绘制静息态 fMRI 中视觉皮层的区域均匀性和功能连接性

Summary

我们提出了一种分析功能磁共振成像数据的方案，以使用结合区域均匀性和功能连接方法研究视网膜色素变性患者的自发神经活动改变。

Abstract

区域均匀性 （ReHo） 和功能连接 （FC） 方法是一种无创功能磁共振成像 （fMRI） 方法，已被用于评估视网膜色素变性 （RP） 的同步神经元活动变化。本研究的目的是描述我们分析 RP 患者神经元活动变化的区域内和区域间同步的方法。ReHo 和 FC 联合方法的优点是它既无创又足够敏感，可以研究体内大脑同步神经元活动的变化。在这里，16 名 RP 患者和 14 名健康对照者在年龄、性别和教育程度上非常匹配，接受了静息态 fMRI 扫描。进行 2 个样本 t 检验以比较各组的 ReHo 和 FC。我们的结果显示，RP 患者发生视觉网络断开以及视网膜丘脑皮质通路和背侧视觉流的重组。在这里，我们逐步描述了这种方法的详细信息、它的使用以及它的关键参数的影响。

Introduction

功能磁共振成像 （fMRI） 是一种无创方法，可用于研究体内大脑功能和结构的改变。区域同质性 （ReHo） 和功能连接 （FC） 通常用于评估大脑活动的区域内和区域间同步。ReHo 是一种静息态 fMRI 方法，用于计算给定体素的时间序列与其最近邻域之间的相似性，这反映了大脑活动的局部同步¹。FC 用于研究空间远程区域时间序列² 之间的相似性。

fMRI 技术可以在眼病管理的情况下提供对视觉功能的客观评估。在这里，我们提出了一种结合了 ReHo 和 FC 方法的方法论方案，以分享这些经验并支持我们专业知识的传播。在本工作中，我们在视网膜色素变性 （RP） 受试者和健康对照 （HCs） 中使用 ReHo 和 FC 方案来详细说明该程序的细节。RP 是一种严重的遗传性眼病，其特征是夜视受损和进行性视力丧失 ^3,4。基因突变是 RP 的主要危险因素。视杆细胞和视锥细胞的死亡导致 RP 患者周边视力丧失，最终失明。先前的神经影像学研究表明 RP 患者的视觉皮层和视觉通路存在结构和功能异常 ^5,6,7。此外，扩散张量成像用于研究白质纤维束的完整性。相对于 HCs^8，RP 患者的表观弥散系数、主特征值和正交特征值显著升高，视神经各向异性分数显著降低。

在这里，我们的目标是探索神经元活动的区域内和区域间同步。我们调查了平均 ReHo 值和平均 FC 值是否与 RP 患者的临床变量相关。我们的方法可能使研究人员能够获得对 RP 患者周边视力丧失的神经机制的重要见解。

Protocol

该研究方案得到了武汉大学人民医院医学伦理委员会的批准。所有参与者都填写了一份书面同意书。

1. 参与者分类和筛选

1. 招募年龄、性别和教育程度高度匹配的 RP 受试者和 HC。
2. 确保所有参与者都符合以下标准: 1） 能够使用 MRI 扫描仪进行扫描（例如，没有心脏起搏器或植入的金属装置）;2） 没有幽闭恐惧症;3） 无心脏病、高血压或脑部疾病。

2. fMRI 数据的获取

注意:本协议中使用了具有八通道头线圈的 3 T MRI 扫描仪。

1. 在进行最终安全检查后，要求每位参与者在进入 MRI 扫描仪室之前移走金属物体。
2. 指导参与者躺在床上，确保眼眶道口线垂直于床。然后在头部的双侧颞区放置泡沫垫以防止头部移动，并提供耳塞以降低扫描仪的噪音。
3. 指导参与者躺着休息，闭上眼睛不要睡着，扫描过程中不要特别想任何事情。
4. 通过定位灯调整参与者的头部位置。确保轴定位光标平行于外眦，并且矢状定位光标与面部中线重合。接下来，移动床，使轴定位光标保持在参与者眉毛上方或下方 2 厘米处。
5. 通知参与者扫描会话的开始。使用扫描控制台，启动结构定位器扫描，以确定参与者头部在扫描仪中的位置，并允许规划后续的结构和功能扫描。
6. 使用以下序列和参数执行 fMRI。
   1. 使用以下参数进行三维脑容量成像 （3D-BRAVO） MRI:重复时间 （TR）/回声时间 （TE） = 8.5 ms/3.3 ms;厚度 = 1.0 毫米;无交叉口间隙;采集矩阵 = 256 x 256;视场 = 240 x 240 毫米²;翻转角度 = 12°。
   2. 使用梯度回波平面成像血氧水平依赖性 （EPI-BOLD） 成像获得功能图像，参数如下:TR/TE = 2,000 ms/25 ms;厚度 = 3.0 毫米;间隙 = 1.2 毫米;采集矩阵 = 256 x 256;视场 = 240 x 240 毫米²;体素大小 = 3.6 x 3.6 x 3.6 毫米³;和 35 个轴向切片。
7. 在扫描期间密切关注参与者的状况，指导他们尽可能少地移动，如果参与者有任何不适，请停止扫描。
8. 将参与者从扫描仪中取出，并要求参与者在实验结束时小心坐起来。

3. 数据预处理和软件准备

注意:此协议中分析的功能图像由SPM8和基于MATLAB 2013a的脑成像数据处理与分析工具箱（DPABI，http://rfmri.org/dpabi）⁹ 进行预处理。为每个 fMRI 会话单独执行以下预处理步骤。

1. 单击 dpabi 在 MATLAB 终端中打开 DPABI 软件，然后选择 DPARSF 4.3 高级版 并导入文件夹"FunRaw"（图 1）。
   注意:FunRaw 文件夹包含每个参与者的 DICOM 文件。
2. 单击 FunRaw 以一致的编号方案（例如，"sub0001"、"sub0002"等）将 fMRI 扫描文件导入 DPABI。选择工作目录和初始 EPI 和 T1 目录，并继续在步骤 3.3–3.9 中选择所有所需的参数，然后单击第 4 节中的 运行 。
3. 键入参数:Timing points = 240 和 TR = 2 （图 2）。选择 EPI DICOM 到 NIFTI 以将功能图像从 DICOM 转换为 NIFTI 格式，并删除每个功能图像的前 10 个卷。
4. 选中 DPABI 软件中的 Slice Timing 和 Realign 框，以校正剩余的 230 体积的功能性血氧水平相关图像，以进行切片定时效果和头部运动校正。
   注意:对于头部运动，应排除扫描过程中头部移动 >2 mm 或旋转 >2° 的参与者的数据。对于 slice order，向量中的数字序列是这些层的采集时间顺序。所选切片编号为 40，切片顺序为 [1:2:39,2:2,40]，参考切片为 39。
5. 选择 Normalize by DARTEL with the DPABI 软件。
   注意:通过选择此选项，软件将使用注册到平均 fMRI 数据的单个 T1 加权结构图像自动执行空间归一化。使用 DARTEL 工具箱对生成的对齐 T1 加权图像进行分割，以提高 fMRI 数据归一化过程中的空间精度。标准化数据（在蒙特利尔神经学研究所 [MNI] 152 空间中）以 3 x 3 x 3 mm³ 的分辨率重新切片。
6. 通过在 DPABI 软件中选择 Detrend 来删除线性趋势。
7. 选中 Nuisance Covariates Regression 复选框，然后选择以下参数:头部运动模型、白质信号、全局平均信号和脑脊液信号。
8. 选中 Scrubbing 框以删除 DPABI 软件中由于头部运动而导致的错误时间点。
9. 通过选中 DPABI 软件中的 滤波器 [0.01-0.08] 框，将信号保持在 0.01–0.08 Hz 之间，以消除高频生理噪声和低频漂移。
   注意:数据准备完成后，可以进行 ReHo 和 FC 分析。

4. ReHo 和 FC 分析

1. 对于 ReHo 计算，通过 MATLAB 打开 DAPABI 软件并在集群中选择 27 个体素 。左键单击 ReHo 并 平滑 [6*6*6]，然后选择 Run。
   注意:通过计算 27 个体素及其最近邻的时间序列的 Kendall 一致性系数，将 Kendall 一致性系数分配给给定的体素。为了减少个体变化对组间统计比较的影响，使用 Fisher 的 r-to-z 变换对每个体素的 ReHo 映射进行 z 变换。其余的 z ReHo 映射使用 6*6*6 半峰全宽的高斯核进行空间平滑。
2. 对于 FC 计算，通过 MATLAB 打开 DAPABI 软件，并将两组之间改变的 ReHo 脑区域定义为感兴趣区域 （ROI）。单击 功能连接 并定义 ROI（以 x = 0、y = -69 和 z = -3 为中心，半径 = 10 mm），然后选择 运行。
   注意:在球形种子区域和全脑体素之间对每个参与者的时间过程进行相关性分析。所有 FC 地图都通过 Fisher 的 r 到 z 变换进行 z 变换，以减少个体变化对组间统计比较的影响。坐标周围的 ROI 半径应为 10 毫米（X = 0，Y = -69，Z = -3）。

5. 统计分析

1. 处理完相关文件数据后，找到名为 ReHo 和 FC 的文件夹。对 zReHo.nii 和 zFC.nii 的文件进行排序，将它们分为四个子文件夹:"RP-group-ReHo"、"HC-group-ReHo"、"RP-group-FC"和"HC-group-FC"。
2. 通过 MATLAB 打开 DPABI 以执行单样本 t 检验。
   1. 左键单击 Statistical Analysis（统计分析），然后单击 单样本 t 检验。将输出结果命名为 "one-sample-t-test-RP" 并设置输出目录。
   2. 左键单击 Add Group Images 并打开"RP-group-ReHo"子文件夹。
   3. 在 Mask File 选项中，左键单击以打开 "mask" 文件夹中的 "BrainMask-05-61*73*61" 子文件。
   4. 选择 Compute 以运行程序。对 "one-sample-t-test-HC" 组执行相同的过程。
      注:单样本 t 检验用于在 DPABI 软件中分析和显示每组的平均 ReHo 图。
3. 通过 MATLAB 打开 DPABI 以执行双样本 t 检验。
   1. 左键单击 Statistical Analysis（统计分析），然后选择 双样本 t 检验。将输出结果命名为 "two-sample-t-test-ReHo" 并设置输出目录。
   2. 左键单击 Add Group Images 并打开"RP-group-ReHo"和"HC-group-ReHo"子文件夹。
   3. 在 Mask File 选项中，左键单击以打开 "mask" 文件夹中的 "BrainMask-05-61*73*61" 子文件。
   4. 选择 Compute 以运行程序。对 "two-sample-t-test-FC" 执行相同的过程。单击统计分析和高斯随机场 （GRF） 校正 [双尾、体素级别 （0.01） 和体素级别 （0.05）]，然后单击运行。
      注:zReHo 映射组和 zFC 映射组之间的差异通过两个样本 t 检验进行比较。GRF 用于校正 DPABI 软件的多重比较和年龄和性别的回归协变量。
4. 使用 BrainNet Viewer 软件 （https://www.nitrc.org/projects/bnv/） 显示结果。
   1. 通过 MATLAB 打开 BrainNet，然后单击 Load file（加载文件）。对于曲面文件，单击 Browse 并选择 BrainMesh-ICBM152-smoothed.nv，然后单击 Ok;对于卷文件，请选择 spm-T.nii （包括 ReHo 和 FC 结果），然后单击 Ok。
5. 使用统计软件处理从上一步获得的数据。
   注:卡方检验用于性别比较，而独立样本 t 检验用于其他临床变量。连续变量由均值和标准差表示。
6. 使用统计软件进行 Pearson 相关系数分析，以确定不同脑区的 zReHo 值与 zFC 值和视觉测量数据之间的关系。
   1. 通过 DPABI 软件获取每个参与者的 zReHo 值和 zFC 值的 ROI 信号。单击 ROI signals extractor 和 Add directory with ROI mask.nii file。
      注:<0.05 的 P 值应被视为具有统计学意义。

Results

在我们的研究中，16 名 RP 个体和 14 名健康对照者在年龄、性别和教育程度上非常匹配，接受了静息态 fMRI 扫描。使用 ReHo 和 FC 方法探索 RP 个体的同步内和同步神经元活动。在右眼 （P < 0.001） 和左眼 （P < 0.001） 之间观察到 BCVA 的显著差异，但两组之间性别、年龄或体重的差异不显著。

RP 和 HCs 在 ReHo 映射中显示出相似的空间分布。然而，RP 患者视野区域的 ReHo 值显着低于对照组（图 3A，B）。与 HC 相比，与 HC 相比，双侧 LGG/CPL （BA 17,18） 中 RP 个体的 ReHo 值显着降低 （图 4 和表 1） （双尾，体素水平 P < 0.01，GRF 校正，簇水平 P < 0.05）。

与 HCs 组相比，RP 组显示双侧 LGG...

Discussion

本报告介绍了一种用于计算 RP 和 HC 组的 ReHo 和 FC 值的协议，并显示了两组之间的 ReHo 和 FC 值明显不同。值得注意的是，此过程的一个重要步骤是在实验前对样品进行分类和筛选。当我们将该方案应用于我们自己的分析时，所有 RP 受试者均由两位经验丰富的眼科医生诊断。我们排除了患有其他眼病（如青光眼、白内障和视神经萎缩）的 RP 患者。此外，参加本研究的 HCs 没有心脏病、脑病或高血压。结果表明，RP 参与者视觉皮层和视觉皮层与运动皮层之间的 FC 的 ReHo 值显著降低，视觉皮层与丘脑之间的 FC 增加。Qin 等人证明，RP 患者在 V1 中表现出 FC 密度降低，这与我们的发现一致。¹⁰ 这些发现可能表明视网膜丘脑皮层通路和背侧视觉流的内在视觉网络的断开和重组，表明视觉空间和立体视觉障碍。

该协议中的另一个重要问题是统计分析。当使用 DPABI 软件进行双样本 t 检验以比较 ReHo 和 FC 指数时，在统计分析过程中去除了干扰协变量（年龄...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BrainNet Viewer 软件	北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室	BrainNet Viwer 2013	BrainNet Viewer 是一种脑网络可视化工具，用于可视化结构和功能连接模式
DPABI 软件	中国科学院心理研究所，中国北京	DPABI 4.3	DPABI 是一个用于脑成像数据处理和分析的工具箱。
MATLAB	MathWorks，美国马萨诸塞州内蒂克市	2013aMATLAB	是一种高级技术计算语言和交互式环境，用于算法开发、数据可视化、数据分析和数值计算。
MRI 扫描仪	GE Healthcare，密尔沃基	MRI 3.0
SPM 软件	Wellcome 人类神经影像中心，UCL	SPM8	SPM8 是 SPM 软件的重大更新，包含对以前版本的大量理论、算法、结构和界面增强。
SPSS	IBM，美国伊利诺伊州芝加哥	SPSS 20.0 版	SPSS 软件平台提供高级统计分析、文本分析、开源可扩展性、与大数据的集成以及无缝部署到应用程序中。