在此，我们描述了用于在活体样本中成像高度运动性树突丝状伪足的方法 黑腹果蝇 幼虫大脑，以及我们开发的用于定量分析延时三维成像数据集以评估发育中神经元树突动态的实验方案。
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摘要
摘要
在神经元发育早期阶段，高度运动的树突丝状伪足广泛存在。这些具有探索性的动态分支会采样周围环境，并与潜在的突触伙伴建立初始接触。尽管树突分支动态与突触形成之间的关联已得到充分证实，但发育过程及依赖神经活动的过程如何调控树突分支动态仍不清楚。部分原因在于利用活体系统对这些精细结构进行活细胞成像和定量分析存在技术上的困难。我们建立了一种利用果蝇（Drosophila）幼虫腹外侧神经元（LNvs）研究树突动态的方法，该类神经元可通过遗传手段进行单细胞标记，并适用于活体成像。借助该系统，我们开发了实验流程，通过延时活体成像技术捕捉单个标记LNv完整树突分支结构的动态变化。随后进行图像后处理，包括漂移校正和去卷积，以提升图像质量，再通过标注所有分支末端的空间位置，在单一分支水平上分析其动态行为。最后，我们开发了R语言脚本（补充文件）和特定参数，利用末端轨迹生成的坐标信息对分支动态进行量化。综上所述，该实验方案使我们能够以高时间与空间分辨率，对神经元树突分支结构的动态行为进行详细的定量描述。我们所建立的方法可广泛适用于体外和体内条件下稀疏标记的神经元研究。
引言
树突是神经元中专门用于接收和处理感觉及突触输入的特殊区室。自发现以来，树突分支复杂而高度保守的结构一直受到广泛关注和深入研究。目前已建立多种模型系统用于研究神经元树突的发育、重塑及可塑性，其中包括Xenopus视顶盖神经元、鸡视网膜神经节细胞以及Drosophila系统中的树突分支化（da）神经元1,2,3,4。Drosophila腹外侧神经元（LNvs）是一类视觉投射神经元，最初因其在调控果蝇行为节律中的重要作用而被发现5。研究还揭示，幼虫期的LNvs是幼虫光感受器（PRs）的直接突触后靶细胞6,7。重要的是，将发育中的幼虫培养于不同光照条件下会显著影响LNvs树突分支的大小，表明LNvs是研究树突可塑性的理想新模型7。我们课题组近期的研究进一步表明，LNv树突的大小及其分支的动态行为均表现出依赖于经验的可塑性8,9。作为该研究的一部分，我们开发了一种新的活体成像与定量分析流程，可用于分析来自2nd或3rd龄幼虫的LNvs树突动态变化。
Drosophila 幼虫大脑的透明特性使其成为活体成像的理想材料。然而，LNv神经元的树突分支位于幼虫脑叶中央高度神经支配的幼虫视神经纤维网（LON）中6。为了在完整脑组织中清晰捕捉细小树突分支和丝状伪足的图像，我们采用双光子显微镜技术，该技术可增强光的穿透深度，并减少活体成像过程中的光毒性10。利用该系统，我们成功对LNv神经元进行了超过30分钟的活体成像，未观察到神经元出现明显的形态退化。此外，通过Flip-out技术进行的遗传操作使我们能够用膜标记的GFP特异性标记单个LNv神经元，这对于监测单个树突分支的动态变化也至关重要11,12,13。
为了以最佳光学分辨率捕捉LNv树突分支上所有分支的动态行为，我们对新解剖的幼虫脑组织外植体进行了延时三维成像，每帧图像的空间分辨率较高，采集间隔为1分钟，持续10至30分钟。发育中的LNv树突具有高度动态性，在10分钟的时间窗口内，大量分支均表现出可观测的变化。这导致了研究树突动态时面临的主要技术挑战之一，即基于四维图像数据集对分支行为进行量化。以往建立的方法存在多种局限性，包括准确性不足和耗时过长。因此，我们开发了一种半自动方法，结合图像后期处理、人工标记分支末端以及利用图像标注软件进行自动的四维斑点追踪。我们根据斑点的三维坐标计算不同时间点分支末端的运动情况。随后将数据导出并进行分析，以获得树突动态的定量测量结果。该方法能够准确评估已有分支伸长与回缩事件的持续时间和幅度，以及新分支的形成过程，从而实现对大量神经元树突动态的监测。
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方案
警告：本实验方案涉及四类激光器的使用，需接受适当培训并严格遵守安全操作规程。避免眼睛或皮肤暴露于直接或散射的激光光线下。
注意：该实验方案包含六个步骤，工作流程如图1A所示。
1. 使用 Flip-out 技术标记单个神经元
注意：通过使用翻转酶（flippase）介导的随机标记方法，在单个LNv中表达mCD8::GFP，从而实现LNv的单细胞标记。果蝇品系的基因型为：hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP11,12,13。获得单个标记LNv的频率约为10%。果蝇品系保存在标准培养基中，并置于温度为25 °C、光照节律和湿度受控的培养箱中。
- 在授精后2小时内，于含酵母补充剂的葡萄汁平板上收集100-200枚卵。将胚胎在25 °C下培养24小时，并收集新孵化的一龄幼虫用于下一步操作。
- 将新孵化的一龄幼虫在37.5 °C下进行两次热激处理，每次40分钟，中间间隔40分钟恢复期。
- 在25 °C下，于控制昼夜节律和湿度的条件下培养幼虫至所需发育阶段。
2. 解剖和制备幼虫脑外植体
- 在解剖显微镜（4.5倍放大倍率）下，使用两把#5标准尖头解剖镊（11 cm），于生理外液（120 mM NaCl、4 mM MgCl2、3 mM KCl、10 mM NaHCO3、10 mM葡萄糖、10 mM蔗糖、5 mM TES、10 mM HEPES、2 mM Ca2+，pH 7.2）中解剖幼虫脑组织。用一把镊子固定幼虫身体，另一把小心分离出脑组织。保留眼盘、脑叶和腹神经索。去除附着的肌肉，以减少成像过程中的样本移动。
- 准备一张载玻片（25 × 75 × 1.0 mm3），并用注射器在载玻片上以真空脂绘制一个方形腔室。
- 向带有脂质屏障的方形腔室内加入20 µL外液。
- 用镊子将解剖好的幼虫脑组织转移至载玻片的腔室内。在解剖显微镜下调整脑组织位置，确保背侧朝上。
- 用盖玻片（22 × 22 × 0.15 mm3）覆盖腔室。此时幼虫脑组织已固定在充满外液的腔室内（图1B）。
注意：轻轻按压盖玻片可固定脑组织，减少后续成像过程中的样本漂移。
3. 延时活体成像
注意：我们使用配备多光子激光器的共聚焦显微镜进行延时成像实验。其他成像系统需调整采集参数。
- 使用40倍水浸物镜（NA 1.3）和落射荧光光源识别含有单个标记神经元的脑组织外植体。图像采集时，采用调谐至920 nm的双光子激光器和非共聚焦（NDD）探测器。
- 以每帧512 × 512像素、每Z轴堆栈1分钟的速度采集图像，持续10分钟。调整光学和数字放大倍数，以在确保1分钟内覆盖整个树突分支结构的前提下，获得足够的x-y-z分辨率（图2，补充视频1）。该设置所获得图像的典型x-y-z分辨率为0.11 × 0.11 × 0.25 µm3。
- 在脑组织解剖后30分钟内完成时间序列图像的采集。对于发生显著漂移或出现明显形态退化的数据，应在后续处理和定量分析中予以剔除。
4. 漂移校正与去卷积
注意：根据图像质量，这两个步骤均为可选，但强烈建议执行。
- 使用漂移校正软件打开已获取的图像文件。编辑显微镜参数，使其与实验所用参数一致。对于该软件（参见材料表），点击编辑 | 编辑显微镜参数。若无双光子选项，则将显微镜类型设置为宽场，用于双光子图像，并按照软件定义的工作流程操作。例如，打开去卷积 | 目标稳定器选项卡，然后选择稳定时间帧。
- 在去卷积软件中打开经漂移校正的图像，并遵循其工作流程。对于该软件（参见材料表），选择已稳定的图像，然后点击去卷积 | 快速去卷积。为获得更佳结果，可使用去卷积向导精细调整参数。
- 将去卷积后的图像保存为后续图像标注软件所支持的文件格式，该软件需能够分析4D数据并报告图像中指定斑点的空间坐标（参见材料表）。
5. 图像标注
- 在图像标注软件中打开去卷积后的图像。在所有时间点上以三维方式检查并标记分支末端。图像标注软件将报告并存储所标记分支末端的空间和时间坐标。将坐标信息导出为 .csv 文件，用于后续计算。
注意：以下两个步骤针对我们所使用的标注软件（参见材料表）。其他软件的工作流程可能有所不同。 - 在“Spots”模块中，点击"跳过自动创建，手动编辑"，并勾选底部的"自动连接到选定的Spot"复选框（图3A）。浏览时间序列中的各帧，选择一个分支进行标注。按住 Shift 键，点击分支的末端以添加一个点。逐帧点击所有时间点。
注意：图像标注软件将在帧之间自动连接这些点并生成轨迹。分支末端的空间和时间信息现已与所标记的点相关联。重复上述步骤，直至所有分支末端均被标注（图3B）。 - 在“Spots”模块中，点击统计标签，选择详细信息，然后选择特定值 | 位置。系统将显示记录的空间和时间坐标信息。点击保存按钮，将该信息导出为 .csv 文件（图3C）。
6. 计算树突分支动态
注意：利用坐标信息，可轻松计算出分支末端在三维空间中的位移。在本研究中，所有树突分支的运动均被归类为延伸或回缩。以下步骤描述了如何使用自行编写的 R 脚本（补充文件）处理 .csv 文件，并通过手动编辑添加方向信息。
- 将 .csv 文件作为电子表格打开。选中 Track ID 列，点击 从小到大排序 选项，并选择 扩展所选区域。排序后，Track ID 标识每一条独特的树突分支，同一分支上的斑点具有相同的 Track ID。Time 列存储了不同时间帧的信息。
- 在电子表格中新增一列，命名为 Distance。利用相邻时间点斑点的坐标计算每两个时间相邻斑点之间的距离，并将计算结果填入 Distance 列中（图 4A）。
- 单个体素水平的微小移动。根据成像设置，小于 0.3 µm 的位移通常来源于未校正的漂移或图像标注不精确，属于伪影。通过将所有小于 0.3 µm 的 Distance 值重置为 0 来滤除这些移动。可手动处理多个 .csv 文件，或使用我们提供的 R 脚本 batch column filtering.R（补充文件）进行批量处理。
- 在电子表格中手动添加一列，命名为 Displacement。将 Distance 列中的数值复制到 Displacement 列中。手动为每条分支末端的延伸和回缩事件进行标注：若为延伸事件，则保持 Displacement 值不变（正值）；若为回缩事件，则将对应的 Displacement 值改为负值（例如，将 0.35 改为 -0.35）（图 4B）。
- 新增一列，命名为 Event。在该列中，手动对每个独立的延伸和回缩事件的 Displacement 值进行累加（图 4B）。
- 使用 R 脚本 batch column sum.R（补充文件）处理修改后的电子表格，并根据位移值量化延伸和回缩事件。输出参数包括 延伸事件数量、回缩事件数量、累计延伸长度、累计回缩长度、净长度变化 和 总移动长度。
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结果
利用上述活体成像方案，我们获得了高分辨率的图像序列，用于后续分析与定量。 补充视频1展示了从一个代表性单标记LNv细胞采集的最大强度投影（MIP）图像序列。图2B展示了该图像序列中八个时间帧对应的拼接图。在两个图中，箭头表示突起延伸事件，箭头末端带短横线的标记（箭头标）表示回缩事件。
接下来，我们使用图像标注软件（材料表）对分支末端进行半自动化的4D追踪。图3B展示了来自一个代表性单标记LNv的动态分支末端的标注结果。通过该软件，我们可在三维空间中可视化图像堆栈，手动标记所有分支末端，并利用Spots模块追踪这些末端随时间的运动。该软件为每个标注的分支末端生成带时间戳的轨迹，用以直观呈现树突分支上的动...
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讨论
本文介绍了一种我们开发的实验方案，用于记录和量化果蝇（Drosophila）幼虫大脑中单个标记神经元树突分支的动态行为。值得注意的是，我们的活体成像方案包含特定参数，使我们能够完整捕获幼虫LNv神经元的整个树突分支结构，从而全面观察其树突分支的动态状态。然而，由于我们的量化方法高度依赖于对分支末端的标注，因此具有复杂树突结构和密集分支的神经元并不适合作为该分析的对象。
样本制备、图像采集和后期处理是本实验方案中的关键步骤。高质量的单个LNv原始图像对于准确量化树突动态至关重要。我们的数据表明，在仔细制备的幼虫脑组织离体样本中，LNv树突形态及其生理反应在解剖后30分钟内能够得到良好保存。若样本出现明显的脑组织退化、树突分支过度伸长或分支断裂，则不应用于成像和定量分析。尽管对于背景信号低且无明显移动的图像数据集而言，漂移校正和去卷积步骤可选，但我们强烈建议包含这两个步骤以提高图像质量，这对于分支末端的标注和自动斑点追踪尤为重要。除本研究中使用的商业软件外，ImageJ/Fiji中的Correct 3D drift（插...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所、美国国立卫生研究院院内研究项目资助，项目编号 1ZIANS003137。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Chameleon Vision II 多光子激光器 | Coherent | ||
| 高真空润滑脂 | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 双光子激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | 直立式配置 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 软件 | |||
| Excel | Microsoft | 用于处理 .csv 文件 | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | 用于漂移校正和去卷积 | |
| Imaris | Oxford Instruments | 用于三维可视化和图像标注 | |
| 试剂 | |||
| 葡萄糖 | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| 蔗糖 | |||
| TES |
参考文献
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