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方法文章

静息态fMRI中视觉皮层区域同质性与功能连接性的映射

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DOI：

10.3791/60305

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2021年8月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种分析功能性磁共振成像数据的方案，通过结合局部一致性与功能连接性方法，研究视网膜色素变性患者自发性神经活动的改变。

摘要

本研究采用一种联合的区域同质性（ReHo）和功能连接（FC）方法，该方法属于一种无创的功能性磁共振成像（fMRI）技术，用于评估视网膜色素变性（RP）患者神经元同步活动的变化。本研究的目的是描述我们用于分析RP患者脑内及脑区间神经元活动同步性变化的方法。联合ReHo与FC方法的优势在于其无创性，并且具有足够的敏感性，可用于体内检测大脑神经元同步活动的变化。在此研究中，16名RP患者与14名在年龄、性别和教育程度上密切匹配的健康对照者接受了静息态fMRI扫描。采用双样本t检验对两组间的ReHo和FC进行比较。结果显示，RP患者出现了视觉网络的失连接，以及视网膜-丘脑-皮层通路和背侧视觉通路的重组现象。本文将逐步详细描述该方法的具体操作流程、应用方式及其关键参数的影响。

引言

功能磁共振成像（fMRI）是一种可用于在活体中研究脑功能和结构变化的非侵入性方法。区域同质性（ReHo）和功能连接（FC）常用于评估脑活动的区域内和区域间同步。ReHo 是一种静息态 fMRI 方法，用于计算给定体素的时间序列与其邻近体素时间序列的相似性，反映脑活动的局部同步程度1。FC 则用于研究空间上相距较远的脑区时间序列之间的相似性2。

功能性磁共振成像（fMRI）技术可在眼科疾病管理中对视觉功能提供客观评估。本文介绍了一种结合局部一致性（ReHo）和功能连接（FC）方法的方法学方案，旨在分享相关经验并促进本领域专业知识的传播。在本研究中，我们对视网膜色素变性（RP）患者和健康对照者（HCs）应用了ReHo与FC分析流程，以详细阐述该操作过程。RP是一种严重的遗传性眼病，其特征为夜盲以及进行性视力丧失3,4。基因突变是RP的主要危险因素。视杆细胞和视锥细胞的死亡导致RP患者周边视野逐渐丧失，最终致盲。既往神经影像学研究已发现，RP患者在视觉皮层及视觉通路中存在结构与功能异常5,6,7。此外，弥散张量成像被用于评估白质纤维束的完整性。与健康对照者相比，RP患者视神经中的表观扩散系数、主特征值和正交特征值显著升高，而分数各向异性显著降低8。

本研究旨在探讨神经元活动的区域内及区域间同步性。我们分析了视网膜色素变性（RP）患者脑区的平均局部一致性（ReHo）值和平均功能连接（FC）值是否与临床变量相关。本方法可能有助于研究人员深入理解RP患者周边视力丧失的神经机制。

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方案

本研究方案经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 受试者分类与筛选

  1. 招募年龄、性别和教育程度相近的视网膜色素变性（RP）受试者和健康对照者（HCs）。
  2. 确保所有参与者均符合以下标准：1）能够接受磁共振成像（MRI）扫描（例如，无心脏起搏器或植入式金属装置）；2）无幽闭恐惧症；3）无心脏病、高血压或脑部疾病。

2. fMRI 数据的采集

注意：本方案使用配备八通道头部线圈的 3 T MRI 扫描仪。

  1. 在最终安全检查后，要求每位参与者在进入 MRI 扫描室前取下金属物品。
  2. 指导参与者仰卧于检查床上，并确保眶耳线与床面垂直。然后在头部双侧颞区放置泡沫垫以防止头部移动，并提供耳塞以降低扫描仪噪声。
  3. 指导参与者在扫描期间保持静息状态，闭眼但不要入睡，且不要刻意思考任何特定内容。
  4. 通过定位光调整参与者的头部位置。确保轴向定位光标与外眦平行，矢状面定位光标与面部中线重合。随后移动检查床，使轴向定位光标位于参与者眉弓上方或下方约 2 cm 处。
  5. 告知参与者扫描即将开始。通过扫描控制台启动结构定位扫描，以确定参与者头部在扫描仪中的位置，并为后续的结构和功能扫描规划提供依据。
  6. 采用以下序列和参数进行 fMRI 扫描。
    1. 采用以下参数进行三维脑容积成像（3D-BRAVO）MRI：重复时间（TR）/回波时间（TE）= 8.5 ms/3.3 ms；层厚 = 1.0 mm；无层间间隙；采集矩阵 = 256 x 256；视野 = 240 x 240 mm2；翻转角 = 12°。
    2. 采用梯度回波平面成像血氧水平依赖（EPI-BOLD）技术获取功能图像，参数如下：TR/TE = 2,000 ms/25 ms；层厚 = 3.0 mm；层间距 = 1.2 mm；采集矩阵 = 256 x 256；视野 = 240 x 240 mm2；体素大小 = 3.6 x 3.6 x 3.6 mm3；采集 35 层轴向切片。
  7. 在扫描过程中持续关注参与者的状态，指导其尽量减少移动，若参与者出现任何不适，应立即停止扫描。
  8. 扫描结束后将参与者移出扫描仪，并嘱其在实验结束时小心坐起。

3. 数据预处理与软件准备

注意：本方案中分析的功能像由 SPM8 及数据处理工具箱进行预处理 & 脑成像分析（DPABI，http://rfmri.org/dpabi）9 基于 MATLAB 2013a。对每次 fMRI 扫描会话分别执行以下预处理步骤。

  1. 在 MATLAB 终端中点击 dpabi 打开 DPABI 软件，然后选择 DPARSF 4.3 Advanced Edition，并导入文件夹 "FunRaw"（图 1）。
    注意：FunRaw 文件夹包含每位受试者的 DICOM 文件。
  2. 点击 FunRaw，以一致的编号方案（例如 "sub0001"、"sub0002" 等）将 fMRI 扫描文件导入 DPABI。选择工作目录以及初始的 EPI 和 T1 目录，并在第 4 步点击 Run 之前，继续完成步骤 3.3–3.9 中所有所需参数的选择。
  3. 输入参数：时间点数 = 240，TR = 2（图 2）。选择 EPI DICOM to NIFTI，将功能图像从 DICOM 格式转换为 NIFTI 格式，并去除每个功能图像的前 10 个体积。
  4. 在 DPABI 软件中勾选 Slice Timing 和 Realign，以校正剩余 230 个体积的功能性血氧水平依赖图像的切片时间效应和头动。
    注意：对于头动，扫描过程中头动位移超过 >2 mm 或旋转角度超过 >2° 的受试者数据应予以剔除。对于切片顺序，向量中的数字序列表示各层的采集时间顺序。所选切片数为 40，切片顺序为 [1:2:39,2:2,40]，参考切片为第 39 层。
  5. 在 DPABI 软件中选择 Normalize by DARTEL。
    注意：选择此选项后，软件将使用个体 T1 加权结构像与平均 fMRI 数据配准后，自动进行空间标准化。配准后的 T1 加权图像将使用 DARTEL 工具箱进行分割，以提高 fMRI 数据标准化的空间精度。标准化后的数据（位于蒙特利尔神经学研究所 [MNI] 152 空间）将重采样至 3 x 3 x 3 mm3 的分辨率。
  6. 在 DPABI 软件中选择 Detrend，以去除线性趋势。
  7. 勾选 Nuisance Covariates Regression，并选择以下参数：头动模型、白质信号、全局平均信号和脑脊液信号。
  8. 在 DPABI 软件中勾选 Scrubbing，以去除因头动导致的异常时间点。
  9. 在 DPABI 软件中勾选 Filter [0.01-0.08]，保留 0.01–0.08 Hz 范围内的信号，以去除高频生理噪声和低频漂移。
    注意：完成数据预处理后，可进行 ReHo 和 FC 分析。

4. ReHo 和 FC 分析

  1. 进行 ReHo 计算时，通过 MATLAB 打开 DAPABI 软件，并在簇中选择 27 个体素。左键点击 ReHo 和 smooth [6*6*6]，然后选择 Run。
    注意：通过计算某一体素及其周围最近邻共 27 个体素的时间序列的肯德尔和谐系数（Kendall's coefficient of concordance），为该体素赋予相应的 ReHo 值。为了减少个体差异对组间统计比较的影响，采用 Fisher 的 r-to-z 转换方法对每个体素的 ReHo 图进行 z 变换。剩余的 z ReHo 图随后使用半高全宽为 6×6×6 的高斯核进行空间平滑处理。
  2. 进行 FC 计算时，通过 MATLAB 打开 DAPABI 软件，并将两组间 ReHo 发生改变的脑区定义为感兴趣区域（ROIs）。点击 Functional Connectivity，定义 ROI（中心坐标为 x = 0, y = -69, z = -3，半径 = 10 mm），然后选择 Run。
    注意：对每位受试者，执行球形种子区域与全脑各体素之间时间序列的相关性分析。所有功能连接（FC）图均通过 Fisher 的 r-to-z 转换进行 z 变换，以减少个体差异对组间统计比较的影响。围绕坐标点的 ROI 半径应设置为 10 mm（X = 0, Y = -69, Z = -3）。

5. 统计分析

  1. 处理相关文件数据后，找到名为 ReHo 和 FC 的文件夹。对 zReHo.nii 和 zFC.nii 文件进行分类整理，并将其分别归入四个子文件夹："RP-group-ReHo"、"HC-group-ReHo"、"RP-group-FC" 和 "HC-group-FC"。
  2. 通过 MATLAB 打开 DPABI 软件以执行单样本 t 检验。
    1. 左键点击 Statistical Analysis，然后点击 one-Sample t-test。将输出结果命名为 "one-sample-t-test-RP"，并设置输出目录。
    2. 左键点击 Add Group Images，打开 "RP-group-ReHo" 子文件夹。
    3. 在 Mask File 选项中，左键点击以打开 "mask" 文件夹中的 "BrainMask-05-61*73*61" 子文件。
    4. 选择 Compute 以运行程序。对 "one-sample-t-test-HC" 组重复相同操作。
      注：单样本 t 检验用于在 DPABI 软件中分析并显示各组的平均 ReHo 图谱。
  3. 通过 MATLAB 打开 DPABI 软件以执行双样本 t 检验。
    1. 左键点击 Statistical Analysis，然后选择 two-sample t-test。将输出结果命名为 "two-sample-t-test-ReHo"，并设置输出目录。
    2. 左键点击 Add Group Images，打开 "RP-group-ReHo" 和 "HC-group-ReHo" 两个子文件夹。
    3. 在 Mask File 选项中，左键点击以打开 "mask" 文件夹中的 "BrainMask-05-61*73*61" 子文件。
    4. 选择 Compute 以运行程序。对 "two-sample-t-test-FC" 重复相同操作。点击 Statistical Analysis 和 Gaussian random field (GRF) correction [two-tailed, voxel-level (0.01) and voxel-level (0.05)]，然后点击 Run。
      注：通过双样本 t 检验比较各组 zReHo 图谱和 zFC 图谱之间的差异。使用 GRF 方法在 DPABI 软件中对年龄和性别等协变量进行多重比较校正。
  4. 使用 BrainNet Viewer 软件（https://www.nitrc.org/projects/bnv/）展示结果。
    1. 通过 MATLAB 打开 BrainNet，点击 Load file。对于表面文件，点击 Browse 并选择 BrainMesh-ICBM152-smoothed.nv，然后点击 Ok；对于体数据文件，选择 spm-T.nii（包含 ReHo 和 FC 的结果），然后点击 Ok。
  5. 使用统计软件处理上一步骤获得的数据。
    注：性别比较采用卡方检验，其他临床变量采用独立样本 t 检验。连续变量以均值和标准差表示。
  6. 使用统计软件进行 Pearson 相关性分析，以确定不同脑区的 zReHo 值和 zFC 值与视觉测量数据之间的关系。
    1. 通过 DPABI 软件获取每位受试者的 zReHo 和 zFC 值的 ROI 信号。点击 ROI signals extractor，然后点击 Add directory with ROI mask.nii file。
      注：P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

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结果

在本研究中，16名视网膜色素变性（RP）患者和14名在年龄、性别和教育程度上密切匹配的健康对照者接受了静息态功能性磁共振成像（fMRI）扫描。采用局部一致性（ReHo）和功能连接（FC）方法，探讨RP患者的脑内及脑间神经元同步活动。RP患者组的右眼（P < 0.001）和左眼（P < 0.001）最佳矫正视力（BCVA）均存在显著差异，但两组间在性别、年龄或体重方面的差异无统计学意义。

RP患者与健康对照组（HCs）在ReHo图上的空间分布相似。然而，RP患者的视觉区域ReHo值显著低于对照组（图3A、B）。与HCs相比，RP个体在双侧LGG/CPL（BA 17、18）区域的ReHo值显著降低（图4 和 表1）（双尾检验，体素水平P < 0.01，GRF校正，簇水平P < 0.05）。

与健康对照组相比，视网膜色素变性...

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讨论

本报告描述了一种用于计算视网膜色素变性（RP）组与健康对照（HC）组局部一致性（ReHo）和功能连接（FC）值的实验方案，并显示两组之间的ReHo和FC值存在显著差异。值得注意的是，该流程中一个关键步骤是在实验前对样本进行分类和筛选。在我们应用该方案进行自身分析时，所有RP受试者均由两名经验丰富的眼科医生确诊。我们排除了合并其他眼部疾病（如青光眼、白内障和视神经萎缩）的RP患者。此外，纳入研究的HC个体均无心脏病、脑部疾病或高血压病史。结果显示，RP受试者的视觉皮层局部一致性（ReHo）值降低，视觉皮层与运动皮层之间的功能连接（FC）显著减弱，而视觉皮层与丘脑之间的功能连接则增强。Qin等人证明，RP患者V1区的功能连接密度降低，这与我们的研究结果一致。10 这些发现可能提示视网膜-丘脑-皮层通路及背侧视觉通路中的固有视觉网络出现断连与重组，提示存在视空间功能及立体视觉的损害。

本方案中的另一个重要问题是统计分析。当使用DPABI软件通过双样本t检验比较ReHo和FC指标时，统计分析过程中已去除混杂协变量（年龄、性别和头动参数）的影响...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（NSFC，编号：81470628，81800872）和国家重点研发计划资助&中国国家重点研发计划（编号：2017YFE0103400）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BrainNet Viewer 软件北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室BrainNet Viwer 2013BrainNet Viewer 是一种用于可视化脑结构和功能连接模式的脑网络可视化工具
DPABI 软件中国科学院心理研究所，中国北京DPABI 4.3DPABI 是用于脑成像数据处理与分析的工具箱
MATLABMathWorks, Natick, MA, 美国2013aMATLAB 是一种高级技术计算语言和交互式环境，用于算法开发、数据可视化、数据分析以及数值计算
MRI 扫描仪GE Healthcare, MilwaukeeMRI 3.0
SPM 软件伦敦大学学院惠康神经影像中心SPM8SPM8 是 SPM 软件的一次重大更新，在理论、算法、结构和界面方面相较于早期版本均有显著提升
SPSSIBM, Chicago, IL, 美国SPSS 版本 20.0SPSS 软件平台提供高级统计分析、文本分析、开源可扩展性、与大数据的集成，以及向应用程序的无缝部署

参考文献

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视网膜色素变性视网膜-丘脑-皮层通路背侧视觉通路非侵入性功能磁共振成像同步神经元活动双样本t检验

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