从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

摘要

成肌细胞是能够增殖的前体细胞，可分化形成多核的肌管，并最终发育为骨骼肌肌纤维。本文介绍一种从小鼠成年早期骨骼肌中高效分离和培养原代成肌细胞的实验方案。该方法可用于在体外培养条件下对肌肉细胞进行分子、遗传和代谢方面的研究。

摘要

原代成肌细胞是骨骼肌未分化的增殖前体细胞。这些细胞可在体外培养并作为肌肉前体细胞进行研究，也可被诱导分化为肌肉发育的后续阶段。本文提供的方案描述了一种从年轻成年小鼠骨骼肌组织块中分离并培养高增殖活性成肌细胞群体的可靠方法。这些细胞可用于研究不同小鼠模型骨骼肌的代谢特性，也可应用于其他下游实验，例如外源DNA转染或病毒表达载体的转导。这些细胞的分化程度和代谢特征取决于诱导成肌细胞分化所用培养基的成分及其作用时间。这些方法为体外研究小鼠肌肉细胞代谢提供了可靠的实验体系。重要的是，与体内模型不同，本文所述方法获得的细胞群体可大量扩增，并具有高度可重复性，便于深入研究。

引言

尽管常被用作整体代谢健康的指标，但多项研究表明，老年人的身体质量指数（BMI）与死亡风险升高之间并无一致关联。迄今为止，唯一被证实与该人群死亡率降低持续相关的因素是肌肉量的增加¹。肌肉组织是体内胰岛素敏感细胞的最大来源之一，因此在维持整体代谢稳态中起着关键作用²。通过运动激活骨骼肌组织，可提高局部胰岛素敏感性并改善整体代谢健康³。虽然体内模型对于研究肌肉生理学及肌肉功能对整体代谢的影响至关重要，但肌管原代培养体系提供了一个可操作的实验系统，能够降低动物实验的复杂性。

从出生后肌肉中分离得到的成肌细胞可用于以高度可重复的方式研究多种处理方法和生长条件的影响。这一用途早已被认可，并已有多种成肌细胞分离与培养方法被报道^4,5,6,7,8,9。其中一些方法使用新生动物的肌肉组织，获得的成肌细胞数量相对较少⁵

方案

本方案遵循斯克里普斯研究所的动物护理指南。

1. 肌肉组织外植体的采集与处理

1. 解剖前一天，对所有解剖器械（镊子、刀片和剪刀）进行灭菌，并准备好所有所需培养基：磷酸盐缓冲液（PBS）、MB 铺板培养基（12.5 mL DMEM、12.5 mL HAMS F12、20 mL 热灭活胎牛血清（FBS）、5 mL 羊水培养基补充剂）以及包被液（24 mL DMEM、24 mL HAMS F12、1.7 mL 胶原蛋白、1 mL Matrigel）。
2. 解剖当天，为每块待解剖的肌肉准备一个6 cm培养皿，并用包被液进行包被。向每个培养皿表面加入2 mL包被液，轻轻摇晃使液体均匀覆盖表面，然后将培养皿连同溶液在4 °C下孵育1小时。
3. 从培养皿中移除包被液并回收至原储存液中。
   注意：包被液可重复使用长达六个月，应保存在4 °C环境中。
4. 用2 mL PBS将培养皿清洗两次，以去除未结合的胶原蛋白和Matrigel。
5. 在解剖过程中，将培养皿置于37 °C细胞培养孵育箱中。
6. 通过在塑料袋或无菌15 cm培养皿中放置2–3张厚吸水纸，并用移液器将无菌水润湿纸张表面，制备一个湿润 chamber。
7. 将该 chamber 置于紫外线下照射5分钟以灭菌。
8. 从4至8周龄小鼠中解剖所需肌肉。为灭菌肌肉....

结果

按照所提供的实验方案第1节操作后，应可从组织块中获得原代细胞，这些细胞在标准光学显微镜下可见（图2）。可见异质性的细胞群体从每块肌肉组织块中迁移生长并环绕其周围。成肌细胞表现为小而圆、明亮的球形细胞。按照实验方案第2节操作后，可获得来自组织块的早期成肌细胞收获物，其中细胞数量较少且具有异质性（图3）。实验方案第3节描述了使用PBS（而非胰蛋白酶）对早期收获的细胞进行传代，从而获得相对纯的成肌细胞群体，用于后续培养。按照实验方案第4节操作后，将获得完全分化的肌管细胞，可用于进一步的实验操作。成肌细胞的分化通常需要4–6天，在此期间，细胞形态会从单个、圆形的球状细胞转变为细长、融合的多核纤维状结构（图4）。按照实验方案第5节操作后，可在96孔板中获得分化的肌管细胞，从而基于氧消耗率和细胞外酸化率的变化进行多种代谢特征分析¹⁰（

讨论

骨骼肌对于机体代谢稳态的建立与维持至关重要¹¹。由于个体间存在差异，且获取样本困难，尤其是人类研究中，肌肉生理学的研究面临挑战。已证实，体外培养的原代肌管细胞能够重现多种肌肉生理特征，包括钙稳态¹²、受损肌肉组织的再生⁵、对运动产生的代谢变化¹³，以及糖尿病等疾病引起的代谢改变¹⁴。利用小鼠来源的成肌细胞和肌管细胞进行原代培养，可研究携带明确遗传修饰的肌肉细胞，并可作为源自人类肌肉活检的肌管细胞研究的补充^12,15,16。因此，建立小鼠原代成肌细胞和肌管细胞的分离与培养方法，对于在体外实现可重复、高通量的肌肉细胞功能研究至关重要。本文所述方案可用于在多种实验干预条件下建立并研究小鼠原代成肌细胞和肌管细胞。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包被液：
DMEM	Gibco	10569010	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
胶原蛋白	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
铺板培养基：
DMEM	Gibco	10569010	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；12.5 mL
热灭活胎牛血清	Life Technologies	16000044	20 mL；可购买普通胎牛血清，并在40 °C水浴中加热20分钟进行热灭活
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
成肌细胞培养基：
DMEM	Gibco	10569010	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；17.5 mL
热灭活胎牛血清	Life Technologies	16000044	10 mL；可购买普通胎牛血清，并在40 °C水浴中加热20分钟进行热灭活
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
分化培养基：
DMEM	Gibco	10569010	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
热灭活马血清	Sigma	H1138	1.5 mL
胰岛素-硒-转铁蛋白	Life Technologies	41400045	0.5 mL
其他材料：
PBS	Gibco	14040133
庆大霉素	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	用成肌细胞培养基配制成10% DMSO溶液，用于细胞冻存
镊子	任意品牌
刀片	任意品牌
剪刀	任意品牌
Whatman滤纸	VWR	21427-648
60 mm培养皿	VWR	734-2318
10 cm培养皿	VWR	25382-428 (CS)
T25培养瓶	ThermoFisher	156367
T75培养瓶	ThermoFisher	156499
离心管（15 mL）	BioPioneer	CNT-15
耗氧速率：
Seahorse XFe96 分析仪	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	用于检测细胞外培养基酸化程度从而读取耗氧速率的仪器
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	适用于XFe96分析仪的96孔板
Seahorse XF 细胞线粒体应激测试试剂盒	Agilent	103015-100	建立检测方法后，各组分可从其他供应商处采购；以下列出部分推荐替代品
Seahorse XF 棕榈酸-BSA 脂肪酸氧化底物	Agilent	102720-100	建立检测方法后，各组分可从其他供应商处采购；以下列出部分推荐替代品
棕榈酸	Sigma	P5585-10G	用于脂肪酸氧化的测定
肉碱	Sigma	C0283-5G	用于脂肪酸氧化的测定
依替莫西	Sigma	E1905	用于脂肪酸氧化的测定
BSA	Sigma	A7030	作为对照使用，或与棕榈酸结合用于脂肪酸氧化测定