用于科研与教学应用的定制微流控器件的快速制备

摘要

本文介绍了一种以最少的资金和时间投入设计和制备定制化微流控装置的实验方案。其目的是促进微流控技术在生物医学研究实验室及教育环境中的应用。

摘要

微流控装置能够在纳米至亚毫米尺度的通道中操控流体、颗粒、细胞、微尺度器官或生物体。该技术在生命科学领域的应用迅速增长，促使人们需要一种可供广泛研究团队便捷使用的方法。目前的制备标准（如PDMS键合）依赖昂贵且耗时的光刻和键合技术。一种可行的替代方案是采用价格低廉、易于获取的设备和材料，操作简便，并可快速迭代设计。本文介绍了一种设计和制备聚对苯二甲酸乙二醇酯层压板（PETLs）的方案，这类微流控装置成本低、易于制造，且制备时间显著少于其他微流控技术方法。PETLs由热键合的薄膜片组成，其通道和其他结构特征通过手工切割仪进行定义。PETLs在解决特定领域技术难题的同时，极大降低了技术应用的障碍。该方法提升了微流控装置在科研与教育环境中的可及性，为新型研究方法提供了可靠的平台。

引言

微流控技术能够在微小尺度上实现对流体的控制，其体积范围从微升（1 × 10^-6 L）到皮升（1 × 10^-12 L）。这种控制能力在一定程度上得益于从微处理器行业借鉴而来的微加工技术¹。利用微米级的通道和腔室网络，用户可以充分利用小尺度下特有的物理现象。例如，在微米尺度下，流体可通过层流进行操控，此时黏性力占主导地位，超过惯性力。因此，扩散传输成为微流控系统中的显著特征，并可对其进行定量和实验研究。这些系统可通过菲克定律、布朗运动理论、热传导方程和/或纳维-斯托克斯方程得到合理解释，这些方程是流体力学和传质现象领域中的重要推导成果²。

由于生物科学领域的许多研究团队都在微观尺度上研究复杂系统，人们最初认为微流控装置将对生物学研究应用产生直接而显著的影响^2,3。这是因为小分子跨膜或在细胞内传输时，扩散起主导作用，而细胞和微生物的尺寸与亚毫米级系统和装置非常匹配。因此，微流控技术在改进细胞和分子实验操作方式方面具有巨大潜力。然而，生物学家对微流控技术的广泛应用仍落后于预期⁴。技术转化不足的一个简单原因可能是工程师与生物学家之间的学科壁垒。定制化装置的设计与制备始终超出大多数生物研究团队的能力范围，使其不得不依赖外部的专业知识和设施。此外，对潜在应用缺乏了解、成本高昂以及设计迭代所需的时间，也是新用户采用该技术的重要障碍。这些障碍很可能已经阻碍了创新，并限制了微流控技术在应对生物科学挑战中的广泛应用。

一个典型的例子：自20世纪90年代末以来，软光刻技术一直是制造微流控器件的首选方法。聚二甲基硅氧烷（PDMS，一种基于硅酮的有机聚合物）因其物理特性（如透明性、可变形性和生物相容性）而被广泛使用⁵。该技术取得了巨大成功，基于此平台的“芯片实验室”和“器官芯片”器件不断被开发出来⁶。然而，从事这些技术研究的大多数研究团队都位于工程类院系，或与之有密切联系⁴。光刻技术通常需要在洁净室中制作模具，并使用专用的键合设备。对于许多研究团队而言，标准PDMS器件由于其高昂的资本投入和较长的制备周期，尤其是在需要反复修改设计的情况下，显得并不理想。此外，对于缺乏专业工程实验室资源的普通生物学家和学生而言，该技术也基本难以触及。有观点认为，若要使微流控器件得到广泛应用，就必须使其具备生物学家常用材料的一些特性。例如，用于细胞培养和生物分析的聚苯乙烯材料成本低廉、可一次性使用，并适合大规模生产。相比之下，由于PDMS材料本身的机械柔软性、表面处理不稳定以及透气性等问题，基于PDMS的微流控器件始终未能实现工业化量产⁵。鉴于这些局限性，并为了通过自行设计和“在实验室内部”构建定制化装置来解决技术难题，我们介绍一种替代方法，该方法利用xurography^7,8,9技术与热压合工艺。该方法所需的资金和时间投入极少，易于推广采用。

PETL 采用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜制造，并涂覆有热敏粘合剂乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）。这两种材料广泛用于消费品，具有生物相容性，且成本极低¹⁰。PET/EVA 薄膜可购得覆膜袋或卷材形式。使用在业余爱好者或手工商店常见的计算机控制裁切机，可在单层薄膜上切割出通道，以定义装置的结构¹¹。随后通过叠加额外的薄膜（或玻璃）层，并使用办公用热压覆膜机进行热压密封，从而封闭通道（图 1A）。添加带穿孔的自粘式乙烯基缓冲垫，以方便通道的接入。制造时间在 5 至 15 分钟之间，支持快速的设计迭代。制造 PETL 所需的所有设备和材料均可在市场上轻松获得且价格低廉（起始成本<350 美元，相比之下光刻设备需数千美元）。因此，PETL 为传统微流控技术面临的两个主要问题——成本高昂和耗时过长——提供了创新的解决方案（参见补充表 1、2中的 PDMS/PETL 对比）。

除了为研究人员提供设计和制造自身设备的机会外，PETL 还因其操作简单、直观而易于在课堂教学中采用。PETL 可纳入高中和大学课程⁸，用于帮助学生更好地理解扩散、层流、微混合、纳米颗粒合成、浓度梯度形成和趋化性等物理、化学及生物学概念。

在本研究中，我们展示了制备具有不同复杂程度的模型PETL芯片的整体工作流程。第一种装置用于在小型腔室中对细胞和微器官进行成像。第二种更为复杂的装置由多层材料构成，用于力学生物学研究⁹。最后，我们构建了一种用于教学目的的装置，用以展示多种流体动力学概念（包括流体聚焦、层流、扩散输运和微混合）。本文所介绍的工作流程和装置设计可轻松针对科研和课堂教学中的多种应用进行调整。

方案

1. 设计

1. 确定设备的应用场景，并列出所需的通道/腔室组件。
   注意：所有设备都需要输入和输出通道。用于显微成像的设备需要成像腔室。更复杂的设备需要在多个层中设置通道和腔室。
2. 首先手绘每一层，考虑各层叠加后对设备功能的影响。
3. 使用任何可绘制线条和形状的软件在计算机上绘制最终设计。
   1. 使用黑色实线和无阴影的形状分别绘制每一层。建议线宽为6点或以上。此阶段通道和腔室特征的尺寸不如整体比例重要。
   2. 在创建特征和叠加层时使用复制粘贴功能。参见 图1B 中的层结构绘图示例。
4. 将每一层导入裁切软件（图1C）。可通过截取设计图并采用拖放方式完成。
   1. 在裁切软件中创建新文档（可免费下载）。将图像文件拖放到显示的裁切垫上。该软件可识别大多数图像文件。
   2. 通过从角落拉伸来放大图像，以便于处理。此时可使用“描边”功能使软件识别设计。
      注意：用户也可直接在该软件中从头设计（使用设计面板中的绘图工具）。
5. 为描边设计，请选择窗口右侧的 描边 图标（蝴蝶形状），并完全选中已导入的设计。
   1. 选择标记为 轮廓 的 描边预览 选项。根据需要调整 阈值 和 比例 设置，使黄色描边与设计匹配。
   2. 当黄色描边与设计一致后，从 描边 菜单中选择 描边。此时通道将显示为红色轮廓。若红色轮廓与设计相符，可选中并删除导入的图像。设计现已导入，准备进行尺寸调整。
6. 通过选中已描边的设计，并利用软件提供的网格来调整设备尺寸。通过拉伸改变通道和腔室的宽度和长度。
   注意：软件提供测量功能，可临时绘制细线（使用窗口左侧的 设计面板）以测量设备内部尺寸。功能性通道宽度范围为 100 µm 至 900 µm。在测试初始原型后可能需要调整尺寸。所有层必须按相同比例缩放，以确保组装时正确对齐。
   1. 设计尺寸调整完成后，选择形状绘图菜单中的矩形工具，在设备每一层周围绘制一个方形/矩形。所有层的该形状应大小相同。示例见 图1C。
7. 创建一个独立的顶层，包含通向通道的接入孔。简单设计通常包括一个主通道层（中间层）、一个底部密封层（常为玻璃）以及一个顶层，顶层应包含用于接入通道的圆形穿孔（入口/出口）。
   注意：包含三层以上的设计需要在多个层中设置入口/出口穿孔（见 图1C 和 图5A）。这些穿孔可能已在设计中包含，也可在此阶段添加。
   1. 选择屏幕左侧的 绘图工具，在设计的入口和出口端口上方绘制圆形。
   2. 复制并粘贴原始设计和圆形。擦除底层设备中的通道。
      注意：这将使入口/出口端口保留在与原始设计相对应的正确位置。也可在每层边缘添加形状以辅助对齐。
8. 将所有待切割的层排列在显示的裁切垫上。设备现在已准备好进行切割。

2. 切割

1. 将一片所需厚度的 PET/EVA 薄膜（或其他材料）（3 mil 为标准厚度）贴附到粘性切割垫上。确保粘性面（哑光面）朝上，塑料面（光亮面）朝下。
   注意：使用洁净手套，以避免将油脂和微粒带入各层中。
2. 将薄膜压平贴合于垫子上（图 1D），排除可能夹入的所有空气。可使用戴着手套的手或压辊完成此操作。
3. 将切割垫的边缘对准切割机上标示的刻线。在切割机上按下加载垫子以装入垫子。根据薄膜厚度，将切割刀片的设置保持在 3 至 5 之间。
4. 将切割机的 USB 线缆连接至计算机。
   1. 选择发送选项卡，并选择一个切割设置。
      注意：级联菜单中提供多种设置。“-贴纸纸张，透明-”这一设置适用于厚度为 3–5 mil（75–125 μm）的 PET/EVA 薄膜。针对不同材料调整设置，并保存自定义设置以供将来使用。
5. 点击发送，开始切割（图 1E）。确保切割机后方有足够的空间，使垫子能够无障碍移动。切割完成后，在切割机上选择卸载以取出垫子。切勿在未执行卸载操作前直接拉出垫子。

3. 序列比对

1. 将切割垫放置在干净的台面旁边。戴着手套，使用镊子将微流控装置的每一层从切割垫上小心取下（图1F）。在通道的弯道和弯曲处需格外小心；这些区域特别脆弱，容易撕裂或变形。
2. 将微流控装置的各层放置在干净的台面上，并按照其在装置中从上到下的顺序排列（图1G、图2A、图5A 和 图7A）。
3. 裁剪若干小块双面胶（约 3 mm × 10 mm），用于临时固定各层。
4. 从底层开始，逐层叠加各层。在两层之间的角落处贴上一小块双面胶，位置应远离任何通道或进出口（图1G，箭头所示）。尽管使用双面胶并非必需，但它可固定各层，防止在热压过程中发生移位。对于层数超过4层的装置，可使用金属丝定位夹具辅助对齐（补充图3）。
5. 确保薄膜的粘合层（哑光-EVA）始终朝向装置内部（即层间部分）。
   警告：若粘合层暴露在外，会在热压过程中熔化并粘附于热压机内部部件，不仅会导致装置报废，还会影响热压机后续的正常运行。
6. 当所有层叠加完成后，检查装置。每两层之间应至少有一层EVA，且不应有任何EVA暴露在外。当引入非EVA涂层材料（如聚氯乙烯（PVC）薄膜、玻璃）时，可能需要使用双面均涂覆EVA的薄膜，尤其是在结构较复杂的装置中（图5）。

4. 层压

1. 打开覆膜机，并将其设置为所需的厚度档位。部分覆膜机提供3密耳和5密耳两种设置，而有些则不具备。对于包含4层或更多层的任何装置，应使用5密耳档位。
2. 当覆膜机准备就绪后，将装置送入覆膜辊中（图1H–I）。为获得最佳效果，请将已粘贴双面胶的一端先行送入。
   注意：在制作五层或更多层的装置时，可将其多次通过覆膜机。
3. 取出覆膜完成的装置。
   注意：建议装置尺寸应足够大，以便于从覆膜机中顺利取出。此考虑不影响通道或芯片结构的实际尺寸，仅要求设计一个可轻松通过覆膜机而不会卡住的“边框”。

5. 进样口/出样口

1. 使用旋转工具和1/32英寸钻头在家具缓冲垫中心钻一个小孔。或者，使用1 mm活检打孔器对缓冲垫进行穿孔。
   注意：建议使用台式钻床。尽管尺寸各异，推荐使用2 mm × 6 mm直径的缓冲垫。避免简单地“刺入”缓冲垫。除非去除材料，否则缓冲垫会重新闭合（补充图1）。上述穿孔旨在与聚醚醚酮（PEEK）管、移液器及吸头或钝头针（16–18 G）连接。可使用旋转打孔钳获得更大的穿孔（补充图1）。当缓冲垫用作液体或其他生物材料的“储液池”时，此方法尤为有用。
2. 使用一对小镊子清除钻孔或打孔过程中产生的任何碎屑，确保孔口完全通畅。
3. 在进/出液口成功清理后，将缓冲垫仔细对准层压装置上的进/出液口（图1J–K）。此步骤对于确保液体在装置中正常流入和流出至关重要。将缓冲垫置于装置背面，使粘性面朝向装置上敞开的进/出液口，然后对准并粘附。至此，装置组装已完成。

6. 测试

1. 通过带孔的缓冲器（端口）进入通道/腔室结构。有多种方式可将流体和生物样品引入装置中。
2. 可使用实验室或医用/外科导管，将其连接至塑料接头（例如鲁尔接头）或钝头针。也可直接使用标准移液器吸头或无接头的PEEK管路（补充图2）。
3. 使用注射器和导管，或蠕动泵进行流体的灌注或抽取。
   注：市场上有多种可用选项，撰写本文时起售价约为300美元。
4. 根据装置类型和实验需求设定不同的流速。
   注：我们常规使用的流速范围为0.01–100 µL/min，但也可使用其他流速。

图1：制备过程。（A）制备仅需使用办公覆膜机和手工切割机两种设备，均可在线购买或在工艺/办公用品商店获取。其他所需工具包括剪刀和镊子。（B）通道和腔室结构可通过任何包含绘图工具的软件程序进行数字化设计（部分用户可能偏好矢量图形，但非必需）。线条和形状应以黑色绘制在白色背景上。设计文件或截图可通过拖放方式导入手工切割机软件中。（C）手工切割机软件可免费下载，是控制切割机所必需的。该软件可读取设计文件，并支持尺寸调整等修改操作，同时提供绘图工具。（D）切割垫板用于承载待切割薄膜，其表面具有轻微黏性，可固定待切割材料。图中显示了四种准备装载的不同材料：3 mil厚的PET/EVA薄膜（顶部）、5 mil厚的PET/EVA薄膜（中部）、6 mil厚的EVA/PET/EVA复合膜（左下）以及PVC薄膜（右下）。（E）切割机打开后可看到刀头（黑色）组件及已装载的垫板。（F）切割完成后，使用镊子将各层单独揭起。通道和腔室的切割部分仍附着在垫板上，之后需移除并丢弃。（G）将各层对齐并叠放，准备覆膜。通常使用少量双面胶带（箭头所示）辅助对齐，并防止覆膜过程中层间发生位移。（H, I）将器件从覆膜机顶部送入，从出膜口取出。覆膜可形成牢固密封，同时保持通道路径开放。（J、K）为便于接触通道，需添加带穿孔的自粘式乙烯基缓冲垫。图（J）展示了“反向”对齐方法，即将缓冲垫从背面贴附，以便直观对齐进样口/出样口与缓冲垫上的穿孔位置。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

除了成本低和可快速迭代外，PETL 技术还易于定制，可用于解决特定挑战。首先，我们描述一种简单的装置，该装置由盖玻片、腔室层、通道层和进出口层组成（图2）。该装置旨在促进在持续流动条件下对细胞和微型器官进行成像。通过以低流速补充培养基，促进营养物质和气体交换。圆形腔室具有玻璃底面，可用于倒置显微镜成像。在此装置中使用玻璃有两个主要原因。第一个是光学性能。PET 和 EVA 是热塑性塑料，因其光学透明性和柔韧性而被使用，可作为成像界面（尤其在低倍率下⁹）。PET 在可见光范围内的透光率约为 87% 至 90%¹²。然而，玻璃具有更优的光学特性，是生物成像中的标准材料。第二个原因是，迄今为止测试的细胞（哺乳动物细胞系）在玻璃上的贴附能力通常优于（未经处理的）PET/EVA。

讨论

尽管微流控技术在全球各地实验室的工具箱中正变得日益普遍，但考虑到其潜在的积极影响，该技术的采用速度仍令人失望¹⁶低成本和高效率的微流控器件制备对于推动该技术在普通研究实验室中的广泛应用至关重要。本文所述方法利用多层薄膜，以远低于光刻技术所需的时间和成本，快速制备二维和三维微流控器件。标准光刻技术的启动成本高达数千美元（USD），且器件制备需耗时数天；而PETL（多层薄膜加工）技术的启动成本低于350美元，器件可在数分钟内完成制备。这不仅促进了该技术在科研实验室中的应用，也适用于需要快速迭代的场景（例如，标准PDMS器件的原型开发），或适用于工业化生产低成本、一次性微流控器件的场合。 必要时，例如，PETL 可以使用可生物降解材料制备，并可针对医疗保健领域的应用进行调整，使其成为理想的诊断工具。它们可用于课堂教学，既可作为预制的教学材料，也可作为一种创造性挑战，让学生自行设计、制备和测试其设备。

PETL 的制备旨在简化操作流程。然而，明确该技术的关键步骤和当前局限性仍具有重要意义。部分用户会发现，与 PDMS 装置相比，PE...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活检穿孔器（1 mm）	Miltex	33-31AA	可选，替代旋转工具装置
钝针	Janel, Inc.	JEN JG18-0.5X-90	移除塑料管并连接至Tygon管
盖玻片	任何		24 × 60 mm 为首选
切割垫和刀片	Silhouette America 或 Nicapa	www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats	重复使用/一次性用品
双面胶带	Scotch/3M	667	少量，任何宽度或品牌
PEEK 管	IDEX/any	1581L	可提供多种配置。若尚未使用PEEK管，请考虑改用Tygon管
PET/EVA 热塑性复合薄膜	Scotch/3M &和 Transcendia	TP3854-200，TP5854-100 && transcendia.com/products/trans-kote-pet	3 - 6 密耳（密耳 = 1/1000 英寸）覆膜袋或覆膜卷
PVC薄膜 - 保鲜膜	Glad / Any		食品包装
旋转工具钻	Dremel/任意	200-121 或其他	1/32 和 3/64" 推荐使用 Dremel 钻头
橡胶滚轮	Speedball	4126	为促进粘附，任何品牌的试剂均可使用
剪刀 &和镊子	任何	Fiskars 英寸钛合金软握剪刀 | Cole-Parmer –# UX-07387-12	建议使用优质品牌
Silhouette CAMEO 裁切机	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T	首选手工切割器
Silhouette Studio 软件	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/software	控制工艺切割机并提供绘图工具（可免费下载，适用于 Mac 和 PC）
注射泵	哈佛仪器或新纪元	70-4504 或 NE-300	泵是理想选择，也可使用移液管或滴定管。
注射器	任何		1-3 mL
热压覆膜机	Scotch/3M	TL906	标准家用/办公型设备
Tygon 软管（E-3603）	Cole-Parmer	EW-06407-70	使用钝针头尖端
乙烯基家具防撞垫	德蓝/3M/艾弗比尔特	透明自粘贴片（6 x 2 mm 和 8 x 3 mm）	建议使用圆形保险杠