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方法文章

人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、趋化吸引及共培养实验

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DOI：

10.3791/60295

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2020年1月23日

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

本文内容

摘要

我们介绍了三种简单的体外实验方法——长距离迁移实验、共培养迁移实验和化学趋化实验，这些实验共同评估了人干细胞来源的室管膜周围内皮细胞的功能及其与GABA能中间神经元的相互作用。

摘要

脑血管系统在神经系统发育及脑部疾病病因学中的作用正日益受到关注。我们近期的研究发现了一类特殊的血管细胞——室周内皮细胞，这类细胞在胚胎发育过程中对前脑GABA能中间神经元的迁移和分布起着关键作用。这一发现，结合其细胞自主性功能，提示室周内皮细胞在精神分裂症、癫痫和自闭症等神经精神疾病病理过程中可能具有新的作用。本文描述了三种不同的体外实验方法，可综合评估室周内皮细胞的功能及其与GABA能中间神经元的相互作用。特别是在人类研究背景下应用这些实验方法，将有助于揭示室周内皮细胞与脑部疾病之间的关联。这些实验方法操作简便、成本低廉、可重复性强，且可轻松适用于任何贴壁细胞类型。

引言

内皮细胞构成血管壁的内衬，介导多种重要功能，包括维持血管壁通透性、调节血流、血小板聚集以及新生血管的形成。在大脑中，内皮细胞是关键的血脑屏障的组成部分，严格调控脑组织与血液之间物质的交换1。我们过去十年的研究发现了脑内皮细胞具有新的促神经发生作用，这对脑发育和行为具有重要意义2,3,4,5。我们已证明小鼠胚胎前脑由两种不同亚型的血管进行血管化，即软脑膜血管和室管膜周围血管，二者在解剖结构、起源和发展模式上均存在差异2。衬于这两类血管亚型的内皮细胞在基因表达谱上表现出明显差异。软脑膜内皮细胞主要表达与炎症和免疫反应相关的基因，而室管膜周围内皮细胞则特异性高表达与神经发生、神经元迁移、趋化性和轴突导向相关的基因3。室管膜周围内皮细胞还含有一个不同于传统神经元GABA信号通路的新型GABA信号通路5。与其基因表达特征一致，研究发现室管膜周围内皮细胞可调控发育中新皮层中GABA能中间神经元的迁移与分布。在胚胎发育过程中，室管膜周围内皮细胞沿腹侧-背侧梯度进行长距离迁移，从而建立室管膜周围血管网络2,3。这一迁移路径约一天后被中间神经元所重复。迁移中的中间神经元与预先形成的室管膜周围血管网络发生物理相互作用，并将其作为“导轨”以到达新皮层中的最终位置。除了作为物理支架外，室管膜周围内皮细胞还为迁移的神经元提供导航信号。室管膜周围内皮细胞分泌的GABA可引导中间神经元的迁移并调控其最终分布模式4。中间神经元迁移与分布异常与多种神经精神疾病相关，如自闭症、癫痫、精神分裂症和抑郁症6,7,8,9,10。因此，研究室管膜周围内皮细胞在人类背景下的功能及其对中间神经元迁移的影响，对于阐明这些疾病的发病机制至关重要。

我们在实验室中利用诱导性多能干细胞（iPSC）技术12,13，由人胚胎干细胞成功生成了类似人脑室周围区域的内皮细胞11。为了验证这些人脑室周围内皮细胞是否能够真实模拟小鼠脑室周围内皮细胞的特性，并定量评估其对中间神经元迁移的影响，我们开发了三种体外实验方法：长距离迁移实验、共培养迁移实验和化学趋化吸引实验。本文详细描述了这些实验的方案。这三种实验均基于使用硅胶培养插件，在培养皿上形成一个具有固定尺寸的小型矩形细胞区域，周围为无细胞区域。细胞迁移距离通过测量从第0天划定的矩形区域边界到细胞最终位置之间的距离来评估。在长距离迁移实验中，将人脑室周围内皮细胞以细胞斑块形式接种于35 mm培养皿中央，计算细胞在较长时间内的迁移距离。在共培养迁移实验中，将人脑室周围内皮细胞与人源中间神经元共同接种为一个细胞斑块，置于35 mm培养皿中，该设置可用于检测这两种细胞类型之间直接物理相互作用对中间神经元迁移速率的影响。化学趋化吸引实验用于检测中间神经元对人脑室周围内皮细胞所分泌的化学趋化信号的迁移反应。实验中将中间神经元接种为一个矩形细胞斑块，人脑室周围内皮细胞和作为对照的非脑室周围内皮细胞则分别接种于其两侧、大小相似的细胞斑块中，各细胞斑块之间由500 µm的无细胞间隙隔开。通过定量分析向脑室周围内皮细胞方向迁移的中间神经元数量，并与向对照非脑室周围内皮细胞迁移的数量进行比较，从而评估中间神经元的迁移反应。

这些检测方法可对人脑室周围内皮细胞的功能及其对中间神经元迁移的影响进行稳健评估。长距离迁移检测和共培养迁移检测的新颖设计提供了厘米级（约1~1.5 cm）的无细胞空间，从而能够检测长距离的细胞迁移。下表总结了本检测方法与其他常用检测方法的特征比较。 表1综合所述，本文所述的检测方法将为评估提供一个平台 "患病的" 由精神分裂症、自闭症或癫痫等脑部疾病患者的iPSCs分化生成的室管膜周围内皮细胞和中间神经元。这些检测方法也可用于确定不同条件（如抑制剂、配体、RNA干扰）对细胞迁移的影响。最后，这些检测方法可针对其他细胞类型进行优化，以测量长距离迁移、化学趋化或细胞间介导的迁移。

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方案

1. 人脑室周围内皮细胞的培养与保存

  1. 将人脑室周围内皮细胞培养于基底膜基质包被的（见材料表）6孔板中，使用脑室周围内皮细胞培养基（E6培养基，含50 ng/mL VEGF-A、100 ng/mL FGF2和5 µM GABA），在37 °C、5% CO2条件下培养。每隔一天更换一次培养基。
  2. 在4 °C条件下解冻基底膜基质，用冷的DMEM/F12培养基将其稀释成1:100的溶液。每孔加入1 mL基质溶液对6孔板各孔进行包被。使用前将培养板在37 °C孵育至少1小时。
  3. 待人脑室周围内皮细胞生长至80%–90%融合度时，吸除孔内培养基。每孔加入1 mL无菌1×PBS洗涤一次。
  4. 每孔加入1 mL细胞解离液（见材料表）使细胞脱离。在37 °C孵育5分钟。5分钟后，每孔加入1 mL脑室周围内皮细胞培养基。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
    注：此处使用Accutase进行细胞解离，而第3和第4部分则使用TrypLE。
  5. 在室温下以500 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL脑室周围内皮细胞培养基中。
  6. 采用台盼蓝排斥法计数活细胞。以1.2 × 105 个细胞/cm2的密度将细胞接种至新鲜基质包被的培养板中。在37 °C、5% CO2条件下孵育。
  7. 通过冷冻保存法储存人脑室周围内皮细胞，冷冻液成分为90%脑室周围内皮细胞培养基和10% DMSO。
    1. 按照上述步骤1.3和1.4进行细胞解离与收集。采用台盼蓝排斥法对悬液中的细胞进行计数。
    2. 在室温下以500 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于冷冻液中，浓度为5 × 106 个细胞/mL。
    3. 每支冻存管中加入含细胞的冷冻液1 mL。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80 °C以1 °C/min速率缓慢降温过夜。次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

2. 检测用人脑室周围内皮细胞的制备

  1. 使人脑室周围内皮细胞生长至70%–80%融合度。
  2. 按照上述步骤1.3至1.5进行细胞解离。使用台盼蓝排斥法计数细胞。

3. 检测用人类GABA能中间神经元的制备

注意：人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的 GABA 能中间神经元及神经元培养基均购自商业途径（参见材料表）。这些神经元系通过将人成纤维细胞来源的 iPSC 细胞系进行分化而获得，分化过程依据生产商开发的方案进行。细胞复苏与培养均按照生产商提供的方案操作。

  1. 解冻人源GABA能中间神经元，并在12孔板中培养两周，至细胞融合度达到70%–80%。
  2. 实验当天，将细胞解离液（见材料表）和一份神经元培养基在使用前于37 °C预热10分钟。
  3. 吸除含细胞各孔中的培养基，每孔用1 mL无菌1×PBS洗涤一次。
  4. 每孔加入0.5 mL预热的解离液，37 °C孵育5分钟以解离细胞。每孔加入1 mL神经元培养基，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，轻轻吹打以充分解离细胞团块。
  5. 室温下以380 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL神经元培养基中，使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

4. 检测用对照人内皮细胞的制备

注意：对照组人iPSC来源的内皮细胞及内皮细胞培养基均购自商业来源（材料表）。这些内皮细胞系通过将人成纤维细胞来源的iPSC系按照生产商开发的方案诱导分化为内皮细胞而获得。细胞按生产商方案解冻后，在纤连蛋白基质上进行培养。纤连蛋白包被的培养板按生产商方案制备。

  1. 解冻对照人血管内皮细胞，并在6孔板中培养至80%–90%融合度。
  2. 在检测当天，将细胞解离溶液（见材料表）和一份内皮细胞培养基在37 °C预热10分钟，备用。
  3. 吸除含细胞各孔中的培养基，每孔用1 mL无菌1×PBS洗涤细胞一次。
  4. 每孔加入0.5 mL预热的解离溶液使细胞脱离，室温孵育5分钟。每孔加入1 mL内皮细胞培养基以中和解离溶液。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
  5. 室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL内皮细胞培养基中，使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

5. 单孔培养插件的制备

  1. 在室温下或4 °C过夜解冻1 mg/mL层粘连蛋白溶液。
  2. 用0.01%多聚-L-鸟氨酸溶液（每皿1 mL）包被适量的35 mm培养皿。在室温下孵育至少1小时。
  3. 使用前立即用无菌水将1 mg/mL层粘连蛋白溶液按1:300稀释，终浓度为3.3 µg/mL。
  4. 彻底吸除各培养皿中的多聚-L-鸟氨酸溶液。用无菌水充分冲洗每皿3次，并彻底吸净，以避免多聚-L-鸟氨酸引起的细胞毒性。
  5. 向每皿中加入1 mL 3.3 µg/mL层粘连蛋白溶液，在37 °C孵育过夜或至少1小时。使用前立即从培养皿中移除层粘连蛋白溶液。
    注意：也可将含层粘连蛋白的培养皿储存于4 °C。使用前在37 °C细胞培养孵箱中平衡。
  6. 使用无菌刀片切割双孔硅胶培养插件（图1A）中一个孔的三边，制备单孔插件（图1B）。
    注意：切割时保持双孔插件牢固附着于原始包装表面，以确保切口平整并保护插件的粘附性。
  7. 吸除培养皿中的层粘连蛋白溶液。
    注意：层粘连蛋白孵育后，切勿用无菌PBS或水洗涤培养皿。湿润表面会阻碍培养插件的紧密粘附。
  8. 用无菌镊子取出单孔插件，将其置于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿中央。沿插件边缘按压，使其牢固固定于培养皿表面。
  9. 小心将培养皿倒置，确认插件已牢固粘附。
  10. 保持培养皿倒置状态，使用超细尖永久性黑色记号笔标记插件腔室的边界（图1C）。

6. 长距离迁移实验

  1. 将人源GABA能中间神经元以每70 µL神经元培养基含3 × 104个细胞的浓度重悬。每孔培养插件中接种70 µL细胞悬液。
    注意：中间神经元的接种密度依据制造商推荐。
  2. 将人源室管膜周围内皮细胞以每70 µL室管膜周围内皮细胞培养基含3 × 104个细胞的浓度重悬。每孔培养插件中接种70 µL细胞悬液。
    注意：接种的人源室管膜周围内皮细胞数量与神经元数量之比为1:1。
  3. 在神经元培养皿中加入1 mL神经元培养基，填充插件周围区域，防止包被层干燥。同样，在室管膜周围内皮细胞培养皿中加入1 mL室管膜周围内皮细胞培养基。
    注意：沿培养皿边缘缓慢加入培养基，避免扰动插件。
  4. 在显微镜下观察，确认细胞未从插件腔室泄漏。
  5. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。培养24小时后，在显微镜下检查，确认细胞已正常贴壁且无夜间泄漏现象。
  6. 接种48小时后，使用无菌镊子轻轻取出插件。在显微镜下检查，确认细胞层保持完整无扰动（第0天）。
  7. 移除神经元培养皿中的培养基，并加入1 mL新鲜神经元培养基。同样，移除室管膜周围内皮细胞培养皿中的培养基，并加入1 mL新鲜室管膜周围内皮细胞培养基。
    注意：预留所需数量的培养皿，用4%多聚甲醛固定，用于获取第0天图像。
  8. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养5天。5天后，移除培养基，用4%多聚甲醛固定10分钟，并用1× PBS洗涤3次。
  9. 使用抗人β-Tubulin或抗人MAP2抗体对神经元进行染色，使用抗人CD31抗体对内皮细胞进行染色。免疫染色完成后，每皿加入1 mL抗荧光淬灭封片剂。

7. 共培养迁移实验

  1. 将 3 × 104 个 GABA 能中间神经元和 3 × 104 个人脑室周围内皮细胞共同悬浮于 70 µL 共培养基中（50% 脑室周围维持培养基不含 GABA，50% 神经元培养基）。将该细胞悬液接种至单孔插件腔室内。准备适当数量的此类检测培养皿。
    注意：共培养基中未添加 GABA，以排除外源性 GABA 对细胞迁移的影响。
  2. 在显微镜下检查，确认细胞未从插件腔室泄漏。
  3. 沿培养皿侧壁缓慢加入 1 mL 共培养基，防止包被层干燥。
    注意：应沿培养皿边缘缓慢加液，避免扰动插件。
  4. 作为第一项对照，在每孔插件中仅接种 3 × 104 个人源 GABA 能中间神经元于 70 µL 共培养基中。准备适当数量的此类培养皿。
  5. 作为第二项对照，在每孔插件中将 3 × 104 个人源 GABA 能中间神经元与 3 × 104 个人源对照内皮细胞共同接种于 70 µL 共培养基中。准备适当数量的此类培养皿。
  6. 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。孵育 24 小时后，在显微镜下检查，确认细胞已正常贴壁且无泄漏现象。
  7. 接种后 48 小时，使用无菌镊子轻轻移除插件。在显微镜下检查，确认细胞层未受扰动（第 0 天）。
  8. 移除培养基，并加入 1 mL 新鲜共培养基。
    注意：保留适当数量的培养皿用于获取第 0 天的图像。
  9. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 5 天。
  10. 5 天后，移除培养基，用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，并用 1× PBS 洗涤 3 次。
  11. 使用抗人 β-Tubulin 或抗人 MAP2 抗体对神经元进行染色。免疫染色结束后，向每个培养皿中加入 1 mL 抗荧光淬灭封片剂。

8. 化学趋化性实验

  1. 使用无菌镊子将一个三孔细胞培养插件放置在已包被多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的35 mm培养皿中央。
  2. 将培养皿倒置，使用超细尖头的永久性黑色记号笔在插件中间孔室周围标记边界。
  3. 在中间孔室中加入3 × 104个人类GABA能中间神经元，悬浮于70 µL神经元培养基中（图3A）。
  4. 在两个外侧孔室中分别加入104个人类室管膜周围内皮细胞（悬浮于70 µL室管膜周围内皮细胞培养基）和104个对照内皮细胞（悬浮于70 µL对照内皮细胞培养基）（图3A）。
  5. 沿培养皿壁加入1 mL共培养培养基（50%不含GABA的室管膜周围维持培养基和50%神经元培养基），以防止培养皿表面包被物干燥。
  6. 在显微镜下检查，确认细胞未从插件孔室中泄漏。
  7. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。孵育24小时后，在显微镜下检查，确认细胞已正常贴壁且无泄漏现象。
  8. 接种48小时后，使用无菌镊子轻轻移除插件。在显微镜下检查，确认细胞层未受扰动（第0天）。
  9. 移除培养基，并加入1 mL新鲜共培养培养基。
    注意：预留所需数量的培养皿用于第0天的成像。
  10. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育36小时。36小时后，吸除培养基，用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并用1× PBS洗涤3次。
  11. 使用抗人β-微管蛋白抗体或抗人MAP2抗体对人类GABA能中间神经元进行染色。染色步骤结束后，向每个培养皿中加入1 mL抗荧光淬灭封片剂。

9. 成像与数据分析

  1. 将免疫染色后的检测培养皿置于显微镜下，以 4 倍物镜放大观察。
  2. 使矩形边界的一条长边（如上文步骤 5.10 所制）保持在视野范围内。对紧邻该边界外侧无细胞区域中的细胞进行成像。沿矩形边界的右侧长边和左侧长边分别采集图像（图 2B）。
    注意：由于难以明确选择短边或长边作为起始参考，与矩形呈对角方向分布的细胞不予考虑。此外，跨越短边迁移的细胞数量通常显著较少（可能由于短边起始位置的细胞数量较少），因此也不予统计。
  3. 在 ImageJ 中打开所获图像，使用 ImageJ 测量每个细胞与边界标记之间的距离（图 2D）。
  4. 为以细胞数量评估迁移情况，需在 ImageJ 中设定图像中距边界的特定距离范围，统计位于该距离范围内的细胞数量，并使用适当的软件计算平均值、标准差及统计学显著性。

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结果

在35 mm培养皿内设置单孔培养插件的步骤如图1所示。长距离迁移实验和共培养迁移实验均采用单孔插件，将所需数量的细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的35 mm培养皿中央。在第0天，细胞呈矩形区域分布（图2A,C）。在第0天的图像中，可通过细胞层的清晰边缘（图2C中的白色虚线）轻松识别第0天线。48小时后，细胞已迁移至无细胞区域（图2B,D）。在第0天之后的图像中，围绕插件（位于培养皿背面）绘制的黑色边框可清晰观察为一条黑色间隙。该间隙的边缘被定义为第0天线（图2D中的白色虚线）。如步骤9.2所述，仅将位于细胞层左右长边相邻区域内的细胞...

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讨论

本文描述了三种体外实验方法，这些方法共同提供了对人脑室周围内皮细胞特异性特性的定量评估。这些实验方法将有助于深入理解人脑室周围内皮细胞与人中间神经元之间的相互作用机制。通过使用配体、抑制剂，或基因特异性敲低或过表达的细胞进行实验，可鉴定或验证介导内皮细胞引导的中间神经元迁移，或脑室周围内皮细胞长距离迁移特性的分子因子。这些实验方法还可进行改造，用于活细胞延时成像迁移研究。此外，已有证据表明内皮细胞与其他非中间神经元细胞之间也存在相互作用。我们课题组及其他团队的研究提示，脑室周围内皮细胞可能影响投射神经元的模式形成以及神经前体细胞的增殖5,14,15。利用本实验体系检验这些潜在的相互作用将具有重要意义。最后，这些实验方法可作为评估疾病状态下脑室周围内皮细胞功能的平台。我们的研究已建立了脑室周围血管网络与精神神经疾病（如精神分裂症、癫痫、自闭症和重度抑郁症）发生之间新的自主性关联3,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国家心理健康研究所（R01MH110438）和国家神经疾病与卒中研究所（R01NS100808）向 AV 资助的奖项支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accutase 解离液Millipore SigmaSCR005细胞解离液（用于脑室周围内皮细胞，步骤 1.4）
抗人 β-微管蛋白抗体Biolegend802001
抗人 CD31 抗体Millipore SigmaCBL468
抗 MAP2 抗体NeuromicsCH22103
抗活化型 Caspase 3 抗体Millipore SigmaAB3623
对照人内皮细胞Cellular DynamicsR1022
对照内皮细胞培养基添加剂Cellular DynamicsM1019
冻存管Fisher Scientific03-337-7Y
DMEMF/12 培养基Thermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 培养基Thermofisher ScientificA1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
纤连蛋白Thermofisher Scientific33016-015
程序降温盒Thermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
血细胞计数板Sigma-AldrichZ359629
人 GABA 能神经元Cellular DynamicsR1013
人 GABA 能神经元基础培养基Cellular DynamicsM1010
人 GABA 能神经元神经添加剂Cellular DynamicsM1032
层粘连蛋白SigmaL2020
MatrigelCorning356230基底膜基质
封片剂Vector laboratoriesH-1200
多聚-L-鸟氨酸Sigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
台盼蓝Thermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher Scientific12563011细胞解离液（用于 GABA 能中间神经元和内皮细胞，第 3 和第 4 部分）
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF 完全培养基试剂盒Lifeline Cell TechnologiesLL-0003对照人内皮细胞培养基的组分
2 孔硅胶细胞培养插件ibidi80209
3 孔硅胶细胞培养插件ibidi80369
35 mm 培养皿Corning430165
15 ml 锥形离心管Fisher Scientific07-200-886
4% PFA 溶液Fisher ScientificAAJ19943K2
6 孔组织培养板Fisher Scientific14-832-11
倒置相差显微镜ZeissZeiss Axiovert 40C
荧光显微镜OlympusFSX-100

参考文献

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