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下一代病毒RNA/DNA原位杂交技术在人类免疫缺陷病毒/灵长类免疫缺陷病毒研究中的应用

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DOI：

10.3791/60318

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2020年6月17日

 ,  ,  , 
1AIDS and Cancer Virus Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc., 2Vaccine and Gene Therapy Institute and Oregon National Primate Research Center (ONPRC), Oregon Health and Science University (OHSU)

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中特定病毒RNA或DNA序列的下一代原位杂交检测方法。该方法可在不到24小时内实现对极低拷贝数的RNA和DNA进行高灵敏度和高特异性的可视化。

摘要

原位杂交是一种强大的技术，可用于鉴定组织切片中单个细胞内的特定RNA或DNA序列，从而为生理过程和疾病发病机制提供重要见解。原位杂交（ISH）已长期用于评估病毒感染细胞的位置；近年来，一种新一代ISH技术被开发出来，其采用独特的探针设计策略，能够在保持组织形态的同时实现信号放大和背景抑制，从而达到单分子水平的可视化。这种新一代ISH技术类似于支链PCR方法，但是在原位进行，相较于传统的ISH方法或原位PCR技术，在常规检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的RNA或DNA时，具有更高的简便性、灵敏度和可重复性。在过去数年中，我们实验室已将该ISH平台应用于多种福尔马林固定石蜡包埋组织中人免疫缺陷病毒（HIV）和猴免疫缺陷病毒（SIV）的病毒RNA（vRNA）和/或病毒DNA（vDNA）阳性细胞的检测。通过本篇详细的技术论文，我们希望与所有对在研究中应用新一代原位杂交技术感兴趣的人员分享我们的经验与建议。

引言

原位杂交（ISH）是一种实验方法，用于将互补的DNA、RNA或修饰的核酸链（即探针）靶向并可视化细胞或组织切片中特定的DNA或RNA序列。ISH能够在组织中特异性地定位和显示特定核酸序列，有助于理解目标序列的表达水平、结构组织、分布情况及其与细胞环境之间的相互作用，这些信息是其他常用技术（如qPCR）所无法获得的。在过去，ISH通常使用标记的互补DNA或互补RNA（核糖探针）进行。这些探针可直接与放射性、荧光或抗原标记的碱基（例如35S、FITC和地高辛）偶联，随后分别通过放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学检测方法在组织中进行定位和定量。尽管这些原位技术仍然是有价值的研究手段，但仍存在较大的改进空间，以发展出更省力、更简便、更快速、更灵敏且更具特异性的方法。

一种可替代的商业化下一代原位杂交（ISH）方法（例如RNAscope检测），于2012年首次报道，用于检测宿主信使RNA（mRNA），其原理基于分支PCR。该方法可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的细胞和组织中进行mRNA检测，灵敏度接近在单个细胞中实现单个RNA分子的可视化1。该方法的特异性依赖于一种独特条件：两个双Z靶标探针必须连续结合至各自互补的RNA（或DNA）序列，才能使信号预扩增子依次结合1。这可启动后续类似分支DNA（bDNA）的杂交步骤，形成信号扩增级联反应1,2。此外，该方法极为快速且操作简便，仅需1天内（<8小时）即可获得结果，相较于其他技术（包括放射性原位杂交Radio-ISH）可能需要长达4周的时间，具有显著优势1,2。这种下一代ISH技术为HIV/SIV研究开辟了新的前景与机遇。目前实现HIV治愈的主要障碍是在疾病早期阶段即已建立的细胞和组织储存库3,4。该技术的总体目标是识别、定位并最终理解作为病毒储存库并在感染宿主中持续存在的主要组织区室，从而推动有效HIV治愈策略的开发。

本文详细介绍了我们的双重下一代RNA/DNA多重原位杂交（ISH）实验方案（例如RNAscope/DNAscope），并解释了如何对现有的RNA原位杂交方案进行修改，以优化下一代ISH技术在我们的样本及特定靶标上的应用。该方案可在5 μm厚的组织切片中实现HIV/SIV病毒RNA和病毒DNA的可视化、定位与定量分析。通过结合两种定制探针组——一种为正义链探针，靶向vDNA编码链（C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense探针[416141-C1]）；另一种为反义链探针，靶向vRNA转录本（C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense探针[416131-C2]），覆盖病毒基因组的不同区域（表1），并利用两个不同的信号检测通道C1和C2，可同时实现vRNA与vDNA的可视化。在本方案中，通道C1和C2可使信号以不同颜色呈现（即碱性磷酸酶显色为红色，辣根过氧化物酶显色为棕色），并采用不同的方法检测探针信号。除组织固定处理与切片步骤外，该检测实验共需2天。本文展示的是可在细胞沉淀或组织切片上进行的双重vRNA与vDNA原位杂交实验方案。

方案

1. 切片与载玻片制备

  1. 修剪石蜡包埋块，使用切片机切取 5 +/-1 µm 的切片。将切片或细胞团块置于 40–45 °C 的无 RNase 水浴中贴附于带电荷的显微镜载玻片上。在 37 °C 或室温下将载玻片空气干燥过夜。
    注意：载玻片可在室温（RT）下保存最长 3 个月，在 4 ˚C 下保存最长 6 个月。
  2. 脱去 FFPE 载玻片中的石蜡。
    1. 将载玻片置于干燥烘箱中，在 60 °C 下烘烤 1 小时。
    2. 在通风橱内，用约 200 mL 新鲜二甲苯填充两个载玻片染色缸，并用约 200 mL 新鲜 100% 乙醇填充另外两个染色缸。用盖子盖好容器。
    3. 将载玻片放入支架中，浸入第一个含二甲苯的染色缸中。在室温下振荡孵育 5–10 分钟。
    4. 将载玻片转移至第二个含二甲苯的染色缸中，在室温下振荡孵育 5–10 分钟。
    5. 立即将载玻片放入盛有 100% 乙醇的染色缸中，在室温下振荡孵育 5–10 分钟。
    6. 立即将载玻片放入第二个盛有 100% 乙醇的染色缸中，在室温下振荡孵育 5–10 分钟。
    7. 从乙醇中取出支架，轻轻敲击支架侧面以去除多余乙醇，并在无 RNase 水中冲洗 5–15 分钟。

2. 烤箱准备

  1. 打开杂交炉，并将温度设置为 40 °C。
  2. 在托盘中放置一块布或坚固的吸水纸巾，用双蒸水彻底浸湿，以实现湿度控制。
  3. 将盖好的托盘放入杂交炉中并关闭炉门。使用前在 40 °C 下预热至少 30 分钟。不使用时，将托盘保留在炉内。

3. 热诱导表位修复

  1. 配制基于柠檬酸盐的0.5x原位杂交靶点修复缓冲液（10 nmol/L，pH = 6，参见材料表）。将缓冲液置于加热板上的烧杯中煮沸。
  2. 将载玻片放入沸腾的靶点修复缓冲液中，进行30分钟的热诱导表位修复。
  3. 从靶点修复缓冲液中取出载玻片，立即用双蒸水清洗，并在100%乙醇中脱水5分钟，随后空气干燥。
  4. 待载玻片完全空气干燥后，使用疏水屏障笔在载玻片上围绕组织切片区画圈。确保疏水屏障完全空气干燥。

4. 蛋白酶预处理

  1. 将干燥的载玻片放置在可锁定的载玻片架上，然后通过将蛋白酶消化液（2.5 µg/mL）与无菌冷PBS按1:5的比例稀释，配制蛋白酶预处理试剂。充分混匀。
    注意：市售试剂盒中提供三种不同浓度的蛋白酶试剂，分别为蛋白酶III（标准型）、蛋白酶IV（强效型）和蛋白酶Plus（温和型）。在正式研究前应通过实验确定蛋白酶消化时间和稀释比例，因为最佳条件会因组织类型、固定方式和厚度而异（见讨论部分）。
  2. 将稀释后的蛋白酶溶液加至载玻片上，确保完全覆盖组织切片。立即把载玻片放入已在步骤1.4中预热的40 °C烘箱中孵育20分钟，并确保载玻片密封于湿润的杂交盒内。在后续操作中切勿让组织切片干燥。
  3. 将可锁定载玻片架立即浸入盛有重蒸水的洗涤盘中，清洗3次。
  4. 向每张组织切片滴加过氧化物酶阻断液，完全覆盖切片以进行内源性过氧化物酶封闭。室温孵育10分钟。完成后，用重蒸水冲洗切片3次。

5. 探针杂交与信号扩增

注意：为防止蒸发，务必确保湿度控制托盘密封良好，以免组织在孵育过程中干燥。在洗涤步骤期间，将湿度 chamber 放回烘箱中，以确保其保持在 40 °C。

  1. 按照制造商建议，将C2探针与C1探针以1:50的比例混合，即取1体积的C2探针加入50体积的C1探针至离心管中，用移液器吹打混匀。轻轻颠倒混匀数次。使用前将探针混合物置于40 °C烘箱中预热约10分钟，以溶解可能产生的沉淀。
    注意：混合后的探针可在4 °C下保存长达6个月。
  2. 从水中取出玻片，冲洗后轻拍或弹动玻片，去除组织切片上的多余水分。立即在玻片上滴加探针，确保每个组织切片完全覆盖且无气泡。将探针混合物在40 °C湿盒中孵育过夜。
  3. 次日，从烘箱中取出玻片，放入含有0.5x洗涤缓冲液的染色缸中，在室温下洗涤5分钟。重复该洗涤步骤一次。
  4. 从洗涤缓冲液中取出玻片，冲洗后轻拍或弹动玻片，去除组织切片上多余的洗涤缓冲液。
  5. 在玻片上滴加商品化的AMP 1试剂（即用型，2 nmol/L），溶于杂交缓冲液B（20%甲酰胺，5x SSC，0.3%十二烷基硫酸锂，10%硫酸葡聚糖，封闭试剂）中，确保组织切片完全覆盖且无气泡。在40 °C湿盒中孵育30分钟。重复步骤1.6.3–1.6.4，每次洗涤2分钟。
  6. 在玻片上滴加商品化的AMP 2试剂，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，在40 °C孵育15分钟。重复步骤5.3–5.4，每次洗涤2分钟。
  7. 在玻片上滴加商品化的AMP 3试剂，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，在40 °C孵育30分钟。重复步骤5.3–5.4，每次洗涤2分钟。
  8. 在玻片上滴加商品化的AMP 4试剂，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，在40 °C孵育15分钟。重复步骤5.3–5.4，每次洗涤2分钟。
  9. 在玻片上滴加商品化的AMP 5试剂，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，在40 °C孵育30分钟。重复步骤5.3–5.4，每次洗涤2分钟。
  10. 在玻片上滴加商品化的AMP 6试剂，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，在40 °C孵育15分钟。重复步骤5.3–5.4，每次洗涤2分钟。
  11. 检测前，用1x TBS-Tween 20（0.05% v/v）冲洗玻片一次。从洗涤缓冲液中取出玻片，冲洗后轻拍或弹动玻片，去除组织切片上多余的洗涤缓冲液。立即放入盛有1x TBS-Tween缓冲液的染色缸中。

6. 通道1（C1）靶信号检测

注意：本步骤使用双重检测试剂盒中的红色碱性磷酸酶与快速红底物显色系统6（见材料表），该系统包含碱性磷酸酶标记物及比色检测组分，以快速红为底物产生红色信号。

  1. 使用 Fast RED-B 与 Fast RED-A 按 1:60 的比例配制快红（FR）工作液。充分混匀。为减少沉淀并获得更清晰的信号，使用注射器将显色液通过 0.45 µm 的 MCE 膜过滤。
    注意：Fast RED-B 溶液需在 5 分钟内使用。避免暴露于直射阳光或紫外光下。
  2. 从 TBS-Tween 中取出玻片，冲洗后轻拍或甩动玻片，以去除组织切片上的多余缓冲液。
  3. 将混合并过滤后的 FR 溶液滴加至每张组织切片上，确保每个切片完全覆盖。室温孵育 6–8 分钟，并在显微镜下观察。
  4. 将玻片在 0.5× 洗涤缓冲液中清洗 2 次。从洗涤缓冲液中取出玻片，冲洗后轻拍或甩动，以去除组织切片上的多余洗涤缓冲液。
  5. 滴加商品化的 AMP 7，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，40 °C 孵育 10 分钟。重复步骤 5.3–5.4，每次洗涤 2 分钟。
  6. 滴加商品化的 AMP 8，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，40 °C 孵育 15 分钟。重复步骤 5.3–5.4，每次洗涤 2 分钟。
  7. 滴加商品化的 AMP 9，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，40 °C 孵育 30 分钟。重复步骤 5.3–5.4，每次洗涤 2 分钟。
  8. 滴加商品化的 AMP 10，确保组织切片完全覆盖且无气泡。将玻片置于湿盒中，40 °C 孵育 30 分钟。重复步骤 5.3–5.4，每次洗涤 2 分钟。

7. 通道2（C2）靶信号检测

注意：本步骤使用市售的棕色 HRP 和 DAB 染色原试剂盒进行（参见材料表）。2-重检测中的放大信号10含有辣根过氧化物酶标记物，通过 DAB 进行显色检测，产生棕色信号。

  1. 为了最佳检测 DAB 信号，请使用市售试剂盒并遵循制造商的说明（参见材料表）。在显微镜下观察。
    注意：DAB 具有毒性。操作和处置该化学品时应遵循适当的安全预防措施和指导原则。

8. 复染与封片

  1. 用苏木精对切片进行复染。
    1. 在振荡条件下，用50%新鲜过滤的苏木精对切片复染30秒。切片将呈现紫色。立即在流水下振荡上下冲洗切片，直至水流清澈。组织切片将保持紫色。
    2. 为获得更好的对比度，将复染后的切片置于经碳酸锂饱和的蒸馏水中1分钟。在流水下彻底冲洗至少3次，同时振荡切片。最后用重蒸水冲洗。
    3. 由于FR对有机溶剂敏感，经FR染色的切片需使用水性封片剂封片，并在室温下过夜干燥。
  2. 封片。
    1. 确保覆盖水性封片剂的组织切片已完全干燥。
    2. 使用封片试剂前，先将切片浸入二甲苯中。务必防止或去除盖玻片与组织切片之间的任何气泡，并在室温下静置干燥16小时。

9. 使用 CellProfiler 进行 RNAscope 定量图像分析的方案5

  1. 简要而言，确保软件能将苏木精染色与FR染色分离为独立的图像。识别并测量感兴趣的对象：细胞核、病毒颗粒、阳性细胞以及FR阳性聚集染色。将测量结果存储于CSV文件中，并保存已分析的图像。
  2. 选择"解混颜色"选项，该功能可分离染色，将原始感兴趣区域（ROI）拆分为独立的苏木精和FR图像。
  3. 若含铁血黄素、纹身或其他类似特征干扰分析，可添加第二个"解混"步骤，包含苏木精、FR和DAB。使用第二个FR图像找出最强的FR像素。此第二图像将作为真实FR染色的掩模。
  4. 可选地，在设定阈值前对染色图像进行平滑处理。这是一个经验性决定，并非总是必要。使用"IdentifyPrimaryObjects"对单个染色图像设定阈值，以选择阳性像素。
  5. 识别三种不同类型的对象（病毒颗粒、病毒颗粒聚集体、产毒细胞）。
    1. 确保细胞核为经苏木精染色、直径4–100像素（px）的对象。在设定阈值后进行去团块化并填充空洞。"IntenseFastRed"对象直径为4–100 px，包括病毒颗粒、阳性细胞以及聚集性阳性染色，例如B细胞滤泡（BCF）中滤泡树突状细胞（FDCs）上所见。该图像用于滤除假阳性（如含铁血黄素）。
    2. 确保FR小阳性对象为直径2–12 px的结构。该测量包括病毒颗粒和vDNA+细胞。剔除超出此范围的任何对象。在设定阈值后进行去团块化并填充空洞。
    3. 确保FR大阳性对象为直径9–100 px的结构。该测量包括vRNA+阳性细胞和聚集性阳性染色。在设定阈值后进行去团块化。小和大FR阳性对象的尺寸可能存在重叠，将在后续步骤中加以区分。
      注：软件（如CellProfiler）使用像素作为对象尺寸单位，此处所用参数基于以0.2510 µm/像素（40倍）扫描的切片。
  6. 定义并提取结果。
    1. 在识别出所有对象后，定义并提取病毒颗粒数量、产毒感染细胞数量及细胞核数量的结果。
    2. 通过使用IntenseFastRed对象集对FastRedSmallPositives进行掩模，识别病毒颗粒，以去除假阳性（如含铁血黄素）。
    3. 接下来，识别阳性细胞和聚集性FR阳性染色。通过使用IntenseFastRed和病毒颗粒对象集进行掩模，从FastRedLargePositives中去除假阳性和病毒颗粒。
    4. 通过再次使用Nuclei进行掩模，从优化后的FastRedLargePositives中提取阳性细胞。将不再接触的对象进行分离，并按对象面积过滤结果，剔除小对象（≤6 px）。这可消除因掩模核重叠而产生的斑点。最终结果即为阳性细胞。
    5. 最后，定义聚集性FR阳性对象。此步骤使用IdentifyTertiaryObjects，用于识别包含在较大父对象内的对象。在此情况下，优化后的FastRedLargePositives对象集为父对象，减去阳性细胞。
  7. 统计病毒颗粒和阳性细胞的数量。
  8. 测量聚集性阳性区域，并将其从像素转换为mm2。可选地，若分析需采用标准细胞和病毒颗粒尺寸而非直接计数，可记录病毒颗粒和阳性细胞所占面积（mm2）。
  9. 将阳性对象叠加至原始图像上，并保存结果。
    注：原位杂交（ISH）数据通常以每106个细胞核（细胞）中的病毒颗粒数和每106个细胞核（细胞）中产毒感染的vRNA+细胞数来报告，以便更好地理解并与qPCR数据进行比较；但结果也可按组织面积（mm2）报告。

结果

在之前的一篇手稿2,6,7,8,9,10,11中，我们报道了可将用于检测vRNA或vDNA的下一代原位杂交（ISH）平台联合使用，其中采用针对SIV/HIV基因组5'端gag-pol区域的正义探针（vDNA），以及针对基因组3'半区基因（vif、vpx、vpr、tat、env和nef）和5'基因组中TAR元件的反义探针（vRNA）（表1）。该方法可在同一组织切片中区分转录活性细胞（vRNA+，vDNA+）与转录非活性（推测为潜伏感染）的感染细胞或携带转录失活前病毒的细胞（vRNA-，vDNA+）2（图1）。

SIV 病毒RNA和病毒DNA检测，显微图像，细胞样本中的病毒分析。
图1：同一组织切片中病毒RNA和病毒DNA的检测。 在急性SIV感染的恒河猴淋巴结中，联合使用RNA杂交（红色）和DNA杂交（棕色）检测方法，展示了在同一组织切片中同时检测病毒RNA（vRNA）和病毒DNA（vDNA）的能力，为原位识别转录沉默的vDNA+ vRNA-细胞提供了强有力的技术手段。该图改编自 Deleage C. 等人2。 请点击此处查看此图的放大版本。

单重 RNA/DNAscope 探针组
名称ACD 目录编号ZZ 数量描述
SIVmac239 (反义链)31281183靶向 D01065.1 的 1251-9420 bp 区域（gag、pol、vif、vpx、vpr、tat、env 和 nef）的反义链探针
SIVmac239 (正义链)31407183靶向 D01065.1 的 1251-9420 bp 区域（gag、pol、vif、vpx、vpr、tat、env 和 nef）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade A (反义链)41610180靶向 HIV-1 A 亚型共识序列 879-7629 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）的反义链探针
V-HIV1-Clade A (正义链)42634180靶向 HIV-1 A 亚型共识序列 879-7629 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade B (反义链)41611178靶向 AF324493.2、HIV-1 B 亚型 NL4-3 的 854-8291 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）的反义链探针
V-HIV1-Clade B (正义链)42553178靶向 AF324493.2、HIV-1 B 亚型 NL4-3 的 854-8291 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade D (反义链)41612176靶向 HIV-1 D 亚型共识序列 894-7697 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env、nef）的反义链探针
V-HIV1-Clade D (正义链)42635176靶向 HIV-1 D 亚型共识序列 894-7697 bp 区域（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env、nef）反向互补链的正义链探针
多重 RNA/DNAscope 探针组
名称ACD 目录编号ZZ 数量描述
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1416141-C140靶向 D01065.1 的 1251-4093 bp 区域（gag 和 pol）反向互补链的正义链探针
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (反义链)416131-C247靶向 D01065.1 的 5381-10257 bp 区域（vif、vpx、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）的反义链探针
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1444051-C140靶向 AF324493.2、HIV-1 B 亚型 NL4-3 的 854-3940 bp 区域（gag 和 pol）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (反义链)444061-C240靶向 AF324493.2、HIV-1 B 亚型 NL4-3 的 5042-9673 bp 区域（vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）的反义链探针
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1444021-C148靶向 HIV-1 C 亚型共识序列 888-5032 bp 区域（gag 和 pol）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (反义链)444041-C249靶向 HIV-1 C 亚型共识序列 5078-9698 bp 区域（vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）的反义链探针
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1444011-C155靶向 AF259954.1、HIV-1 AE 亚型的 890-4812 bp 区域（gag 和 pol）反向互补链的正义链探针
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (反义链)444031-C257靶向 AF259954.1、HIV-1 AE 亚型的 5052-9694 bp 区域（vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）的反义链探针

表1：靶向HIV-1和SIV的病毒RNA与病毒DNA的探针列表。

讨论

原位杂交是一种精细的实验技术，需要严谨的操作以及对核酸化学、细胞生物学和组织学的基础知识，才能针对每个关键步骤进行调整，以在高度保存的环境中准确定位目标分子。在本讨论中，我们将重点强调那些对获得准确且可解释结果至关重要的、需要进行故障排查的关键步骤。

组织的固定和处理至关重要，应在实验初期就予以充分考虑，以确保检测能够获得最佳结果。中性缓冲的PFA（4%新鲜配制）固定液最适合用于双重检测。然而，在适当的冷冻切片后固定条件下，该检测也可用于冷冻组织（OCT包埋）。

组织切片的预处理是一个关键步骤。本实验包含两个预处理步骤：第一步是热诱导表位修复（HIER）。该步骤对于逆转亚甲基交联并恢复固定组织中的蛋白质结构至关重要。该处理的效果取决于时间、温度、修复缓冲液的类型和pH值。第二步是蛋白酶诱导表位修复（PIER）。该步骤通过蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶切割肽链，暴露抗原或核苷酸。这是一个极为敏感的步骤，可能对组织形态和目标分子造成损伤。酶的浓度以及孵育的时间和温度在此过程中至关重要。过度消化会导致细胞核边界不清，给定量分析带来困难。因此，必须在实现RNA/DNA靶标最佳可及性与避免损伤组织或目标分子的预处理条件之间找到平衡。不同类型的组织对这些预处理步骤及各参数（酶浓度、时间、温度）的敏感性各不相同，需通过实验逐一优化。

洗涤缓冲液的严谨性取决于三个主要参数：温度、盐和去污剂的浓度以及洗涤时间。洗涤缓冲液为氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC），缓冲液中的盐浓度控制着洗涤步骤的严谨性。在ACD的实验方案中，建议使用终浓度为0.1x SSC、0.03%十二烷基硫酸锂的洗涤缓冲液。然而，在进行DNAscope和多重优化实验时，我们发现将洗涤缓冲液的终浓度调整为0.05x SSC时，能够更清晰地观察到DNA信号，并显著减少由于正义探针过夜孵育所导致的非特异性非靶标杂交。

在开始实验之前，应根据组织类型和实验目的仔细考虑检测方法的选择，即显色法（红色或棕色）与荧光法。红色显色法可提供良好的对比度，因为红色在组织中并不存在天然类似物。棕色显色法的结果与红色显色法相似。然而需要注意的是，某些存在于组织中的血液降解产物颜色与棕色相近，且在定量分析时难以将纹身墨水信号与棕色信号区分开来。荧光检测方法则能够清晰区分不同的细胞标志物，多重检测可为携带病毒RNA和/或病毒DNA的细胞表型分析提供理想的实验方案。

必须设置多个对照以确保探针的特异性和检测的质量。每个新设计的探针都必须在已知的阳性与阴性对照组织或细胞沉淀物上进行测试。我们通常构建包含目标序列的质粒，并将其转染至细胞系中以制备阳性对照。每次实验运行时，我们均加入已知的阴性组织（HIV 或 SIV 阴性）、仅含探针稀释液的无探针对照，以及经 RNase 处理的对照，以确保检测的质量与特异性。

定量分析是一个极为重要的步骤，应根据所提出的问题，使用适当的工具和算法进行。在本文中，我们介绍了一种图像分析软件（例如，Cellprofiler），该软件是在评估了多种选择之后确定的。我们评估认为，该软件最符合我们的需求，但目前存在多种可用于图像分析的软件程序。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目全部由联邦资金资助，资金来自美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院，合同编号为 HHSN261200800001E，以及俄勒冈国家灵长类动物研究中心 NIH 拨款 P51OD011092（J.D.E）。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部的观点或政策，提及商品名、商业产品或组织并不意味着美国政府的认可。该双链分子的开发得到了 Advanced Cell Diagnostics 公司的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACD HybEZII 杂交系统（110V）配 ACD EZ-Batch 载玻片系统ACD321710杂交炉
CAT 苏木精Biocare MedicalCATHE-GAL染色剂
Clear-MountElectron Microscopy Sciences17985-15红色显色剂封片试剂
Immpact DAB 过氧化物酶试剂盒VectorSK-4105用于显示 HRP-DAB（棕色），以替代 ACD 试剂盒中的 DAB
碳酸锂Fisher ChemicalL119-500蓝化液
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15714-S用于组织固定（4%）
PBSLife Technology14190-136
Permount 封片介质ThermoFisher ScientificSP15-100棕色显色剂封片试剂
Prolong GoldThermoFisher ScientificP36930荧光封片试剂
核糖核酸酶 AThermoFisher Scientific12091039用于 DNAscope 方案中的 RNase 处理
核糖核酸酶 T1RocheR1003用于 DNAscope 方案中的 RNase 处理
RNAscope 2.5 二重检测试剂盒ACD322430棕色与红色显色试剂检测系统
RNAscope 靶标修复试剂ACD322000修复缓冲液
SuperFrost Plus 玻片ThermoFisher Scientific12-550-17
TBSBoston BioProductsBM-301-4L用于洗涤
TSA Plus 荧光调色板试剂盒（Cy3、Cy5、TMR、荧光素）PerkinElmerNEL760001KTHRP 荧光检测
吐温 20SigmaP1379-1L用于洗涤
二甲苯 20LThermoFisher ScientificAC422680200

参考文献

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnosis. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Deleage, C., et al. Defining HIV and SIV Reservoirs in Lymphoid Tissues. Pathogens and Immunity. 1 (1), 68-106 (2016).
  3. Sengupta, S., Siliciano, R. F. Targeting the Latent Reservoir for HIV-1. Immunity. 48 (5), 872-895 (2018).
  4. Churchill, M. J., Deeks, S. G., Margolis, D. M., Siliciano, R. F., Swanstrom, R. HIV reservoirs: what, where and how to target them. Nature Reviews Microbiology. 14 (1), 55-60 (2016).
  5. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), e2005970(2018).
  6. Deleage, C., Chan, C. N., Busman-Sahay, K., Estes, J. D. Next-generation in situ hybridization approaches to define and quantify HIV and SIV reservoirs in tissue microenvironments. Retrovirology. 15 (1), 4(2018).
  7. Deleage, C., Turkbey, B., Estes, J. D. Imaging lymphoid tissues in nonhuman primates to understand SIV pathogenesis and persistence. Current Opinion in Virology. 19, 77-84 (2016).
  8. Estes, J. D., et al. Defining total-body AIDS-virus burden with implications for curative strategies. Nature Medicine. 23 (11), 1271-1276 (2017).
  9. Mavigner, M., et al. Simian Immunodeficiency Virus Persistence in Cellular and Anatomic Reservoirs in Antiretroviral Therapy-Suppressed Infant Rhesus Macaques. Journal of Virology. 92 (18), (2018).
  10. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogen. 14 (4), e1006956(2018).
  11. Deleage, C., et al. Impact of early cART in the gut during acute HIV infection. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (10), e87065(2016).

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