跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

摘要

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。

摘要

中枢神经系统（CNS）微血管的分离通常通过合并多个动物（最常见为啮齿类动物）的皮层组织来完成。这种方法将血脑屏障（BBB）特性的研究局限于皮层，且无法进行个体间的比较。本项目致力于开发一种分离方法，能够实现对多个中枢神经系统区域的神经血管单元（NVU）进行比较，包括皮层、小脑、视叶、下丘脑、垂体、脑干和脊髓。此外，该方法最初为小鼠样本开发，现已成功适用于从小型和大型脊椎动物的中枢神经系统组织中分离微血管，包括从大脑半球白质中成功分离微血管。该方法与免疫标记技术结合后，可实现对蛋白表达水平的定量分析，并在个体间、组织类型间或不同处理条件下进行统计学比较。我们通过评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中蛋白表达的变化验证了该方法的适用性，EAE是神经炎症性疾病多发性硬化的小鼠模型。此外，通过该方法分离得到的微血管还可用于后续多种实验应用，如qPCR、RNA-seq和Western blot等。尽管这并非首次尝试在不使用超速离心或酶解解离的情况下分离中枢神经系统微血管，但其独特之处在于能够高效地对单一个体及多个中枢神经系统区域进行比较。因此，该方法可用于探究一系列可能被忽视的差异，包括中枢神经系统不同区域（皮层、小脑、视叶、脑干、下丘脑、垂体和脊髓）、组织类型（灰质或白质）、个体差异、实验处理组以及物种间的差异。

引言

大脑是人体最重要的器官。因此，尽管存在可能引发偏离正常状态的外部因素，维持大脑稳态仍是首要任务。据一些学者认为，大约在4亿至5亿年前¹，脊椎动物进化出了我们现在所知的血脑屏障（BBB）^2,3。这一保护性"屏障"通过严格调控血液与中枢神经系统（CNS）实质之间离子、分子和细胞的转运，对中枢神经系统的稳态和功能产生最大影响。当血脑屏障遭到破坏时，大脑将易受到毒性物质暴露、感染和炎症的侵害。因此，血脑屏障功能障碍与许多（即使不是全部）神经系统和神经发育障碍相关^4,5,6。

血脑屏障（BBB）的复杂功能归因于由神经血管单元（NVU）构成的独特中枢神经系统（CNS）微血管系统^2,3。高度特化的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞终足构成了NVU的细胞组分^2,3。这些细胞产生的细胞外基质对NVU及B....

方案

本研究的所有操作均遵循加州大学戴维斯分校（UC）动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。加州大学戴维斯分校的动物护理由多个独立机构监管，并自1966年以来一直获得国际实验动物评估和认证协会（AAALAC）的全面认证。猪的中枢神经系统（CNS）组织来自加州大学戴维斯分校动物科学系肉类科学实验室。猕猴的中枢神经系统（CNS）组织来自加州国家灵长类研究中心病理学部门（NIH P51OD011107）。实验室工作人员未对猪和猕猴实施任何麻醉、安乐死或尸检操作，因此在这些方面无特殊建议。

注意：该方法已针对多个物种进行了验证，但所提供的实验方案更直接适用于小鼠和猪的组织。涉及视叶的部分细节不适用于哺乳动物样本。所有生物危害材料必须在相应的生物安全水平（BSL）设施中进行处理。所有急性毒物必须在通风柜下操作。所有生物危害医疗废物和急性毒物废物必须妥善处置。

1. 准备

1. 至少提前一天配制溶液（表1）。
   注意：70 kDa 分子量（MW）的葡聚糖很难溶解。建议将溶液用石蜡膜或铝箔覆盖后过夜搅拌，效率更高。本方案需根据所研究的样本类型使用两种不同的 MV-2 溶液。在处理小型无脑回样本时，18% 葡聚糖可有效将髓鞘与微血管沉淀物分离。然而，在处理大型有脑回样本的中枢神经系统组织，以及小型样本的下丘脑和垂体时，18% 葡聚糖会在界面处产生髓鞘弥散条带。使用 20%....

结果

从小鼠中枢神经系统分离的微血管显示出神经血管单元的所有内在细胞组分^2,3。通过使用血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM，亦称CD31）或凝集素IB4（一种可结合内皮细胞糖萼的糖蛋白）标记内皮细胞，血小板源性生长因子受体-β（PDGFRβ）或神经胶质抗原2（NG2）标记周细胞，以及水通道蛋白-4（AQP4）标记星形胶质细胞终足（图3A,B），证明了这些内在组分存在于分离的微血管中。可见的中枢神经系统区域包括大脑皮层微血管（图3B）、小脑（图3C）、垂体（图3D）、下丘脑（

讨论

血脑屏障（BBB）包含脑微血管内皮细胞的独特特性，这些细胞通过复杂的紧密连接、黏附连接、"钉-槽"连接结构以及对中枢神经系统（CNS）稳态至关重要的黏附斑共同耦合而成^2,3,19。内皮细胞特性的诱导和维持依赖于周细胞以及周围星形胶质细胞终足的结构支持^2,3,19。BBB微血管具有极性特征（即蛋白质在管腔侧或基底侧内皮细胞表面呈现不对称分布）²⁰。尽管上述描述可简要定义BBB，但实际上它仍是神经科学中最难解的概念之一。例如，神经血管单元（NVU）内部存在的区域差异、性别差异和年龄差异，可能解释中枢神经系统不同区域对创伤、毒性、感染和炎症的易感性差异，这些差异可能带来重大的临床后果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS	ThermoFisher	BP39920	用于封闭和抗体稀释液。
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713-S	用作固定剂（4% PFA）
70,000 MW 葡聚糖	Millipore Sigma	9004-54-0	用于 MV-2 溶液
Adson 镊子	Fine Science Tools (FST)	11006-12	用于去除肌肉和皮肤
Adson 镊子，学生级	FST	91106-12	与上述相同但更便宜
牛血清白蛋白（BSA）	Millipore Sigma	A7906-100G	用于 MV-3 溶液、封闭和抗体稀释液
Corning 100 μm 细胞筛	Millipore Sigma	CLS431752-50EA
Corning 70 μm 细胞筛	Millipore Sigma	CLS431751-50EA
Corning Deskwork 低吸附枪头	Millipore Sigma	CLS4151	与下述相同但更便宜。
Cultrex Poly-D-Lysine	R&D	3439-100-01	用于载玻片包被
驴抗山羊 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21432	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗小鼠 IgG-ALEXA 488	Thermo	A21202	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗兔 IgG-ALEXA 488	Thermo	A21206	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗兔 IgG-ALEXA 647	Thermo	A31573	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
驴抗大鼠 IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10029	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
双齿组织镊	FST	18067-11	用于去除软脑膜和脉络丛
Dumont #3c 镊子	FST	11231-20	用于更精细或更小的中枢神经系统组织操作（如垂体）
Dumont #7 镊子	FST	11274-20	用于中枢神经系统组织的解剖和操作
Dumont #7 镊子，学生级	FST	91197-00	与上述相同但更便宜
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention 枪头	Eppendorf	22493008	比上述枪头质量更好（更昂贵）。
超细锯齿 Graefe 镊子	FST	11151-10	用于去除骨骼
精细剪刀，锋利	FST	14060-09	用于去除猪和猕猴的硬脊膜囊
1.5 mL 玻璃研杵微型离心管组织研磨器，10 支装	Chang Bioscience Inc. (eBay)	GP1.5_10	用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
山羊抗 CXCL12，生物素标记	PeproTech	500-P87BGBT	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例：1:20。
山羊抗 JAM-B	R&D	AF1074	用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 488	Thermo	A11001	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21424	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗 PDGFRβ	R&D	AF1042	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
山羊抗兔 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21249	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗兔 IgG-DyLight 488	Thermo	35552	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
山羊抗大鼠 IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10021	用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。
Graefe 镊子，弯头，1×2 齿	FST	11054-10	用于夹持和摇动尼龙滤网
HBSS，含钙镁的 1X 缓冲液	Corning	21-022-CM	用于 MV-1 溶液
HEPES，1M 液体缓冲液	Corning	25-060-CI	用于 MV-1 溶液
异凝集素 GS-IB4-生物素-XX	ThermoFisher Scientific (Thermo)	I21414	从豆科植物长果槐（Griffonia simplicifolia）中分离的糖蛋白，可结合内皮细胞糖萼上的 D-半乳糖基残基。用于禽类和猪的中枢神经系统微血管。推荐浓度：5 μg/mL。
LaGrange 剪刀，锯齿	FST	14173-12	用于颅骨解剖和椎板切除术（猪和猕猴除外）
Millicell EZ 8 孔载玻片	Millipore Sigma	PEZGS0816
小鼠抗 CLDN5	Thermo	35-2500	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗 GGT1	Abcam	ab55138	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗人 CD31	R&D	BBA7	用作灵长类动物中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：16.5 μg/mL。
小鼠抗 NFM	Thermo	RMO-270	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
小鼠抗αSMA	Thermo	MA5-11547	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
尼龙滤网，卷装	Millipore Sigma	NY6000010	激光切割成直径 13 mm 的滤网圆片。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
尼龙滤网，25 mm	Millipore Sigma	NY2002500	用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
尼龙滤网，47 mm	Millipore Sigma	NY2004700	用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36935	用于盖玻片封片。
兔抗 AQP4	Millipore Sigma	A5971	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
兔抗 LSR	Millipore Sigma	SAB2107967	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
兔抗 NG2	Millipore Sigma	AB5320	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
兔抗 OSP	Abcam	ab53041	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：1 μg/mL。
兔抗 VE-Cadherin	Abcam	ab33168	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
兔抗 ZO-1	Thermo	61-7300	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
大鼠抗 CD31	Becton Dickinson	BD 550274	用作小鼠中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
大鼠抗 GFAP	Thermo	13-0300	用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。
大鼠抗 VCAM-1	Becton Dickinson	BD 553329	用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 μg/mL。
无菌林格氏液，蛙用	Aldon Corporation	IS5066	用于两栖动物麻醉
链霉亲和素-ALEXA 555	Thermo	S32355	用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。
链霉亲和素-ALEXA 647	Thermo	S32357	用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。
手术剪刀，锋利	FST	14002-12	用于去除肌肉和皮肤
手术剪刀，锋利-钝头	FST	14001-16	用于断头（猪和猕猴除外）
Swinnex 滤器支架，13 mm	Millipore Sigma	SX0001300	经激光切割改造。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。
Swinnex 滤器支架，25 mm	Millipore Sigma	SX0002500	经激光切割改造。用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
Swinnex 滤器支架，47 mm	Millipore Sigma	SX0004700	经激光切割改造。用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。
Triton X-100	ThermoFisher	50-165-7277	用于封闭和抗体稀释液。
Wheaton 120 真空顶置式搅拌器	VWR (供应商 DWK Life Sciences)	62400-904 (DWK #903475)	用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，配合 55 mL 组织研磨器使用，下丘脑和垂体除外。
Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，10 mL	VWR (供应商 DWK Life Sciences)	14231-384 (DWK #357979)	用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。
Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，55 mL	VWR (供应商 DWK Life Sciences)	14231-372 (DWK #357994)	用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。