小鼠骨骼肌肉外泄原发性肌基器的分离和分化

Summary

肌细胞是增殖前体细胞，分化形成多核肌管，并最终骨骼肌肌纤维。在这里，我们提出了一个协议，从年轻的成年小鼠骨骼肌肉有效隔离和培养原发性肌体。该方法支持对培养中的肌肉细胞进行分子、遗传和代谢研究。

Abstract

原发性肌体是骨骼肌的无差别增殖前体。它们可以作为肌肉前体培养和研究，或诱导分化到肌肉发育的后期阶段。此处提供的协议描述了一种强大的方法，用于从年轻的成年小鼠骨骼肌外植体中分离和培养高度增殖的肌细胞群。这些细胞可用于研究不同小鼠模型骨骼肌的代谢特性，以及其他下游应用，如外源DNA转染或病毒表达载体转导。这些细胞的分化水平和代谢特征取决于暴露的长度，以及用于诱导月细胞分化的介质的组成。这些方法为研究小鼠肌肉细胞外体代谢提供了强有力的系统。重要的是，与体内模型不同，本文描述的方法提供了一个细胞群，可以扩展和研究具有高重复性。

Introduction

虽然经常被引证为整体代谢健康的指示，但多项研究表明，老年人的身体质量指数（BMI）与较高的死亡率风险并不一致。迄今为止，唯一与降低这一种群死亡率相一致的因素是增加肌肉^质量1。肌肉组织是体内胰岛素敏感细胞的最大来源之一，因此对维持整体代谢平衡^{至关重要。}通过运动激活骨骼肌组织与增加局部胰岛素敏感性和整体代谢^健康3相关。虽然体内模型对于研究肌肉生理学和肌肉功能对综合代谢的影响至关重要，但肌管的主要培养物提供了一个可处理的系统，可降低动物研究的复杂性。

从产后肌肉衍生的肌末代酶可用于以高度可重复的方式研究多种治疗和生长条件的影响。这早已得到承认，几种方法的月经隔离和文化已经描述了4，5，6，7，8，9。其中一些方法使用新生儿肌肉，产生相对较少的肌^体5，8，

Protocol

该协议遵循斯克里普斯研究的动物护理指南。

1. 肌肉组织外泄的收集和处理

1. 解剖前一天，对所有解剖设备（钳子、剃须刀和剪刀）进行消毒，并准备所有必需的介质:磷酸盐缓冲盐水（PBS）、甲基溴电镀介质（DMEM 12.5 mL、HAMS F12 12 12.12 mL、20 mL 热灭活胎牛血清 （FBS）， 5 mL 羊水介质补充剂） 和涂层溶液 （24 mL DMEM， 24 mL HAMS F12， 1.7 mL 胶原蛋白， 1 mL 母体凝胶）.
2. 解剖当天，为要解剖的每个肌肉涂上一个6厘米的碟子。"在每个板的表面加入2 mL的涂层溶液，轻轻摇动，在表面形成均匀的涂层，并在4°C下用溶液孵育板1小时。
3. 从板中取出涂层溶液，然后返回库存解决方案。
   注:涂层溶液可重复使用长达六个月，应储存在4°C。
4. 用2 mL的PBS冲洗板两次，以去除未结合的胶原蛋白和母蛋白。
5. 在解剖过程中，将板放在37°C组织培养箱中。
6. 将 2-3 张厚吸水纸放入塑料袋或无菌 15 厘米的盘子中，并使用移液器用无菌水将纸张表面弄湿，从而准备湿室。
7. 将腔室置于紫外线下 5 分钟进行消毒。
8. 从4到8周大的老鼠中切除所需的肌肉。要对肌肉组织进行消毒，在含有40μg/mL的温霉菌的PBS中轻轻冲洗。
   

Results

按照所提供的协议第 1 节，应产生从植物外部产生的原细胞，这些细胞将在标准光显微镜下可见（图 2）。异质细胞群将生长在除外每个肌肉组织外部和周围。微球体将显示为小，圆，明亮的球体。根据协议第2节，将产生从组织外植的细胞细胞的早期收获，这将包含很少的细胞，并且将是异质的（图3）。该协议第3节描述了用PBS（而不是胰蛋白酶）进行传早收获，这将提供相对纯净的肌布组，以便进一步培养。遵循协议第4节将产生完全分化的月管，用于进一步的实验操作。肌细胞的分化通常需要4-6天，在此期间，细胞的形态将从单一的圆形球体变为细长、熔融、多核化纤维（图4）。根据协议第5节，将在96孔板中产生分化的电管，以便根据耗氧量的变化和细胞外酸化^率10（图5）实现各种代谢表征。

Discussion

骨骼肌对于建立和维护代谢^平衡11至关重要。肌肉生理学的研究因个体间变异性以及获取样本的困难而变得复杂，特别是在人类研究中。培养的原发性肌管已被证明可以重述肌肉生理学的许多特征，包括钙^平衡12、受损肌肉组织的^再生5、对^运动13的代谢改变，糖尿病等疾病引起的新陈代谢的^改变。小鼠的肌细胞和肌管的主要培养能够研究含有明确基因操作的肌肉细胞，并为从人类肌肉活检中衍生的肌管研究提供补充^{12，15 ， 16}.因此，小鼠原发性肌细胞和肌管的分离和培养方法对于实现肌肉细胞功能外体可重复的高通量调查至关重要。此处描述的协议允许在各种实验操作下建立和研究原原小鼠异位动物和近管。

虽然.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>包被溶液：
DMEM	Gibco	10569010	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积计）;24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
接种介质：
DMEM	Gibco	10569010	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;12.5 mL
热灭活 FBS	Life Technologies	16000044	20 毫升;可以作为常规 FBS 购买，并通过放入 40 &g;C 水浴 20 分钟
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast 培养基：
DMEM	Gibco	10569010	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;17.5 mL
加热10 mL 的 Life	Technologies	16000044	FBS;可以作为普通 FBS 购买，并放入 40 °C 水浴 20 分钟
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
分化培养基：
DMEM	Gibco	10569010	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前始终添加庆大霉素（1：1,000 体积）;24 mL
加热灭活马血清	Sigma	H1138	1.5 mL
胰岛素-硒-转铁蛋白	Life Technologies	41400045	0.5 mL
其他材料：
PBS	Gibco	14040133
庆大霉素	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	在 Myoblast 培养基中制备 10% DMSO，用于冷冻细胞
镊子	任何
剃须刀片	任何
剪刀	任何
Whatman 纸	VWR	21427-648
60 mm 板	VWR	734-2318
10 cm 板	VWR	25382-428 （CS）
T25 培养瓶	ThermoFisher	156367
T75 培养瓶	ThermoFisher	156499
离心管 （15 mL）	BioPioneer	CNT-15
耗氧率：
Seahorse XFe96 分析仪	安捷伦	Seahorse XFe96 分析仪	用于测量通过细胞外培养基酸化读出的耗氧率的仪器
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96 孔板，用于 XFe96 分析仪
Seahorse XF 细胞线粒体压力检测试剂盒	Agilent	103015-100	组件 一旦确定分析结果，可以从其他供应商处购买;下面列出了一些建议
Seahorse XF 棕榈酸酯-BSA FAO 底物	分析确定后，可以从其他供应商处购买	Agilent	102720-100
棕榈酸	Sigma	P5585-10G	用于脂肪酸氧化
肉碱	Sigma	C0283-5G	用于脂肪酸氧化
Etomoxir	Sigma	E1905	用于脂肪酸氧化
BSA	Sigma	A7030	用作对照或与棕榈酸偶联，用于脂肪酸氧化测量