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框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退

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DOI：

10.3791/60297

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2020年1月8日

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种简单且可重复的小鼠感染模型实验方案，用于评估基因修饰菌株的减毒特性 铜绿假单胞菌 与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 大肠杆菌 用于商业用途。

摘要

微生物具有丰富的遗传多样性和变异性，已成为许多商业产品和生物制药的重要来源。尽管其中一些产品可由生物体天然产生，但其他产品则需要对生物体进行基因工程改造以提高产量。减毒的Escherichia coli菌株传统上是生产生物制药的首选细菌种类；然而，某些产品难以由E. coli有效生产。因此，其他细菌种类的减毒菌株可能为某些商业产品的生产提供有用的替代方案。Pseudomonas aeruginosa是一种常见且研究充分的革兰氏阴性细菌，可作为E. coli的合适替代选择。然而，P. aeruginosa是一种机会性人类病原体。本文详细介绍了一种利用pEX100T-NotI质粒通过连续基因组缺失生成非致病性P. aeruginosa菌株的方法。该方法的主要优势在于可获得无标记基因的菌株。该方法可用于构建高度减毒的P. aeruginosa菌株，以用于商业产品的生产，或设计用于其他特定用途的菌株。我们还描述了一种简单且可重复的小鼠细菌系统性感染模型，通过腹腔注射经验证的测试菌株，以评估基因工程菌株的减毒效果，并与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的E. coli BL21菌株进行比较。

引言

铜绿假单胞菌 是一种机会性细菌病原体，可在人类中引起危及生命的疾病，尤其是在免疫功能低下者中。该病原体的致病性 P. aeruginosa 是由于表达多种毒力因子，包括蛋白酶和脂多糖，以及其形成保护性生物膜的能力1由于其能够产生毒力因子并在人类中引发疾病，使用 P. aeruginosa 用于商业产品时存在安全问题。非致病性菌株 E. coli 传统上已被用于生物工程化开发供人类使用的医药和商业产品。然而，某些产品对于 E. coli 以进行生产，且许多产物会形成包涵体，导致提取过程繁琐耗时。能够合成并分泌特定产物的基因工程菌株极具应用价值，因为分泌表达有望提高产量并简化纯化流程。因此，其他细菌物种中的非致病性菌株（例如具有更多分泌途径的物种）可能为 E. coli我们最近报道了一种菌株的开发 P. aeruginosa，PGN5，其中该生物体的致病性和毒性显著减弱2重要的是，该菌株仍能大量产生多糖海藻酸盐，这是一种具有商业价值的成分 P. aeruginosa 生物膜

PGN5 菌株是利用 pEX100T-NotI 质粒通过两步等位基因交换方法构建的，依次删除了五个已知参与该生物体致病性的基因（toxA、plcH、phzM、wapR、aroA）。pEX100T-NotI 是通过将质粒 pEX100T 多克隆位点中的 SmaI 限制性酶切位点改造为 NotI 限制性酶切位点而获得的，pEX100T 最初由 Herbert Schweizer 实验室开发3,4。NotI 限制性内切酶的识别序列相较于 SmaI 更为罕见，因此在待克隆序列中出现的可能性更低，更适合用于克隆操作。该质粒携带可用于筛选的基因，包括编码 β-内酰胺酶并赋予羧苄青霉素抗性的 bla 基因，以及赋予蔗糖敏感性的 B. subtilis sacB 基因（图 1A）。此外，该质粒还含有可在 E. coli 中复制的复制起点（ori），以及可在接合过程中介导质粒从 E. coli 转移至 Pseudomonas 属的转移起点（oriT）。然而，该质粒缺乏能在 Pseudomonas 中起始复制的复制起点，因此无法在 Pseudomonas 中自主复制（即它是一种 Pseudomonas 自杀型载体）。这些特性使得 pEX100T-NotI 非常适用于靶向 Pseudomonas 染色体上的基因缺失。质粒的克隆步骤在 E. coli 中进行，构建完成的质粒随后通过转化或接合方式转移至 Pseudomonas 中。接着，通过同源重组事件和筛选步骤，实现目标基因的框内无标记缺失。这种逐步从 P. aeruginosa 染色体上删除基因组区域的方法可用于构建高度减毒的 Pseudomonas 菌株（如 PGN5），也可用于设计具有特定用途的菌株（例如缺乏内切核酸酶以利于质粒扩增，或缺乏蛋白酶以利于目标蛋白生产的菌株）。

细菌菌株的总体毒力受其生长条件和生长阶段的影响，在这些条件下突变频繁发生。因此，评估基因工程菌株的安全性具有挑战性。为了评价细菌分离株的系统性毒力，我们改进了先前发表的通过腹腔注射C57BL/6小鼠进行感染的实验方案5。我们对该方法进行了修改，使用冷冻保存的细菌菌种进行注射，从而实现精确给药，并便于验证所用菌株。在本模型中，采用已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于生物制药生产的E. coli BL21菌株作为对照安全标准，以评估待测菌株的相对致病性6,7,8。该方法的主要优势在于其可重复性强，并能最大限度减少变异来源，因为在感染前后均对感染用菌株的细菌数量、表型及遗传标记进行了验证。通过这些受控步骤，可减少所需实验动物的数量。在该模型中，当经腹腔注射后，若P. aeruginosa菌株引起的C57BL/6小鼠死亡率等于或低于E. coli BL21菌株，则可认为该菌株毒力减弱。这一简单的小鼠感染模型也可用于评估其他物种基因工程菌株的减毒致病性，参照标准为FDA批准的E. coli菌株。步骤1-7详细描述了在P. aeruginosa中连续进行基因组缺失的操作（图1），步骤8-12则详细说明了利用小鼠模型检测P. aeruginosa菌株致病性的方法。

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方案

在开始动物实验之前，所采用的实验方案必须获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本实验方案已获得马歇尔大学（美国西弗吉尼亚州亨廷顿）机构动物照护与使用委员会的批准。

1. 质粒设计

  1. 使用 pEX100T-NotI 质粒构建基因缺失时，需克隆目标缺失序列上下游的DNA片段，并将其插入质粒的 NotI 限制性酶切位点。插入片段应包含约500个核苷酸的靶序列上游区域，紧邻约500个核苷酸的靶缺失序列下游区域。此外，插入片段的5'和3'末端应包含NotI识别序列（GCGGCCGC）（图1B）。

2. 质粒制备

  1. 方案1：采用传统克隆方法。通过PCR扩增目的基因上下游的基因组区域，随后进行重叠PCR9,10以连接所获得的片段，对PCR产物和质粒进行限制性内切酶消化，并进行连接11（图1B,C）。
  2. 方案2：在计算机中设计好缺失序列后，委托公司从头合成该序列并插入至质粒pEX100T-NotI中。许多公司已优化克隆流程，可快速高效地构建目标质粒。此外，在交付前应对质粒进行测序验证，确保无突变。

3. E. coli 转化

  1. 根据制造商的建议，将质粒转化至电转感受态E. coli中。用无菌接种环取10 µL转化反应液，在预先温育的含100 µg/mL羧苄青霉素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上划线以获得单菌落，于37 °C培养过夜。
    注意：所有用于细菌培养的设备和培养基均应按照所在机构的安全指南进行处理。
  2. 连续传代两次。
    1. 从培养箱中取出平板，挑取一个单菌落。用无菌接种环挑取该菌落，在预先温育的含100 µg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板上划线以获得单菌落，于37 °C过夜培养。重复此步骤一次，以获得纯培养物。
  3. 用无菌接种环从最终的琼脂平板上挑取单菌落，接种至5 mL LB液体培养基中，于37 °C振荡培养过夜。次日，取1 mL菌液与1 mL 5%甘油混合，置于冻存管中，于-80 °C保存，制备该菌株的甘油冻存液。

4. 细菌菌株制备与三亲本接合

  1. 从以下菌株的琼脂平板上挑取单个分离菌落，接种于液体培养基中，并于37 °C摇床培养箱中过夜培养。
    1. 将含有100 µg/mL羧苄青霉素的5 mL LB培养基接种E. coli pEX100T-NotI。
    2. 将5 mL假单胞菌分离肉汤（Pseudomonas Isolation Broth, PIB）接种P. aeruginosa菌株PAO1。
    3. 将含有50 µg/mL卡那霉素的5 mL LB培养基接种E. coli prk2013。
      注意：prk2013质粒是一种辅助质粒，可在E. coli中复制，但在P. aeruginosa中不能复制；其携带反式作用的转移基因，可介导pEX100T-NotI质粒从E. coli供体菌转移到P. aeruginosa受体菌12。P. aeruginosa属于生物安全二级（BSL-2）病原体。操作BSL-2生物体时，请遵循所在机构的安全指南。
  2. 次日，从培养箱中取出过夜培养物，分别取0.5 mL培养液加入1.5 mL微量离心管中，于6,000 × g离心5分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于50–100 µL LB培养基中。
  3. 用移液器将全部细胞悬液以单滴形式转移至预热的LB琼脂平板表面，待液滴自然干燥后，将平板倒置，于37 °C培养4–6小时。
  4. 培养结束后，用无菌接种环收集菌体，转移至含1 mL LB培养基的微量离心管中，反复吹打混匀细胞。
  5. 使用涂布棒将细胞均匀涂布于已预热且干燥的假单胞菌分离琼脂（Pseudomonas Isolation Agar, PIA）平板上，该平板含有300 µg/mL羧苄青霉素。使用不同体积的细胞混合液（例如10 µL、100 µL、500 µL）涂布多个平板，于37 °C过夜培养。

5. 单交换重组子的检测 P. aeruginosa

  1. 从培养箱中取出平板，检查是否存在孤立的羧苄青霉素抗性菌落。由于 pEX100T-NotI 质粒无法在 P. aeruginosa 中复制，因此在添加羧苄青霉素的平板上生长的菌落应来源于质粒已整合到染色体中的细胞。
    1. 挑选至少 4 个此类菌落，用划线法将其分离接种至预热的 PIA 平板（含 300 µg/mL 羧苄青霉素）上。于 37 °C 培养过夜。
  2. 从培养箱中取出平板，观察生长情况。羧苄青霉素抗性菌落应为单交换重组子（即通过质粒插入片段与 P. aeruginosa 染色体之间的同源区域发生重组事件，将质粒整合入染色体）。
    1. 用无菌牙签将 8 个或更多菌落分别点种到预热的以下两种平板上：1）含 300 µg/mL 羧苄青霉素的 PIA 平板；2）含 300 µg/mL 羧苄青霉素和 10% 蔗糖（不含甘油）的 PIA 平板。
    2. 若步骤 5.1 未获得菌落生长，重复接合实验，并增加步骤 4.5 中涂布的细胞混合物体积；若生长过多，则重复接合并减少涂布体积。
    3. 若接合实验反复失败，可制备 P. aeruginosa 菌株的电转化感受态细胞，并直接用 pEX100T-NotI 质粒进行转化。有关制备电转化感受态 P. aeruginosa 及转化的详细方案可参见其他文献13,14。
  3. 将平板于 37 °C 培养过夜。
  4. 从培养箱中取出平板，检查生长情况。真正的单交换重组子应表现为羧苄青霉素抗性且蔗糖敏感（即在含羧苄青霉素的 PIA 平板上生长，但在含羧苄青霉素和蔗糖的 PIA 平板上不生长）。
    1. 挑选 4 个或更多真正的单交换重组子，分别接种至 5 mL 无选择压力的 LB 培养基中。在 37 °C 摇床培养过夜。
    2. 若未检测到单交换重组子，重复接合实验。

6. 双交换重组子的检测 P. aeruginosa

  1. 对于每种肉汤培养物，取10 µL培养液接种至预先温育的含10%蔗糖（不含甘油）的PIA平板上，并划线以获得单菌落。于37 °C培养过夜。
  2. 次日，从培养箱中取出平板并检查菌落生长情况。蔗糖抗性菌落应为双交换重组子（即通过质粒插入片段的另一同源区域与P. aeruginosa染色体之间的重组事件，已将质粒从染色体上切除）。
    1. 用无菌牙签挑取至少20个菌落，分别点种到预先温育的以下三种平板上：1）PIA平板；2）含10%蔗糖（不含甘油）的PIA平板；3）含300 µg/mL羧苄青霉素的PIA平板。
  3. 于37 °C培养过夜。
  4. 从培养箱中取出平板，观察菌落生长情况。真正的双交换重组子应表现为对羧苄青霉素敏感且具有蔗糖抗性（即菌落在PIA平板和含蔗糖的PIA平板上生长，但在含羧苄青霉素的PIA平板上不生长）。

7. 通过菌落PCR确认基因敲除

  1. 为进行PCR缺失筛选，准备10-20个菌落。
    1. 用无菌牙签挑取疑似双交换重组子的菌落生长物，悬浮于50 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。在100 °C下煮沸10分钟，于13,000 × g 离心3分钟，然后置于冰上。
  2. 进行PCR以筛选目标基因缺失的菌落。
    1. 取1 µL上清液作为模板，在25 µL的PCR反应体系中扩增，以确认目标基因的缺失。
    2. 使用特异性引物扩增基因组缺失区域，引物应覆盖缺失区域及其上下游各100-200 bp的侧翼序列。
    3. 另设一组以亲本菌株（如PAO1）为模板的对照PCR反应。
      注：PCR仪的反应条件需根据引物对的最佳退火温度、所用聚合酶混合物以及待扩增片段长度进行调整。
  3. 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。目标区域成功缺失的菌落所产生的扩增片段小于未发生缺失的菌落（图2）。
  4. 选择一个或多个经PCR验证存在缺失的菌落，在预热的PIA平板上划线分离单菌落，并于37 °C过夜培养。
  5. 至少再传代一次。将平板从培养箱中取出，挑取单个孤立菌落，用无菌接种环接种至预热的PIA琼脂平板上划线分离单菌落，37 °C过夜培养。
  6. 从每块最终平板中选取一个菌落，接种于5 mL PIB培养基中，置于37 °C摇床中过夜培养。
    1. 取1 mL该培养物与1 mL 5%脱脂牛奶混合，置于冻存管中，于-80 °C保存，以建立菌种保藏株。
    2. 利用该培养物提取基因组DNA（例如使用DNA纯化试剂盒），并通过PCR及特异性引物扩增基因组缺失区域。
      1. 纯化上述PCR产物（例如使用DNA纯化试剂盒或苯酚-氯仿抽提法），可直接使用基因特异性引物进行测序，或将产物连接至载体后使用质粒特异性引物进行测序。
  7. 在测序确认基因缺失后，以新获得的缺失菌株为起点重复上述操作，逐步构建多个无标记的基因组缺失株。当获得目标菌株后，应进行全基因组测序，以验证目标缺失位点，并检测在整个构建过程中相对于参考菌株（如PAO1）发生的其他基因组变异。完成基因注释后，将序列提交至GenBank并记录登录号。

8. 动物实验用菌株的制备

  1. 为了检测减毒的致病性 P. aeruginosa 菌株，首先准备经过验证的培养物和保存菌种。准备 P. aeruginosa 感兴趣的菌株，一种野生型菌株 P. aeruginosa （有致病性的），以及一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的菌株 E. coli （例如 BL21）作为非致病性安全对照。
  2. 将待测菌株从测序并验证过的冷冻保存菌种中划线接种至选择性琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
  3. 用无菌接种环从每种菌株中挑取单个菌落，并再次在选择性培养基上划线以获得单菌落。37 °C 过夜培养。
  4. 从培养箱中取出平板。针对每种菌株，挑选单个菌落，并在LB平板上划线分离。
  5. 在37 °C培养24小时后，从每种菌株中挑取单个菌落，接种于含有250 mL LB培养基的500 mL锥形瓶中。
    1. 验证步骤：利用同一菌落的剩余部分，使用PCR及菌株特异性引物对菌株进行验证，和/或使用引物确认菌株中所引入的遗传修饰是否存在。针对本示例中所展示的菌株验证，请使用以下引物：
      E. coli BL21
      T7 聚合酶 F：TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 聚合酶 R：TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 和 PGN5：
      aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      aroA R：ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
  6. 在37 °C、160 rpm条件下，将培养物置于摇床培养箱中孵育，直至达到对数生长期（即OD600 分光光度计测定值为0.4–0.6。
  7. 使用OD600 对数期达到时获得的数值，计算获得 2.5 x 10 所需的培养液体积9 每毫升菌落形成单位（CFU）。将计算好的肉汤体积加入50 mL离心管中，于4,500 × g离心收集菌体 g 10 分钟。
  8. 弃去上清液，用 50 mL 1x PBS 将沉淀重悬于一个离心管中以洗涤细胞。再次在 4,500 x g 10 分钟
  9. 弃去上清液，将沉淀重悬于25 mL含5%脱脂奶粉的1x PBS溶液中。
    1. 验证步骤：取25 mL重悬液样品进行活菌平板计数，以确定CFU/mL数量。
  10. 将25 mL脱脂牛奶培养重悬液分装至2 mL冻存管中，每管2 mL。在液氮中速冻后，于-80 °C保存至少过夜，方可使用。

9. 用于动物测试的菌种保藏株的生长与菌株验证。

  1. 针对每种待测菌株，从 -80 °C 保存条件下取出至少 3 支冻存管，在 4 °C 下解冻 2–4 小时。若仍有冻存样品剩余，可在 37 °C 下短暂温育。
  2. 从每支冻存管中取少量样品以验证各菌株。
    1. 进行活菌平板计数以确定 CFU/mL 数量。由于部分细菌细胞在冻存过程中死亡，解冻后 CFU/mL 数值降低属于正常现象。
    2. 使用 PCR 及菌株特异性引物对每种菌株进行验证。
    3. 将每种菌株划线接种至选择性培养基，以确认其表型。
  3. 在确认菌株具有正确的基因型和表型，并完成 CFU/mL 验证后，进行动物实验。

10. 通过注射将细菌菌株接种至动物

  1. 注射当天早晨，取出待测的细菌菌株冻存管，在 4 °C 下解冻 3–4 小时。每只待注射小鼠准备 0.5 mL。解冻后将冻存管置于冰上，并在 2 小时内完成小鼠注射。
  2. 解冻后，将每支冻存管转移至新的 2 mL 离心管中，在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于 1 mL 1× PBS 中。
  3. 再次在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀用 1× PBS 重悬至终浓度为 2.5 × 109 CFU/mL。为确定重悬所需的 1× PBS 体积，请使用步骤 2.2.1 中通过冻存菌株平板活菌计数获得的 CFU/mL 数据。不同菌株所需 1× PBS 体积略有差异。
    1. 从每种菌株的最终悬液中取 3 个样本，按照前述方法验证 CFU/mL、基因型和表型。
  4. 针对每种菌株，将 1.5 mL PBS/菌液悬液分装至每 5 只小鼠使用一支的 2 mL 离心管中，以减少对同一管的多次穿刺。同时，准备用于对照注射的 1× PBS 管。
  5. 准备实验小鼠（本实验每组 10 只雄性和 10 只雌性 C57BL/6 小鼠）及注射所需材料（注射器、针头、锐器盒、标记笔、纸笔等。），转移至无菌动物手术室，并用消毒湿巾擦拭所有操作表面。
    1. 为避免小鼠产生应激反应及实验人员受伤，每次仅将一种性别和一个实验组的小鼠带入手术室（例如，一次带入 10 只雄性小鼠用于特定菌株感染）。佩戴两副乳胶手套，以防被咬破；同时穿戴实验服、护目镜和口罩，防止污染。
  6. 开始对对照组小鼠注射 1× PBS，以确认注射操作本身是否会引起不良反应。
    1. 从小鼠笼中取出一只小鼠，每次仅取出一只。
    2. 称量小鼠体重，并用永久性记号笔在其尾部做标记，以便追踪注射后体重变化。
    3. 打开一支新的 1 mL 注射器和 27 G 针头（每只小鼠使用新的注射器和针头，防止交叉污染），注射 200 µL 无菌 1× PBS。
      1. 用拇指和食指抓住小鼠耳后部，捏起颈部背侧皮肤形成皱褶以固定——皱褶越紧，小鼠颈部活动越少，注射过程中被咬伤的风险也越低。用小指将尾巴固定在手掌中，使小鼠身体平贴，减少移动。
      2. 将小鼠翻转，以 30° 角将针头插入腹腔中线左侧或右侧区域。针头插入后轻微上抬，确保已进入腹腔而非刺入器官。缓慢注入 PBS 后拔出针头。
      3. 将使用过的针头放入指定的生物危害锐器盒中，不得重复使用注射器或针头。注射部位出现隆起（药液团块）属正常现象。
    4. 注射完成后，将小鼠转移至另一独立笼具中。
    5. 对下一只小鼠重复上述操作。当同一笼小鼠全部注射完毕后，立即将其放回原笼具。
  7. 完成对照组注射后，按照相同操作流程开始注射待测菌株悬液。
    1. 每只小鼠注射 200 µL 菌液悬液。当菌液起始浓度为 2.5 × 109 CFU/mL 时，每只小鼠接种剂量为 5 × 108 CFU。
      注：该浓度是通过前期动物实验优化确定的各菌株致死剂量。其他菌株或物种可能需要调整剂量。
  8. 所有注射完成后，将小鼠送回饲养室以减轻应激反应，并用消毒湿巾清洁操作区域。
  9. 注射后监测动物死亡情况：在 72 小时内每 3 小时检查一次笼内是否有死亡小鼠，之后 10 天内每 12 小时检查一次。每 12 小时记录一次小鼠体重，评估因疾病导致的体重下降。
  10. 记录注射后数小时内小鼠的异常行为，如姿势改变、缺乏理毛或挖掘行为、活动减少或呼吸异常等。因注射相关损伤而死亡的小鼠通常在注射后迅速出现异常行为并很快死亡；而因感染致死的小鼠通常在 18 小时后才开始出现异常行为或死亡。任何出现明显异常行为或严重病态体征（如呼吸急促或困难、活动减少、弓背姿势、眼窝凹陷、严重脱水等）的小鼠，应立即实施安乐死，以减少不必要的痛苦（符合本实验室已批准的 IACUC 协议要求）。但在本研究中，实验期间未出现需提前安乐死的小鼠。存活小鼠在测试结束后第 10 天实施安乐死。
  11. 完成为期 10 天的监测后，允许剩余动物充分恢复，并彻底清除测试期间接种的感染。随后按照 IACUC 规程对动物实施安乐死。

11. 动物死亡率的统计分析

  1. 使用绘图软件进行统计分析。任何能够绘制图形并执行统计分析的软件均可使用。
  2. 绘制死亡率数据时，使用 X 列表示时间（h），Y 列表示测试的组别。
  3. 使用代码 = 0（零）或代码 = 1 表示研究中的每只小鼠或受试对象，分别代表存活或死亡。
    1. 对于每只死亡的动物，在其所在组别的 Y 列中，于 X 列对应的死亡时间点处输入 1。如果某组在同一个时间点有多只动物死亡，可在 X 列中重复输入该时间点。例如，若某组中有三只受试对象在 3 h 死亡，则 3 h 时间点在 X 列中将出现三次。
    2. 对于每组中所有存活的动物，在测量的最终时间点对应的 Y 列中输入 0。例如，若有四只小鼠存活，则在 X 列中输入四个终止时间点，并在 Y 列中对应位置标记四个 0。
  4. 在输入所有组别的动物数据后，使用生存曲线图模板生成生存曲线图。
    1. 保持默认编码为 0 和 1。
    2. 将图形参数设置为百分比形式。
  5. 选择生存曲线参数后，使用 Mantel-Cox（对数秩）检验进行统计分析。
  6. 根据统计数据分析结果格式化 Kaplan-Meier 曲线图。
    注：若菌株的死亡率小于或等于亲本菌株和 FDA 批准的菌株（例如 E. coli BL21），则可认为该菌株具有减毒特性。

12. 利用生物发光成像观察感染过程

  1. 为了可视化感染进程，插入一个染色体上的生物发光操纵子（luxCDABE) 导入所测试的 PGN5 和 VE2 菌株中。用于标记这些菌株的质粒及实验方案由 Schweizer 实验室开发，可能不适用于所有细菌种类/菌株。13重要的是，感染的可视化是可选的；因此，无需将该操纵子插入基因组即可进行上述死亡率研究。
  2. 使用上述方法制备并验证菌株。此外，在每次验证步骤中均需检测标记菌株的生物发光情况。
  3. 菌株制备完成后，按照上述步骤，将生物发光菌株以每组10只动物进行注射。
  4. 每3小时使用具备生物发光成像功能的动物成像系统对动物进行一次成像，持续24小时。
    1. 首先通过设置相机参数并为动物加热载物台来准备成像仪。同时将氧气流速设定为每分钟1.5 L（或按照制造商的建议）。
    2. 成像仪和载物台稳定后，将一只小鼠在注射后立即放入麻醉室，并向室内通入3.5%异氟烷与氧气2 持续通气约4分钟。麻醉方法可能因使用的麻醉舱和/或麻醉剂不同而有所差异；请遵循制造商的建议。通过撤足反射试验确定麻醉是否充分。
    3. 将小鼠移至温度恒定的载物台上，使其仰卧，双臂伸展，并为其佩戴鼻罩，以在整个成像过程中持续给予2.5%异氟烷。
    4. 关闭门，对小鼠进行生物发光成像和X射线拍摄。
    5. 成像完成后，将小鼠放回笼中并进行监测。小鼠应在3-5分钟内恢复意识。
    6. 每3小时对小鼠进行一次成像，持续24小时，每次使用每组中的不同小鼠。由于重复暴露于麻醉可能产生不良影响，禁止在24小时内对同一只小鼠重复成像。每只小鼠每24–36小时仅应接受一次麻醉剂量。每次小鼠成像后，清洁成像平台。在两次成像间隔期间关闭成像仪。
      注意：无论注射何种菌株，生物发光信号均会逐渐减弱。发光强度和持续时间受多种因素影响，包括注射的细菌数量、小鼠品系、细菌菌株等。

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结果

如图2所示，可通过使用特异性引物进行菌落PCR来确认靶向基因组缺失，这些引物可扩增目标区域。携带基因组缺失的菌落与野生型菌落相比，会产生更短的PCR条带。通常对10–12个菌落进行PCR筛选，足以检测到至少一个携带靶向缺失的菌落。若经过多轮筛选仍未检测到缺失，应从接合步骤开始重复实验。若缺失仍无法实现，可能需要通过测序确认质粒插入片段，或重新设计插入片段，或该缺失可能是致死性的。通过PCR验证基因缺失后，需进一步通过测序确认缺失。所得菌株可重复进行该操作，以实现连续的基因组修饰。

如图所示 图3，减毒株腹腔注射相关的死亡率 P. aeruginosa PGN5（+mucE）为0%，相当于观察到的死亡率 E. coli BL21。另一方面，亲本菌株（VE2）经腹腔注射后导致80%的小鼠死亡。这些结果是...

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讨论

pEX100T-Not1 质粒是一种高效的介导工具，可用于实现无标记且保持读码框的连续基因组缺失。在构建减毒细菌菌株时，相较于引入点突变，完全删除基因序列可降低回复突变为强毒表型的可能性。此外，每缺失一个致病性基因，病原体的毒力会进一步减弱，从而增强减毒的稳定性。

通过简单修改质粒插入片段的设计，该方法也可用于产生除缺失以外的其他基因组修饰，例如点突变和插入。对于改造具有修饰代谢途径的细菌而言，这类修饰可能比整个基因的缺失更具实用性。连续的基因组修饰在构建适用于科研和工业特定用途的定制化细菌菌株方面具有重要意义。已有其他方法被用于在细菌中实现所需的无标记基因组修饰15,16,17,18。与所有基因组编辑方法一样，对基因组关键区域进行的修饰尝试可能是致死性的，因而无法成功。在这些情况下，需要鉴定不同的遗传修饰或其他候选基因，以获得...

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披露

作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R44GM113545和P20GM103434的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 平盖离心管ThermoScientificAB-0620通过 Fisher Scientific 购买
1 mL 注射器BD22-253-260通过 Fisher Scientific 购买
1.5 mL 一次性聚苯乙烯比色皿Fisher Scientific14955127
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific05-408-129
2.0 mL 冻存管Corning430659通过 Fisher Scientific 购买
27G 针头BD14-821-13B通过 Fisher Scientific 购买
50 mL 离心管Fisher Scientific05-539-13通过 Fisher Scientific 购买
Accu block 数字干浴器LabnetNC0205808通过 Fisher Scientific 购买
台式离心机 5804REppendorf04-987-372通过 Fisher Scientific 购买
台式微量离心机Sorvall75-003-287通过 Fisher Scientific 购买
培养箱VWR1540
羧苄青霉素二钠盐Fisher ScientificBP2648250
培养试管，聚苯乙烯材质Fisher Scientific14-956-6D通过 Fisher Scientific 购买
一次性接种环Fisher Scientific22-363-597
DNeasy UltraClean 微生物试剂盒（50 次）Qiagen12224-50或选用其他方法/供应商
E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒（50 次）Omega bio-tekD6493-01或选用其他方法/供应商
EcoRI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3101L
电穿孔比色皿Bulldog BioNC0492929通过 Fisher Scientific 购买
FastLink II DNA 连接试剂盒Epicentre TechnologiesLK6201H通过 Fisher Scientific 购买
硫酸庆大霉素Fisher ScientificBP918-1
甘油Fisher ScientificBP229-4
GoTaq G2 无色预混液PromegaM7833通过 Fisher Scientific 购买
Isothesia 异氟烷Henry Schein 动物健康29405
IVIS Lumina XRMS Series III 活体成像系统PerkinElmerCLS136340
卡那霉素单硫酸盐Fisher ScientificBP906-5
LE 琼脂糖Genemate3120-500通过 Fisher Scientific 购买
LB 培养基（Luria Broth）Difco240230通过 Fisher Scientific 购买
MicroPulser 电穿孔仪BioRad1652100
高纯度 Noble 琼脂Affymetrix/USBAAJ10907A1通过 Fisher Scientific 购买
NotI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliInvitrogenC404052通过 Fisher Scientific 购买
磷酸盐缓冲液粉末SigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
假单胞菌分离琼脂Difco292710通过 Fisher Scientific 购买
假单胞菌分离肉汤Alpha BiosciencesP16-115定制批次
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250 次）Qiagen27106或选用其他方法/供应商
摇床培养箱New Brunswick ScientificInnova 4080以 200 rpm 振荡
SimpliAmp 热循环仪Applied BiosystemsA24811
脱脂奶粉DifcoDF0032-17-3通过 Fisher Scientific 购买
小培养皿（100 O.D. × 10 mm）Fisher ScientificFB0875713
SmartSpec Plus 分光光度计Bio-Rad170-2525或选用其他方法/供应商
蔗糖Fisher ScientificS5-500
圆形牙签Diamond任意品牌的牙签，经高压灭菌
TOPO TA 克隆试剂盒（用于测序）Invitrogen45-0030
XAF-8 麻醉系统滤芯PerkinElmer118999
XGI 8 气体麻醉系统Caliper Life Sciences/Xenogen

参考文献

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PCR pEX100T NotI

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