本方案旨在使整个科学界在深共熔体系的制备过程中实现标准化，以便这些体系能够被重复制备。
本文内容
摘要
摘要
深共熔体系（DES）的制备 先验的 一种简单的操作。根据定义，将两种或多种组分按特定摩尔比混合即可形成低共熔溶剂（DES）。然而，基于我们在实验室的经验，有必要对制备、表征及报告不同研究人员所采用方法的流程进行标准化，以确保已发表的结果具有可重复性。在本研究中，我们测试了文献中报道的多种制备低共熔体系的方法，并评估了水在成功制备室温液态体系过程中的重要性。这些已发表的低共熔体系由柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、苹果酸、β-丙氨酸、L-酒石酸和甜菜碱组成，但并非所有描述的制备方法均可被重复。然而，在某些情况下，通过将水作为低共熔混合物的第三组分加入，可以成功重现所描述的体系。
引言
低共熔溶剂被誉为21世纪的溶剂，被认为是新一代溶剂。它们被定义为两种或多种化学物质在特定摩尔比下形成的混合物，导致各组分的熔点显著降低，从而在室温下呈液态1,2,3。从这一意义上讲，这类溶剂的制备无需任何化学反应，因此产率可达100%。2011年，Choi及其同事首次报道了自然界中存在此类低共熔溶剂的可能性，并将其命名为天然低共熔溶剂（NADES）3,4,5。NADES可通过糖类、氨基酸、有机酸和胆碱衍生物的不同组合制备；由天然组分构成的这些体系本质上具有生物相容性和可生物降解性，相较于其他替代溶剂（如离子液体），其毒性显著更低5,6,7,8。自2015年以来，该领域的出版物数量呈指数级增长，NADES的潜在应用范围极为广泛3。尽管已有大量研究论文和综述发表，但仍存在一些尚未解决的基本问题，例如科学家尚未阐明低共熔溶剂形成的内在机制。深入理解低共熔溶剂的形成机制将有助于建立系统化的新体系开发方法，而非目前依赖试错的策略。此外，随着消费者对产品可持续性的关注度日益提高——不仅关注产品生命周期末端的影响，也关注其加工过程本身——该领域的发展机遇正与日俱增8,9,10。为了推动低共熔溶剂领域的重大创新，首先需要实现其制备与表征方法的标准化。文献中部分体系缺乏可重复性，正是这一问题促使我们开展本项工作，因为我们已多次遇到此类情况。本文中，我们强调准确描述材料与方法的必要性及其关键重要性，并表明尽管低共熔溶剂的制备过程简单直接，但仍有一些关键因素（如水的存在与否及其含量）必须始终予以讨论。
方案
注意：所研究的低共熔溶剂（NADES）包括甜菜碱：L-(+)-酒石酸（2:1）、β-丙氨酸：DL-苹果酸（3:2）、葡萄糖：蔗糖（1:1）以及柠檬酸：葡萄糖（2:1）。这些体系通过不同的方法制备：冷冻干燥（FD）、真空蒸发（VE）以及加热搅拌（HS），后两者有或无水存在。以柠檬酸：葡萄糖（2:1）体系为例提供实验方案。采用差示扫描量热法（DSC）、偏光光学显微镜（POM）、水分含量测定和核磁共振（NMR）波谱法对NADES进行表征。
1. NADES 的制备
- 冷冻干燥
- 在不同的容器中，分别加入 2 g 一水柠檬酸和 0.9530 g 一水葡萄糖。向每种容器中加入 10 mL 去离子水，搅拌至化合物完全溶解。
- 将两种溶液混合，并确保最终溶液均匀。将溶液置于圆底烧瓶中。
- 使用液氮进行冷冻，然后将烧瓶放入冷冻干燥机中干燥 48 小时，以确保样品中的水分完全去除。
- 真空蒸发
- 在不同的容器中，分别称取 2 g 一水柠檬酸和 0.9530 g 一水葡萄糖。向每种容器中加入 10 mL 去离子水，搅拌至化合物完全溶解。
- 将两种溶液混合，并确保溶液均匀。将溶液置于圆底烧瓶中。
- 使用旋转蒸发仪干燥样品，直至形成透明且黏稠的液体。
- 加热与搅拌
- 在同一小瓶中称取 2 g 一水柠檬酸和 0.9530 g 一水葡萄糖，加入 278 μL 水。
- 将装有磁力搅拌子的小瓶置于 50 °C 水浴中。
- 静置样品，直至形成透明且黏稠的液体。
2. NADES 表征
- 偏光光学显微镜（POM）
- 将一滴NADES置于显微镜载玻片上以供观察。
- 使用显微镜的透射模式，在室温下对样品进行光学表征。
- 卡尔·费休滴定（Karl-Fisher titration）
- 用注射器吸取100 μL NADES，然后擦去外壁多余的液体。
- 将注射器放在天平上归零去皮。
- 按下KF仪器上的START按钮，向滴定容器中加入少量样品液滴。
- 称量注射器质量，将质量数值输入KF仪器并按下ENTER。结果将以ppm（水含量）形式显示在屏幕上。
- 差示扫描量热法（DSC）
- 取每种样品3–10 mg，放入带盖的密封铝坩埚中，使用压样器将坩埚压紧密封。
- 使用DSC对样品进行分析，温度范围为-90 °C至降解温度，升温速率为10 °C/min。进行两个循环，每个循环包含2分钟的等温保持，并在氮气氛围（50 mL/min）下进行分析。
- 核磁共振（NMR）
- 制备5 mm NMR样品管：将250 µL NADES溶解于250 µL二甲基亚砜-d6（DMSO-d6）中。
- 在400 MHz波谱仪上，于25 °C条件下采集1H和NOESY谱图。
- 使用适当的软件分析谱图，并以DMSO-d6的化学位移（δ 2.50 ppm）为参考，对各组分的所有信号进行归属。
结果
从NADES的制备过程来看，我们预期获得的结果如图1所示。以下是对每个系统的描述。采用冷冻干燥方法时，由于体系中的所有水分均被去除，所得结果应为固体或非常致密的膏状物；采用蒸发方法时，结果应为澄清且黏稠的液体；采用加热搅拌并添加少量水的方法时，结果应为澄清且极为黏稠的液体。
从偏光显微镜（POM）获得的结果如图1所示。当NADES完全形成时，我们预期看到黑色图像，表明样品完全为非晶态，体系中无任何晶体残留。卡尔·费休滴定（KF滴定）所得结果见Table 2。除了向体系中添加的水量外，最终混合物的含水量百分比还取决于试剂本身的水分含量。
关于DSC，该技术的目的同样是确认体系在其应用温度范围内呈液态，因此预期结果是在目标温度范围内热谱图不显示任何热事件（表2）。核磁共振（NMR）技术用于确认氢键形成的存在，这是NADES体系的主要特征。可通过观察各信号化学位移的变化以及NOESY谱图的分析来证实这一点，后者可显示空间和分子间相关性（图2）。
| 组分 1 | 组分 2 | 制备方法 | 参考文献 |
| Betaine (Bet) | L-(+)-Tartaric Acid (LTA) | 真空蒸发 (VE) | Dai et al. (2013)5 和 Espino et al. (2016)6 |
| β-Alanine (β-A) | DL-Malic Acid (MA) | 真空蒸发 (VE) | Dai et al. (2013)5 和 Espino et al. (2016)6 |
| Glucose (Gluc) | Sucrose (Suc) | 冷冻干燥 (FD) | Choi et al. (2011)4 和 Espino et al. (2016)6 |
| Citric Acid (CA) | Glucose (Gluc) | 冷冻干燥 (FD) | Choi et al. (2011)4 和 Espino et al. (2016)6 |
表1： 文献中报道的系统及其制备方法。
| NADES | 制备方法 | 含水量 (%) |
| 卡尔·费休法测定 | ||
| Bet:LTA (2:1 + 20% water) | 加热搅拌并加水 | 19.94 ± 1.28 |
| Bet:LTA (2:1) | 真空蒸发 | 11.36 ± 0.78 |
| β-A:MA (3:2 + 11% water) | 加热搅拌并加水 | 11.45 ± 0.25 |
| β-A:MA (3:2) | 真空蒸发 | 18.84 ± 1.78 |
| Gluc:Suc (1:1 + 21% water) | 加热搅拌并加水 | 20.88 ± 0.13 |
| Gluc:Suc (1:1) | 真空蒸发 | 22.56 ± 0.48 |
| CA:Gluc (2:1 + 17% water) | 加热搅拌并加水 | 17.33 ± 0.68 |
| CA:Gluc (2:1) | 真空蒸发 | 20.04 ± 0.26 |
表2：不同制备方法所得体系的含水量（%）。
图1：通过 a) 冷冻干燥、b) 真空蒸发和 c) 加热搅拌并加水方法制备的NADES的代表性结果。图片显示，当体系采用冷冻干燥时，由于混合物中的所有水分均被去除，所得产物为晶体；而当采用真空蒸发（VE）和加热搅拌（HS）方法时，体系中仍保留形成NADES所需的水量，因此在室温下得到均匀的液体产物。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：采用不同方法制备的 CA:Glu (2:1) 在交叉偏振器（左图）和平行偏振器（右图）下的偏光显微镜图像 – 100 μm（10倍放大）。 黑色图像表明样品在室温下为液态。FD 样品已完全结晶，因为该技术检测结果显示其非液态。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：a) NADES体系柠檬酸:葡萄糖:水（2:1:4）(A)、葡萄糖(B)和柠檬酸(C)的1H NMR谱图叠加；b) NADES体系柠檬酸:葡萄糖:水（2:1:4）的NOESY谱图。叠加谱图显示了各组分在形成低共熔溶剂（DES）时化学位移的变化，这是由于组分之间形成了氢键所致。NOESY谱图显示了柠檬酸中的OH质子与两个组分中其余质子之间的相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
文献中报道的制备NADES的不同方法包括加热搅拌法（HS）、真空蒸发法（VE）和冷冻干燥法（FD）。本研究中所制备的体系在文献中已有不同作者进行描述4,5,6,10,11。表1列出了各混合物的组分，这些信息来自原始文献，并包括其制备方法。
在尝试重复文中所述体系的过程中，我们发现，在某些情况下无法在室温下获得类似天然深共熔溶剂（NADES）的澄清、黏稠液体样品。制备NADES依赖于多种因素，其中一些因素易于控制，而另一些则较难标准化。最重要的是，最终产物不应依赖于所用设备等外部条件。
采用不同方法制备的体系随后进行了表征。通过偏光光学显微镜（POM）观察发现，使用不含水的加热搅拌（HS）方法时，即使在不同温度下，天然深共熔溶剂（NADES）也未形成清晰且粘稠的液体。然而，如图1所示，当采用添加少量水的加热搅拌法以及真空蒸发（VE）法来制备NADES时，观察到了均匀、透明且粘稠的液体。
采用差示扫描量热法（DSC）测定混合物的热事件。结果表明，该体系在室温至130 °C范围内呈液态，因为热谱图未显示任何热事件。各样品的含水量通过卡尔·费休滴定法测定，结果如表2所示。必须报告体系的含水量，因为该参数对所获得液体的性质（如黏度和极性）影响最大。这些变化对NADES设计应用的最终效果具有重要影响。
核磁共振（NMR）还被用于通过各体系分子间氢键的形成来确认上述低共熔溶剂（NADES）体系的形成。例如，在通过加热搅拌（HS）法制备的含17%水的柠檬酸:葡萄糖（2:1）NADES体系中，图2展示了该NADES及其起始原料（柠檬酸和葡萄糖）的质子谱叠加图（图2a）。由此可以观察到各分子中某些质子化学位移的变化。其中最显著的变化是柠檬酸中OH质子的位移。该信号原本出现在5.16 ppm处，但由于氢键的形成，其位移至6.22 ppm。这一结果在NOESY谱图（图2b）中得到进一步证实，图中可清晰看到柠檬酸的OH质子与其他质子之间存在强烈的相互作用。在其他NADES体系中也观察到了类似的相互作用。
本研究中我们观察到，文献中报道的低共熔体系制备方法描述有时并不完整，原因在于大多数体系的含水量信息缺失。在VE方法中，通过配制不同组分的溶液并在一定温度下混合来添加水分，从而促使低共熔体系的形成；然而，我们无法确定所需的最低含水量。因此，形成体系所需水的百分比被视为一个关键参数，应在报道中始终明确说明，以便他人能够重复制备不同的低共熔混合物。
最佳方法是使用加水的 HS 法，因为其制备时间较短，适用于水含量已有明确描述的情况。然而，如果该信息不可获得，则最简便的方法是 VE 法，该方法可去除所有可利用的水，仅保留与 NADES 组分相互作用的水。无论采用何种方法，研究人员都应让体系蒸发足够长的时间，以确保体系中的游离水被完全去除。该时间取决于所用设备，因此仅在材料部分描述 VE 法的持续时间是不够的，必须始终报告水含量。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助，资助协议编号为ERC-2016-CoG 725034。本工作还得到了绿色化学联合实验室（LAQV）的支持，该实验室由FCT/MCTES的国家资金（UID/QUI/50006/2019）以及通过CryoDES项目（PTDC/EQU-EQU/29851/2017）由FCT/MCTES资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mm NMR 管 | Norell | ||
| 一水柠檬酸 | Sigma-Aldrich | ||
| Advance III 核磁共振波谱仪 | Bruker | ||
| 去离子水 | |||
| 二甲基亚砜-d6 | Sigma-Aldrich | ||
| DSC Q200 | TA Instruments, USA | ||
| CHRIST ALPHA 1-4 冷冻干燥机 | Braun Biotec International | ||
| 一水葡萄糖 | Cmd chemicals | ||
| 卡尔·费休库仑滴定仪 | Metrohm | ||
| Olympus BX-51 偏光显微镜 | Olympus |
参考文献
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