需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

17.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60310

⸱

2019年10月15日

 , 
1Scripps Research, Department of Molecular Medicine

本文内容

摘要

成肌细胞是能够增殖的前体细胞，可分化形成多核的肌管，并最终发育为骨骼肌肌纤维。本文介绍一种从小鼠成年早期骨骼肌中高效分离和培养原代成肌细胞的实验方案。该方法可用于在体外培养条件下对肌肉细胞进行分子、遗传和代谢方面的研究。

摘要

原代成肌细胞是骨骼肌未分化的增殖前体细胞。这些细胞可在体外培养并作为肌肉前体细胞进行研究，也可被诱导分化为肌肉发育的后续阶段。本文提供的方案描述了一种从年轻成年小鼠骨骼肌组织块中分离并培养高增殖活性成肌细胞群体的可靠方法。这些细胞可用于研究不同小鼠模型骨骼肌的代谢特性，也可应用于其他下游实验，例如外源DNA转染或病毒表达载体的转导。这些细胞的分化程度和代谢特征取决于诱导成肌细胞分化所用培养基的成分及其作用时间。这些方法为体外研究小鼠肌肉细胞代谢提供了可靠的实验体系。重要的是，与体内模型不同，本文所述方法获得的细胞群体可大量扩增，并具有高度可重复性，便于深入研究。

引言

尽管常被用作整体代谢健康的指标，但多项研究表明，老年人的身体质量指数（BMI）与死亡风险升高之间并无一致关联。迄今为止，唯一被证实与该人群死亡率降低持续相关的因素是肌肉量的增加1。肌肉组织是体内胰岛素敏感细胞的最大来源之一，因此在维持整体代谢稳态中起着关键作用2。通过运动激活骨骼肌组织，可提高局部胰岛素敏感性并改善整体代谢健康3。虽然体内模型对于研究肌肉生理学及肌肉功能对整体代谢的影响至关重要，但肌管原代培养体系提供了一个可操作的实验系统，能够降低动物实验的复杂性。

从出生后肌肉中分离得到的成肌细胞可用于以高度可重复的方式研究多种处理方法和生长条件的影响。这一用途早已被认可，并已有多种成肌细胞分离与培养方法被报道4,5,6,7,8,9。其中一些方法使用新生动物的肌肉组织，获得的成肌细胞数量相对较少5,8，因此在大规模研究中需要使用较多动物。此外，目前最常用的成肌细胞培养方法依赖于“预贴壁”"pre-plating"技术来富集成肌细胞，其原理是利用成肌细胞相较于其他细胞类型贴壁能力较弱的特性。我们发现，本文所述的替代性富集方法在富集高增殖活性的成肌细胞群体方面更为高效且可重复性更高。总之，本方案通过肌肉组织块在培养基中的细胞迁移生长，实现了从年轻成年动物肌肉组织块中高效分离高增殖活性的成肌细胞。成肌细胞可在数天内多次收获，快速扩增，并可诱导其分化为肌管。该方法可稳定地获得大量健康且具有强分化能力的成肌细胞，这些细胞能够自发收缩并高效分化为肌管。本方案已使我们能够研究多种基因型小鼠原代肌管中的代谢及昼夜节律。最后，我们还提供了制备肌管以研究氧化代谢的方法，包括利用96孔板检测氧消耗率的技术。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案遵循斯克里普斯研究所的动物护理指南。

1. 肌肉组织外植体的采集与处理

  1. 解剖前一天，对所有解剖器械（镊子、刀片和剪刀）进行灭菌，并准备好所有所需培养基：磷酸盐缓冲液（PBS）、MB 铺板培养基（12.5 mL DMEM、12.5 mL HAMS F12、20 mL 热灭活胎牛血清（FBS）、5 mL 羊水培养基补充剂）以及包被液（24 mL DMEM、24 mL HAMS F12、1.7 mL 胶原蛋白、1 mL Matrigel）。
  2. 解剖当天，为每块待解剖的肌肉准备一个6 cm培养皿，并用包被液进行包被。向每个培养皿表面加入2 mL包被液，轻轻摇晃使液体均匀覆盖表面，然后将培养皿连同溶液在4 °C下孵育1小时。
  3. 从培养皿中移除包被液并回收至原储存液中。
    注意：包被液可重复使用长达六个月，应保存在4 °C环境中。
  4. 用2 mL PBS将培养皿清洗两次，以去除未结合的胶原蛋白和Matrigel。
  5. 在解剖过程中，将培养皿置于37 °C细胞培养孵育箱中。
  6. 通过在塑料袋或无菌15 cm培养皿中放置2–3张厚吸水纸，并用移液器将无菌水润湿纸张表面，制备一个湿润 chamber。
  7. 将该 chamber 置于紫外线下照射5分钟以灭菌。
  8. 从4至8周龄小鼠中解剖所需肌肉。为灭菌肌肉组织，用含40 μg/mL庆大霉素的PBS轻轻冲洗。
    注意：对于股四头肌和腓肠肌，每块培养皿接种一块肌肉；对于比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）和跖肌，将双侧肢体的肌肉合并接种于同一培养皿中。
  9. 使用无菌镊子将肌肉转移至一个无菌的10 cm未包被培养皿中。在肌肉上方加入0.5–1.0 mL铺板培养基，使组织保持湿润但不漂浮（图1A）。
  10. 使用无菌手术刀或刀片将肌肉轻轻切成小片段（约1–3 mm3）。
    注意：为获得最佳效果，应尽量减少对肌肉组织的操作。
  11. 使用镊子或移液器将肌肉片段转移至预先包被的6 cm培养皿表面。非常轻柔地在组织上方再覆盖0.8 mL铺板培养基。培养基应足以保持组织片段湿润，但不使其漂浮（图1B）。
  12. 将含有肌肉片段的6 cm培养皿放入湿润 chamber 中，并放回孵育箱（37 °C，5% CO2）中孵育48小时（图1C）。
    注意：肌肉片段必须牢固贴附于培养皿表面，以利于成肌细胞的迁移生长。至少在48小时内不得移动培养皿或 chamber。
  13. 48小时后，仔细检查培养皿，确认肌肉片段已贴附。然后小心地在上方覆盖2 mL铺板培养基，注意不要使片段脱落。
    注意：若培养皿中可见污染或碎片，应小心清洗肌肉组织。将2 mL PBS/庆大霉素溶液加至培养皿边缘，轻轻倾斜使液体流过肌肉组织，随后吸除PBS并重复清洗一次。第二次清洗后，覆盖2 mL铺板培养基。
  14. 在37 °C孵育箱中继续培养最多额外3天（自初次解剖起共5天），然后收获成肌细胞。每隔一天观察一次成肌细胞的迁移生长情况。
    注意：从肌肉外植体中出现的细胞形态具有变异性且呈异质性。原代成肌细胞表现为体积小、圆形、折光性强的细胞。然而，在此阶段仅凭形态识别这些细胞既不必要也不可靠（图2）。

2. 收集迁移生长的成肌细胞

  1. 准备并预热成肌细胞培养基（17.5 mL DMEM、17.5 mL HAMS F12、10 mL FBS、5 mL 羊水培养基添加剂）、胰蛋白酶和含庆大霉素的磷酸盐缓冲液（PBS/gentamicin）。按照步骤1.2所述方法，使用包被液对每个待收获肌肉组织对应的T25培养瓶进行包被（见表1）。
  2. 移除铺板培养基，并用2 mL含庆大霉素的PBS轻柔冲洗肌肉组织块。迅速吸除PBS（每次仅处理一个培养板，此步骤中切勿让培养板长时间浸泡在PBS中）。
  3. 轻柔加入1 mL含庆大霉素的PBS，将培养板置于37 °C培养箱中孵育1分钟。
  4. 使用P1000移液器将PBS/细胞混合物收集至15 mL离心管中。
  5. 向培养板中加入1 mL胰蛋白酶，放回37 °C培养箱孵育3分钟。轻敲培养板以松动成肌细胞。收集胰蛋白酶/细胞混合物，并与先前的PBS收集液合并。向离心管中加入8 mL成肌细胞培养基，轻柔颠倒混匀。
  6. 在肌肉组织培养板上轻柔覆盖2 mL铺板溶液，放回37 °C培养箱继续培养。
  7. 将含有细胞的离心管在离心机中以200 × g 离心3分钟。
  8. 小心吸除上清液至剩余约1 mL，注意避免扰动细胞沉淀。轻柔加入成肌细胞培养基（见表1），将细胞转移至预先包被的培养瓶中，放入37 °C培养箱培养。此为P0代收获。若在显微镜下观察，可见细胞数量可能极少（图3）。
  9. 每隔一天重复上述收获操作，最多进行三次。第三次收获后，弃去组织块。

3. 增殖性成肌细胞的扩增与富集

注意：P0 代收获的细胞为异质性细胞群（约 60% 为成肌细胞）。接下来的连续两代传代使用 PBS 选择性收获成肌细胞。许多黏附性更强的细胞将被弃去，而快速增殖的成肌细胞在经过两代传代后纯度可达 95% 以上。成肌细胞建系后，应维持在低密度培养，以避免自发性分化。

  1. 对于第2节中每个约40-50%融合度的T25培养瓶细胞，用5 mL包被液包被一个T75培养瓶，并置于4 °C下1-4小时。
  2. 从培养瓶中移除包被液并回收至储存液中。用2 mL PBS/庆大霉素冲洗培养瓶两次，并将其放入37 °C培养箱中。
  3. 吸除P0代成肌细胞T25培养瓶中的培养基。用2 mL预热的PBS/庆大霉素轻轻冲洗细胞一次。吸除培养瓶中的PBS。
    注意：此步骤（3.3）的目的是降低细菌污染的可能性。若操作迅速且轻柔，不应导致成肌细胞丢失。如需最大程度保留成肌细胞，可省略此步骤。
  4. 向每个含有成肌细胞的培养瓶中加入2 mL预热的PBS（不含胰蛋白酶）。将培养瓶连同PBS一起放入37 °C培养箱中孵育3分钟。
    注意：成肌细胞应能轻松从培养瓶表面脱落。此步骤使用PBS而非胰蛋白酶，对于减少其他细胞类型的污染至关重要。
  5. 从37 °C培养箱中取出培养瓶，用力轻敲瓶壁以使细胞脱落。在光学显微镜下检查是否有游离漂浮的成肌细胞。
  6. 将培养瓶直立放置于细胞培养超净台中，用10 mL成肌细胞培养基冲洗瓶底2-3次，确保所有细胞均被洗下。
  7. 将细胞与培养基的混合液收集至15 mL离心管中。在200 × g条件下离心3分钟。
  8. 小心吸除上清液至剩余约1 mL，避免扰动细胞沉淀。向离心管中轻柔加入适量的成肌细胞培养基，并轻轻混匀。
  9. 将细胞悬液分装至新的T75培养瓶中。每个新T75培养瓶中加入10 mL成肌细胞培养基。轻轻水平摇动培养瓶以均匀分布细胞，并置于37 °C培养箱中过夜培养。
  10. 两天后，再次使用PBS传代，将每个T75培养瓶分种到三个新的T75培养瓶中。
    注意：切勿使成肌细胞融合度超过50%-60%，否则会引发细胞开始分化并丧失增殖能力。
  11. 后续传代可使用胰蛋白酶。使用PBS传代两次可获得>95%纯度的成肌细胞；进一步提高纯度的尝试往往会导致分化能力下降。

4. 原代成肌细胞向肌管细胞的分化

  1. 将P2代（或更晚代次）的成肌细胞以成肌细胞培养基接种于包被的培养板上（包被方法及接种体积、细胞数量建议参见表1）。接种后两到三天，当细胞融合度达到70-80%时，更换为分化培养基（24 mL DMEM、24 mL HAMS F12、1.5 mL 热灭活马血清、0.5 mL 胰岛素-硒-转铁蛋白）。
  2. 在原代成肌细胞向成肌管分化的过程中，每隔一天更换一次分化培养基。分化通常在第4至5天完成，表现为细胞伸长、融合并出现自发性收缩。分化后的成肌管应在6天内用于实验。通常在启动分化后第5或第6天进行检测。

5. 在96孔板中测量成肌细胞或肌管细胞的氧消耗率

  1. 每孔加入 25 μL 包被液对 96 孔板进行包被。以 58 × g 离心 1 分钟，去除任何气泡。
  2. 将板置于包被液中，在 4 °C 下孵育 1–4 小时。使用多通道移液器吸除包被液，并用 25 μL 冷的 PBS/庆大霉素溶液洗涤三次。至少对其中一次洗涤进行离心，以确保无气泡残留。
  3. 每孔加入 40 μL 分化培养基。将培养基加入已包被但无细胞的板中，以 58 × g 离心 1 分钟，以避免产生气泡并消除表面张力，从而获得均匀的培养基层。
  4. 向每孔中加入悬浮于额外 40 μL 培养基中的细胞。再次以 58 × g 离心。
    注意：接种的一致性对获得最佳结果至关重要，每孔接种的细胞数量应根据每个实验条件进行优化，通常在 96 孔板中每孔接种约 10,000–25,000 个成肌细胞。
  5. 在分化过程中每日轻柔更换培养基。不要抽吸培养基，而应使用移液器移除，保留少量体积，以避免细胞脱落或暴露于空气中。例如，分三次每次更换 50 μL，而不是一次性更换全部 80 μL。
  6. 每种条件使用 8–15 个孔。若细胞未能形成均匀的肌管层，可能需要舍弃部分孔。
    注意：应舍弃板边缘的孔，因其极易发生蒸发。为避免系统性误差，实验重复时应调整板上的布局设置。
  7. 在完全分化后的 1–2 天内（从分化开始起第 4–6 天）对已分化的肌管进行所需的检测。用于测量耗氧率的推荐仪器和试剂列于材料表中。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

按照所提供的实验方案第1节操作后，应可从组织块中获得原代细胞，这些细胞在标准光学显微镜下可见（图2）。可见异质性的细胞群体从每块肌肉组织块中迁移生长并环绕其周围。成肌细胞表现为小而圆、明亮的球形细胞。按照实验方案第2节操作后，可获得来自组织块的早期成肌细胞收获物，其中细胞数量较少且具有异质性（图3）。实验方案第3节描述了使用PBS（而非胰蛋白酶）对早期收获的细胞进行传代，从而获得相对纯的成肌细胞群体，用于后续培养。按照实验方案第4节操作后，将获得完全分化的肌管细胞，可用于进一步的实验操作。成肌细胞的分化通常需要4–6天，在此期间，细胞形态会从单个、圆形的球状细胞转变为细长、融合的多核纤维状结构（图4）。按照实验方案第5节操作后，可在96孔板中获得分化的肌管细胞，从而基于氧消耗率和细胞外酸化率的变化进行多种代谢特征分析10（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

骨骼肌对于机体代谢稳态的建立与维持至关重要11。由于个体间存在差异，且获取样本困难，尤其是人类研究中，肌肉生理学的研究面临挑战。已证实，体外培养的原代肌管细胞能够重现多种肌肉生理特征，包括钙稳态12、受损肌肉组织的再生5、对运动产生的代谢变化13，以及糖尿病等疾病引起的代谢改变14。利用小鼠来源的成肌细胞和肌管细胞进行原代培养，可研究携带明确遗传修饰的肌肉细胞，并可作为源自人类肌肉活检的肌管细胞研究的补充12,15,16。因此，建立小鼠原代成肌细胞和肌管细胞的分离与培养方法，对于在体外实现可重复、高通量的肌肉细胞功能研究至关重要。本文所述方案可用于在多种实验干预条件下建立并研究小鼠原代成肌细胞和肌管细胞。

<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

作者感谢墨尔本大学的 Matthew Watt 博士和约翰斯·霍普金斯大学的 Anastasia Kralli 博士在采用基于 Mokbel 等人研究的实验方案过程中提供的帮助6。我们还感谢 Sabine Jordan 博士在本实验室开发和采用该实验方案过程中提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 K.A.L. 负责的 R01 DK097164 和 DK112927。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
包被液：
DMEMGibco10569010使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
HAMS F12Lonza12-615F使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
胶原蛋白Life TechnologiesA10644011.7 mL
MatrigelFisherCB40234A1 mL
铺板培养基：
DMEMGibco10569010使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；12.5 mL
HAMS F12Lonza12-615F使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；12.5 mL
热灭活胎牛血清Life Technologies1600004420 mL；可购买普通胎牛血清，并在40 °C水浴中加热20分钟进行热灭活
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
成肌细胞培养基：
DMEMGibco10569010使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；17.5 mL
HAMS F12Lonza12-615F使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；17.5 mL
热灭活胎牛血清Life Technologies1600004410 mL；可购买普通胎牛血清，并在40 °C水浴中加热20分钟进行热灭活
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
分化培养基：
DMEMGibco10569010使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
HAMS F12Lonza12-615F使用前务必添加庆大霉素（按体积比1:1,000）；24 mL
热灭活马血清SigmaH11381.5 mL
胰岛素-硒-转铁蛋白Life Technologies414000450.5 mL
其他材料：
PBSGibco14040133
庆大霉素SigmaG1397
TrypLEGibco12604013
DMSOSigma472301用成肌细胞培养基配制成10% DMSO溶液，用于细胞冻存
镊子任意品牌
刀片任意品牌
剪刀任意品牌
Whatman滤纸VWR21427-648
60 mm培养皿VWR734-2318
10 cm培养皿VWR25382-428 (CS)
T25培养瓶ThermoFisher156367
T75培养瓶ThermoFisher156499
离心管（15 mL）BioPioneerCNT-15
耗氧速率：
Seahorse XFe96 分析仪AgilentSeahorse XFe96 Analyzer用于检测细胞外培养基酸化程度从而读取耗氧速率的仪器
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100适用于XFe96分析仪的96孔板
Seahorse XF 细胞线粒体应激测试试剂盒Agilent103015-100建立检测方法后，各组分可从其他供应商处采购；以下列出部分推荐替代品
Seahorse XF 棕榈酸-BSA 脂肪酸氧化底物Agilent102720-100建立检测方法后，各组分可从其他供应商处采购；以下列出部分推荐替代品
棕榈酸SigmaP5585-10G用于脂肪酸氧化的测定
肉碱SigmaC0283-5G用于脂肪酸氧化的测定
依替莫西SigmaE1905用于脂肪酸氧化的测定
BSASigmaA7030作为对照使用，或与棕榈酸结合用于脂肪酸氧化测定

参考文献

  1. Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
  2. Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
  3. Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
  4. Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
  5. Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
  6. Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
  7. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  8. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  9. Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
  10. Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
  11. Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
  12. Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
  13. Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
  14. Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
  15. Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
  16. Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917(2018).
  17. Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
  18. Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

细胞分离组织外植成肌细胞分化细胞培养流式细胞术光学显微镜Seahorse 检测耗氧量
从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。