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方法文章

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

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DOI：

10.3791/60291

⸱

2020年1月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。

摘要

中枢神经系统（CNS）微血管的分离通常通过合并多个动物（最常见为啮齿类动物）的皮层组织来完成。这种方法将血脑屏障（BBB）特性的研究局限于皮层，且无法进行个体间的比较。本项目致力于开发一种分离方法，能够实现对多个中枢神经系统区域的神经血管单元（NVU）进行比较，包括皮层、小脑、视叶、下丘脑、垂体、脑干和脊髓。此外，该方法最初为小鼠样本开发，现已成功适用于从小型和大型脊椎动物的中枢神经系统组织中分离微血管，包括从大脑半球白质中成功分离微血管。该方法与免疫标记技术结合后，可实现对蛋白表达水平的定量分析，并在个体间、组织类型间或不同处理条件下进行统计学比较。我们通过评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中蛋白表达的变化验证了该方法的适用性，EAE是神经炎症性疾病多发性硬化的小鼠模型。此外，通过该方法分离得到的微血管还可用于后续多种实验应用，如qPCR、RNA-seq和Western blot等。尽管这并非首次尝试在不使用超速离心或酶解解离的情况下分离中枢神经系统微血管，但其独特之处在于能够高效地对单一个体及多个中枢神经系统区域进行比较。因此，该方法可用于探究一系列可能被忽视的差异，包括中枢神经系统不同区域（皮层、小脑、视叶、脑干、下丘脑、垂体和脊髓）、组织类型（灰质或白质）、个体差异、实验处理组以及物种间的差异。

引言

大脑是人体最重要的器官。因此，尽管存在可能引发偏离正常状态的外部因素，维持大脑稳态仍是首要任务。据一些学者认为，大约在4亿至5亿年前1，脊椎动物进化出了我们现在所知的血脑屏障（BBB）2,3。这一保护性"屏障"通过严格调控血液与中枢神经系统（CNS）实质之间离子、分子和细胞的转运，对中枢神经系统的稳态和功能产生最大影响。当血脑屏障遭到破坏时，大脑将易受到毒性物质暴露、感染和炎症的侵害。因此，血脑屏障功能障碍与许多（即使不是全部）神经系统和神经发育障碍相关4,5,6。

血脑屏障（BBB）的复杂功能归因于由神经血管单元（NVU）构成的独特中枢神经系统（CNS）微血管系统2,3。高度特化的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞终足构成了NVU的细胞组分2,3。这些细胞产生的细胞外基质对NVU及BBB的生理功能同样至关重要2,3。尽管NVU的关键细胞和分子组分在脊椎动物中具有保守性，但在不同目和物种之间仍报道存在异质性7,8。然而，技术上的局限性阻碍了我们在神经生物学、生物医学或转化研究中充分考虑这些差异的能力。

基于此，我们扩展了一种针对中枢神经系统（CNS）特定区域的微血管分离方法，使其适用于全部五个脊椎动物类群（鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类）的多种物种。本方案适用于小型无脑回和大型有脑回的脊椎动物，包括具有转化研究意义的物种9。此外，我们还将此前在此类研究中未被探索但与神经生理学密切相关且具有重要临床意义的CNS区域纳入本方法，包括下丘脑、垂体和白质。最后，我们验证了该分离方法作为可靠工具在检测神经血管单元（NVU）和/或血脑屏障（BBB）中蛋白表达变化方面的可行性9,10,11。作为概念验证，我们展示了如何通过该分离方法结合免疫荧光技术，检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中VCAM-1和JAM-B表达的变化。

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方案

本研究的所有操作均遵循加州大学戴维斯分校（UC）动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。加州大学戴维斯分校的动物护理由多个独立机构监管，并自1966年以来一直获得国际实验动物评估和认证协会（AAALAC）的全面认证。猪的中枢神经系统（CNS）组织来自加州大学戴维斯分校动物科学系肉类科学实验室。猕猴的中枢神经系统（CNS）组织来自加州国家灵长类研究中心病理学部门（NIH P51OD011107）。实验室工作人员未对猪和猕猴实施任何麻醉、安乐死或尸检操作，因此在这些方面无特殊建议。

注意：该方法已针对多个物种进行了验证，但所提供的实验方案更直接适用于小鼠和猪的组织。涉及视叶的部分细节不适用于哺乳动物样本。所有生物危害材料必须在相应的生物安全水平（BSL）设施中进行处理。所有急性毒物必须在通风柜下操作。所有生物危害医疗废物和急性毒物废物必须妥善处置。

1. 准备

  1. 至少提前一天配制溶液（表1）。
    注意：70 kDa 分子量（MW）的葡聚糖很难溶解。建议将溶液用石蜡膜或铝箔覆盖后过夜搅拌，效率更高。本方案需根据所研究的样本类型使用两种不同的 MV-2 溶液。在处理小型无脑回样本时，18% 葡聚糖可有效将髓鞘与微血管沉淀物分离。然而，在处理大型有脑回样本的中枢神经系统组织，以及小型样本的下丘脑和垂体时，18% 葡聚糖会在界面处产生髓鞘弥散条带。使用 20% 葡聚糖可避免此弥散现象。
  2. 通过向每孔加入 50 µL 多聚-D-赖氨酸制备多孔载玻片，并在室温（RT）下干燥 2 小时，最好在二级生物安全柜（BSC-2）中进行。切勿过度干燥。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次后，置于冰箱中保存，待用。

2. 小型无脑回脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖

注意：本文以一只10周龄、约25克重的雄性C57BL6/J小鼠为例，演示该实验方案的应用。

  1. 为每个样本准备两个15 mL锥形管和一个1.7 mL微量离心管，分别加入5 mL和1 mL的MV-1溶液。将管子置于冰上保存。
  2. 麻醉
    1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮、赛拉嗪和乙酰丙嗪麻醉混合物（剂量为每公斤体重100/10/3 mg），并用70%乙醇喷洒。通过轻触眼睛检查眨眼反射、轻捏足部检查足底反射，确认反射消失以验证麻醉效果。
    2. 使用诱导麻醉箱，通过吸入5%异氟烷对鸽子进行麻醉。
    3. 将鱼类和蛙类分别置于含1%三卡因的鱼类饲养用水或两栖类林格氏液（材料表）中进行麻醉。
    4. 在实施安乐死后，将蜥蜴置于4 °C环境中冷却以进行麻醉。
  3. 使用手术剪将动物断头，用镊子剥离皮肤暴露颅骨，并用拉格朗日剪从枕骨大孔处剪开（图1A）。
  4. 用解剖刀将脑组织取出，并转移至含有MV-1溶液的15 mL锥形管中。将管子置于冰上保存。
  5. 用镊子从颅骨的蝶鞍中取出垂体，并转移至含有MV-1溶液的1.7 mL微量离心管中。将管子置于冰上保存。
  6. 去除皮肤和肌肉以暴露脊柱，切除四肢、肋骨和内脏器官（图1B）。
  7. 采用以下两种方法之一解剖脊髓，然后将其转移至含有MV-1溶液的5 mL锥形管中。将管子置于冰上保存。
    1. 使用拉格朗日剪从颈椎椎间孔开始，沿头端向尾端方向剪开，进行椎板切除术，直至腰段脊髓。
    2. 使用18 G针头和装有MV-1溶液的10 mL注射器，从腰段椎间孔由尾端向头端方向进行冲洗（图1C,D）。
      注意：该方法仅适用于非常小的样本，主要是啮齿类动物（<100 g）。
  8. 在解剖显微镜下，使用弹簧剪将硬脊膜从脊髓上剪下，并用双齿镊去除残留的脑膜（图2）。
  9. 将脑组织转移至培养皿中，在解剖显微镜下用双齿镊去除脑膜（图2A–C）。
  10. 使用镊子、虹膜剪和弹簧剪切除嗅球和丘脑。用双齿镊从所有脑室中清除脉络丛。务必彻底清除所有脉络丛。
    注意：脉络丛和嗅球是主要的污染源。与血脑屏障不同，这些毛细血管高度有孔，若未清除，将严重影响后续实验结果。
  11. 使用镊子分离不同的中枢神经系统区域：大脑皮层、小脑、脑干、视叶（哺乳动物样本无此结构）和下丘脑。

3. 从大型具有脑回的脊椎动物标本中解剖中枢神经系统组织

注意：本实验方案使用从屠宰场获得的猪中枢神经系统组织。因此，此处不描述也不展示任何麻醉、安乐死或尸体解剖操作。

  1. 将猪中枢神经系统组织置于装有 MV-1 溶液的 0.946 L（32 oz）组织学容器中，并放入冰桶/冰盒内运输。
  2. 在解剖显微镜下，使用双齿镊、镊子、虹膜剪和弹簧剪从每份中枢神经系统组织上剥离脑膜。务必清除脑室内的脉络丛组织碎片。

4. 中枢神经系统组织匀浆化

注意：由两名研究人员共同进行匀浆过程效率更高：一人在体视显微镜下解剖脑膜，另一人同时对剪碎的组织进行匀浆。这样可使组织迅速返回冰桶并保持低温。

  1. 将每个中枢神经系统区域置于培养皿中，加入约 1 mL MV-1 溶液。使用单刃刀片将组织切碎成 1–2 mm 的小块。
    1. 对于小型脊椎动物标本，使用 100 mm × 20 mm 的培养皿。
    2. 对于大型脊椎动物标本，使用 150 mm × 15 mm 的培养皿。
  2. 小型脊椎动物标本的匀浆（表 2 和 表 3）
    1. 使用移液管将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓转移至各自装有约 1 mL MV-1 溶液的 10 mL 玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 型）中，匀浆器配备聚四氟乙烯（PTFE）研杵。加入 5 mL MV-1 溶液，每种组织匀浆约 10 次。将匀浆液转移至各自的 15 mL 锥形管中。将管子置于冰上保存。
      注意：对于小型脊椎动物，无论是否包含视叶，分别需要 5 个或 4 个 10 mL Potter-Elvehjem 匀浆器和 15 mL 锥形管。
    2. 用镊子将下丘脑和垂体转移至各自装有约 100 µL MV-1 溶液的 1.7 mL 离心管中，并使用玻璃微研杵小心匀浆。每次使用后用约 1 mL MV-1 溶液冲洗微研杵。将管子置于冰上保存。
      注意：对于小型脊椎动物，需要 2 个玻璃微研杵和 1.7 mL 离心管。
  3. 大型脊椎动物标本的匀浆（表 4 和 表 5）
    1. 使用移液管将切碎的组织转移至 55 mL 玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 型）中，匀浆器配备聚四氟乙烯（PTFE）研杵，并连接至顶置式搅拌器。根据待匀浆的特定中枢神经系统部分，加入推荐体积一半的 MV-1 溶液（表 5）。
    2. 以极低速度（约 150 rpm）开启顶置式搅拌器，并小心上下移动玻璃管约 30 秒。
    3. 关闭搅拌器，加入更多 MV-1 溶液，重复步骤 4.3.2，直至形成均匀的浆液。
    4. 转移至 50 mL 锥形管中。将管子置于冰上保存。
    5. 每次完成不同中枢神经系统组织的匀浆后，用去离子水清洗匀浆器。
      注意：对于大型脊椎动物，无论是否包含白质，分别需要 5 个或 4 个 50 mL 锥形管。同样，下丘脑和垂体需要两个（2）15 mL 锥形管。

5. 微血管纯化

  1. 将步骤 4.2.1、4.2.2 或 4.3.4 得到的组织匀浆在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 10 分钟。在红褐色微血管沉淀物顶部会形成一层厚厚的白色髓鞘界面。弃去上清液。
    1. 小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3）
      1. 使用 5 mL 移液管（约冲洗 10 次）将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓沉淀物重悬于 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液中。向每种悬液中加入 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液，并通过翻转试管轻轻混匀。
      2. 用 1 mL MV-2 溶液重悬下丘脑和垂体沉淀物。
    2. 大型脊椎动物样本（表 4 和 表 5）
      1. 向大脑皮层、小脑、脑干和脊髓微血管沉淀物中加入 20 mL 冰冷的 MV-2 溶液。使用试管旋转振荡器混合，以 40 rpm 搅拌约 5 分钟，使沉淀物重悬。通过添加更多 MV-2 溶液，平衡大脑皮层、小脑、脑干和脊髓悬液的锥形管体积。
      2. 使用 5 mL 移液管（约冲洗 10 次）将下丘脑和垂体微血管沉淀物重悬于 5 mL MV-2 溶液中。向悬液中加入 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液，并通过翻转试管轻轻混匀。
  2. 在 4 °C 条件下以 4,400 × g 离心 15 分钟。
  3. 缓慢旋转各试管，使上清液沿管壁流动，从而小心地将液体界面上厚重致密的髓鞘层从管壁上分离下来。
  4. 弃去髓鞘层和液体界面，并用包裹无绒纸巾的刮刀擦拭每根试管内壁。对于小型脊椎动物样本，使用移液器小心吸除每个下丘脑和垂体试管中的髓鞘层。
  5. 用卷紧的无绒纸巾擦去多余液体。使用低吸附枪头，将每份沉淀物用 1 mL MV-3 溶液重悬。保持试管置于冰上。

6. 微血管洗脱与过滤

  1. 为每个中枢神经系统区域分别在烧杯中倒入冰冷的 MV-3 溶液。保持在 4 °C。
    1. 对于小型脊椎动物样本，每个 50 mL 烧杯使用 10 mL MV-3 溶液。根据是否包含视叶，总共需要 6–7 个烧杯。
    2. 对于大型脊椎动物样本，每个 100 mL 烧杯使用 30 mL MV-3 溶液。根据是否包含白质，总共需要 6–7 个烧杯。
  2. 将细胞筛置于 50 mL 锥形管上方。每个中枢神经系统区域使用一个。皮层、脑干、视叶、脊髓和垂体使用 100 µm 筛网。小脑和下丘脑使用 70 µm 细胞筛。
  3. 用 1 mL 冰冷的 MV-3 溶液润湿每个筛网。
  4. 使用刻度移液管向步骤 5.5 中制备的悬液中加入更多 MV-3 溶液，同时混合以避免形成团块。小心地将微血管加载到筛网上方，并用冰冷的 MV-3 溶液冲洗。
    1. 对于小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3），使用刻度移液管加入 10–15 mL MV-3 溶液，并用 5 mL MV-3 溶液冲洗。
    2. 对于大型脊椎动物样本，使用刻度移液管加入 20 mL MV-3 溶液，并用 10 mL MV-3 溶液冲洗。
  5. 通过将 20 µm 尼龙网滤器放置在改良滤器支架上（图 2D），为每个中枢神经系统区域组装过滤单元。
    1. 对于小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3），皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓使用 25 mm 改良滤器支架。下丘脑和垂体使用 13 mm 改良滤器支架。
    2. 对于大型脊椎动物样本（表 4 和 表 5），皮层、小脑、脑干和脊髓使用 47 mm 改良滤器支架。下丘脑和垂体使用 25 mm 滤器支架。
  6. 将滤器置于 50 mL 锥形管上方，并用 5 mL 冰冷的 MV-3 溶液润湿滤器，确保缓冲液沿滤器支架流入锥形管。
  7. 将洗脱的微血管（来自步骤 6.4）转移至 20 µm 尼龙网滤器上方，并用 5–10 mL 冰冷的 MV-3 溶液冲洗微血管。
  8. 使用洁净镊子取出滤器，并将其浸入步骤 6.1 中准备好的盛有冰冷 MV-3 溶液的烧杯中。
  9. 通过轻轻摇动约 30 秒，使微血管从滤器上脱落。对于小型脊椎动物样本，将烧杯内容物倒入 15 mL 锥形管中。对于大型脊椎动物样本，将烧杯内容物倒入 50 mL 锥形管中。
  10. 在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟，并使用低吸附移液枪头将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 MV-3 溶液中。
    1. 对于小型脊椎动物样本，将悬液（来自步骤 6.10）转移至 1.7 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 5 分钟。
      注：此离心步骤在台式离心机上以最大速度（约 20,000 x g）进行，以确保获得较高的得率。
    2. 对于大型脊椎动物样本，将步骤 6.10 中的悬液转移至 5.0 mL 微量离心管中，加入 4 mL MV-3 溶液，在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。

7. 免疫染色

注意：为验证该方案的可行性，已在爬行动物、两栖动物和鱼类标本上进行了苏木精和伊红（H&E）染色。因此，不建议对这些标本进行免疫标记。

  1. 从微量离心管中移除上清液。
  2. 使用低吸附性移液枪头（材料表）将沉淀重悬于1×无菌PBS中。通过多次吹打防止微血管形成聚集体。对于小型脊椎动物样本（表3），根据沉淀体积使用约100 µL–2,000 µL；对于大型脊椎动物样本（表5），根据沉淀体积使用约1,000 µL–4,000 µL。
  3. 使用低吸附性移液枪头将微血管转移至多孔载玻片中，注意将其加至每个孔的中央位置，避免接触孔壁。
  4. 将未加盖的多孔载玻片置于生物安全柜（BSC-2）内，室温下干燥20至30分钟。
    注意：使用相对较高体积的1× PBS是为了防止聚集体形成。因此，在固定前必须让载玻片充分干燥，以确保微血管被多聚-L-赖氨酸涂层牢固吸附。
  5. 用移液枪吸出残留的1× PBS，加入200 µL 4%多聚甲醛（PFA），室温孵育30分钟。
  6. 吸出固定液，用200 µL 1× PBS在室温下洗涤3次，每次5分钟。
    注意：在此步骤可对鱼类、两栖类和爬行类中枢神经系统微血管进行苏木精-伊红（H&E）染色。
  7. 向多孔载玻片中加入200 µL封闭缓冲液，37 °C孵育60分钟。
  8. 用移液枪吸出封闭液，加入200 µL用抗体稀释液配制的一抗混合液（材料表），4 °C孵育过夜。
  9. 吸出一抗混合液，用200 µL 1× PBS在室温下洗涤3次，每次5分钟。
  10. 加入用1× PBS稀释的二抗混合液（材料表），室温避光孵育2小时。
  11. 吸出二抗混合液，用200 µL 1× PBS在室温下避光洗涤3次，每次5分钟。最后一次洗涤后，取下多孔载玻片的框架，并用低絮状擦纸吸干多余的1× PBS。
  12. 加入盖玻片、液体抗荧光淬灭封片剂以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色。室温避光干燥过夜。
  13. 干燥后，将载玻片置于载片盒中，避光保存于4 °C，直至进行共聚焦显微镜观察和数据采集。

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结果

从小鼠中枢神经系统分离的微血管显示出神经血管单元的所有内在细胞组分2,3。通过使用血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM，亦称CD31）或凝集素IB4（一种可结合内皮细胞糖萼的糖蛋白）标记内皮细胞，血小板源性生长因子受体-β（PDGFRβ）或神经胶质抗原2（NG2）标记周细胞，以及水通道蛋白-4（AQP4）标记星形胶质细胞终足（图3A,B），证明了这些内在组分存在于分离的微血管中。可见的中枢神经系统区域包括大脑皮层微血管（图3B）、小脑（图3C）、垂体（图3D）、下丘脑（

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讨论

血脑屏障（BBB）包含脑微血管内皮细胞的独特特性，这些细胞通过复杂的紧密连接、黏附连接、"钉-槽"连接结构以及对中枢神经系统（CNS）稳态至关重要的黏附斑共同耦合而成2,3,19。内皮细胞特性的诱导和维持依赖于周细胞以及周围星形胶质细胞终足的结构支持2,3,19。BBB微血管具有极性特征（即蛋白质在管腔侧或基底侧内皮细胞表面呈现不对称分布）20。尽管上述描述可简要定义BBB，但实际上它仍是神经科学中最难解的概念之一。例如，神经血管单元（NVU）内部存在的区域差异、性别差异和年龄差异，可能解释中枢神经系统不同区域对创伤、毒性、感染和炎症的易感性差异，这些差异可能带来重大的临床后果

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Cruz-Orengo 博士获得了加州大学戴维斯分校兽医学院启动资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X PBSThermoFisherBP39920用于封闭和抗体稀释液。
20% PFAElectron Microscopy Sciences15713-S用作固定剂（4% PFA）
70,000 MW 葡聚糖Millipore Sigma9004-54-0用于 MV-2 溶液
Adson 镊子Fine Science Tools (FST)11006-12用于去除肌肉和皮肤
Adson 镊子，学生级FST91106-12与上述相同但更便宜
牛血清白蛋白（BSA）Millipore SigmaA7906-100G用于 MV-3 溶液、封闭和抗体稀释液
Corning 100 μm 细胞筛Millipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μm 细胞筛Millipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork 低吸附枪头Millipore SigmaCLS4151与下述相同但更便宜。
Cultrex Poly-D-LysineR&D3439-100-01用于载玻片包被
驴抗山羊 IgG-ALEXA 555ThermoA21432用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗小鼠 IgG-ALEXA 488ThermoA21202用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗兔 IgG-ALEXA 488ThermoA21206用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗兔 IgG-ALEXA 647ThermoA31573用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗大鼠 IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
双齿组织镊FST18067-11用于去除软脑膜和脉络丛
Dumont #3c 镊子FST11231-20用于更精细或更小的中枢神经系统组织操作（如垂体）
Dumont #7 镊子FST11274-20用于中枢神经系统组织的解剖和操作
Dumont #7 镊子，学生级FST91197-00与上述相同但更便宜
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention 枪头Eppendorf22493008比上述枪头质量更好（更昂贵）。
超细锯齿 Graefe 镊子FST11151-10用于去除骨骼
精细剪刀，锋利FST14060-09用于去除猪和猕猴的硬脊膜囊
1.5 mL 玻璃研杵微型离心管组织研磨器，10 支装Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
山羊抗 CXCL12，生物素标记PeproTech500-P87BGBT用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例：1:20。
山羊抗 JAM-BR&DAF1074用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 488ThermoA11001用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 555ThermoA21424用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗 PDGFRβR&DAF1042用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
山羊抗兔 IgG-ALEXA 555ThermoA21249用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗兔 IgG-DyLight 488Thermo35552用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗大鼠 IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
Graefe 镊子，弯头，1×2 齿FST11054-10用于夹持和摇动尼龙滤网
HBSS，含钙镁的 1X 缓冲液Corning21-022-CM用于 MV-1 溶液
HEPES，1M 液体缓冲液Corning25-060-CI用于 MV-1 溶液
异凝集素 GS-IB4-生物素-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414从豆科植物长果槐（Griffonia simplicifolia）中分离的糖蛋白，可结合内皮细胞糖萼上的 D-半乳糖基残基。用于禽类和猪的中枢神经系统微血管。推荐浓度：5 μg/mL。
LaGrange 剪刀，锯齿FST14173-12用于颅骨解剖和椎板切除术（猪和猕猴除外）
Millicell EZ 8 孔载玻片Millipore SigmaPEZGS0816
小鼠抗 CLDN5Thermo35-2500用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗 GGT1Abcamab55138用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗人 CD31R&DBBA7用作灵长类动物中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：16.5 μg/mL。
小鼠抗 NFMThermoRMO-270用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗αSMAThermoMA5-11547用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
尼龙滤网，卷装Millipore SigmaNY6000010激光切割成直径 13 mm 的滤网圆片。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
尼龙滤网，25 mmMillipore SigmaNY2002500用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
尼龙滤网，47 mmMillipore SigmaNY2004700用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisherP36935用于盖玻片封片。
兔抗 AQP4Millipore SigmaA5971用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
兔抗 LSRMillipore SigmaSAB2107967用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
兔抗 NG2Millipore SigmaAB5320用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
兔抗 OSPAbcamab53041用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：1 μg/mL。
兔抗 VE-CadherinAbcamab33168用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
兔抗 ZO-1Thermo61-7300用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
大鼠抗 CD31Becton DickinsonBD 550274用作小鼠中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
大鼠抗 GFAPThermo13-0300用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
大鼠抗 VCAM-1Becton DickinsonBD 553329用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
无菌林格氏液，蛙用Aldon CorporationIS5066用于两栖动物麻醉
链霉亲和素-ALEXA 555ThermoS32355用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。
链霉亲和素-ALEXA 647ThermoS32357用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。
手术剪刀，锋利FST14002-12用于去除肌肉和皮肤
手术剪刀，锋利-钝头FST14001-16用于断头（猪和猕猴除外）
Swinnex 滤器支架，13 mmMillipore SigmaSX0001300经激光切割改造。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
Swinnex 滤器支架，25 mmMillipore SigmaSX0002500经激光切割改造。用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
Swinnex 滤器支架，47 mmMillipore SigmaSX0004700经激光切割改造。用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277用于封闭和抗体稀释液。
Wheaton 120 真空顶置式搅拌器VWR (供应商 DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，配合 55 mL 组织研磨器使用，下丘脑和垂体除外。
Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，10 mLVWR (供应商 DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，55 mLVWR (供应商 DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。

参考文献

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