip-out 技术标记单个神经元

注意：通过使用翻转酶（flippase）介导的随机标记方法，在单个LNv中表达mCD8::GFP，从而实现LNv的单细胞标记。果蝇品系的基因型为：hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13。获得单个标记LNv的频率约为10%。果蝇品系保存在标准培养基中，并置于温度为25 °C、光照节律和湿度受控的培养箱中。

1. 在授精后2小时内，于含酵母补充剂的葡萄汁平板上收集100-200枚卵。将胚胎在25 °C下培养24小时，并收集新孵化的一龄幼虫用于下一步操作。
2. 将新孵化的一龄幼虫在37.5 °C下进行....

结果

利用上述活体成像方案，我们获得了高分辨率的图像序列，用于后续分析与定量。 补充视频1展示了从一个代表性单标记LNv细胞采集的最大强度投影（MIP）图像序列。图2B展示了该图像序列中八个时间帧对应的拼接图。在两个图中，箭头表示突起延伸事件，箭头末端带短横线的标记（箭头标）表示回缩事件。

接下来，我们使用图像标注软件（材料表）对分支末端进行半自动化的4D追踪。图3B展示了来自一个代表性单标记LNv的动态分支末端的标注结果。通过该软件，我们可在三维空间中可视化图像堆栈，手动标记所有分支末端，并利用Spots模块追踪这些末端随时间的运动。该软件为每个标注的分支末端生成带时间戳的轨迹，用以直观呈现树突分支上的动.......

讨论

本文介绍了一种我们开发的实验方案，用于记录和量化果蝇（Drosophila）幼虫大脑中单个标记神经元树突分支的动态行为。值得注意的是，我们的活体成像方案包含特定参数，使我们能够完整捕获幼虫LNv神经元的整个树突分支结构，从而全面观察其树突分支的动态状态。然而，由于我们的量化方法高度依赖于对分支末端的标注，因此具有复杂树突结构和密集分支的神经元并不适合作为该分析的对象。

样本制备、图像采集和后期处理是本实验方案中的关键步骤。高质量的单个LNv原始图像对于准确量化树突动态至关重要。我们的数据表明，在仔细制备的幼虫脑组织离体样本中，LNv树突形态及其生理反应在解剖后30分钟内能够得到良好保存。若样本出现明显的脑组织退化、树突分支过度伸长或分支断裂，则不应用于成像和定量分析。尽管对于背景信号低且无明显移动的图像数据集而言，漂移校正和去卷积步骤可选，但我们强烈建议包含这两个步骤以提高图像质量，这对于分支末端的标注和自动斑点追踪尤为重要。除本研究中使用的商业软件外，ImageJ/Fiji中的Correct 3D drift（插.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Chameleon Vision II 多光子激光器	Coherent
高真空润滑脂	Dow Corning	79751-30
LSM 780 双光子激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss		直立式配置
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
软件
Excel	Microsoft		用于处理 .csv 文件
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	用于漂移校正和去卷积
Imaris	Oxford Instruments		用于三维可视化和图像标注
试剂
葡萄糖
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
蔗糖
TES