在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学

摘要

细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。

摘要

人类胚胎干细胞通过细胞命运规范的自组织模式，在胚胎形成过程中与原发生殖层形成相对应，表现出独特的能力，对体外形态作出反应。因此，这些细胞是一个强大的工具，用以检查推动早期人类发展的机制。我们开发了一种方法，在符合要求的基质的密闭菌落体中培养人类胚胎干细胞，以控制菌落的几何及其机械环境，以便重新概括物理参数，胚胎发生的基础。该方法的主要特点是能够生成具有定义细胞外基质配体的形态的聚丙烯酰胺水凝胶，以促进细胞附着。这是通过制造具有所需几何图案的模具，使用这些模具在玻璃盖玻片上创建细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶中来实现的。该方法还与牵引力显微镜兼容，允许用户测量和绘制在密闭菌落区内细胞生成力的分布图。结合标准生化测定，这些测量可用于检查机械线索在早期人类发展过程中的命运规范和形态形成中的作用。

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有很大的应用前景。这些细胞的多能性质使它们能够分化成任何成人细胞类型。虽然在将hESCs的命运引向特定细胞类型方面已经取得巨大进展，但仍然很难产生整个组织或器官，^{即第1、2、3、4， 5}.这在很大程度上是由于对在人类发展期间推动这些组织形成的机制了解有限。为了填补这一知识空白，近年来出现了一些方法，用胚胎^{干细胞6、7、8、9}对早期胚胎及其发育阶段进行建模。 ^{，10，11，12，13}.

在第一个hESC^线14的产生后不久，证明由hESC形成的胚胎体能够自发地产生三个初级生殖^层6的细胞。然而，由于对胚胎体的大小和形态固有的缺乏控制，生殖层组织差异很大，无法与早期胚胎的组织相匹配。最近，Warmflash等人开发了一种通过微模式将hESC的菌落限制在玻璃基板上的方法，从而对菌^落8的大小和几何体提供控制和一致性。在BMP4（早期发育中的重要形态原）的存在下，这些受限菌落能够自组织地对代表主要生殖层的命运进行可重复的规格模式。虽然这为研究原始生殖层的建立机制提供了一个有用的模型，但命运规范的模式与^{胚胎发生过程中}观察到的组织和形态形成不完全匹配。通过将hESCs嵌入母^体11的三维细胞外基质（ECM）实现对早期胚胎发育的更忠实的回顾，为hESC自我组织和建模的能力提供了迄今为止最有力的证据胚胎形成的早期外体。但是，此方法会产生不一致的结果，因此与可用于揭示自组织和命运规范的基本机制的一些检测不兼容。

鉴于这些现有方法和各自的局限性，我们寻求开发一种方法，在模拟早期胚胎细胞外环境的条件下，对已定义的几何体的hESC菌落进行可重复的培养。为此，我们使用可调弹性的聚丙烯酰胺水凝胶来控制基材的机械性能。利用原子力显微镜对胃化阶段的鸡胚胎，我们发现表粒的弹性范围从几百帕斯卡到几千帕斯卡不等。因此，我们专注于生产具有弹性的聚丙烯酰胺水凝胶，作为hESC菌落的基质。我们修改了我们以前在聚丙烯酰胺水^凝胶7、9上培养hESCs^的方法，以对菌落的几何结构进行强有力的控制。我们通过首先将ECM配体（即母体凝胶）图案通过微制模具在玻璃盖上实现，如之前报道^的16。然后，我们设计了一种新技术，在聚合过程中将图案配体转移到聚丙烯酰胺水凝胶的表面。我们在这里描述的方法包括使用光刻法来制造具有所需几何图案的硅晶片，用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 创建这些几何特征的图章，并使用这些图章生成模具，最终允许配体图案到玻璃盖玻片表面，并转移到聚丙烯酰胺。

除了重述早期胚胎的机械环境外，将hESC菌落限制在聚丙烯酰胺上，还能用牵引力显微镜（TFM）测量细胞产生的力，如我们之前^的方法9所述。简而言之，荧光珠可以嵌入聚丙烯酰胺，并用作基准标记。通过将 hESCs 播种到图案基板上后，通过成像这些磁珠的位移来计算细胞生成的力。此外，生成的牵引力图可与传统测定（如免疫染色）相结合，以检查在密闭的 hESC 菌落中细胞生成力的分布如何调节或调节下游信号。我们期望这些方法将揭示，机械力在细胞命运规范的模式设计中起着关键作用，而目前这种发育是被忽视的。

方案

此处描述的所有与使用 hESCs 相关的方法均已获得加州大学旧金山分校人类游戏、胚胎和干细胞研究 （GESCR） 委员会的批准。

1. 具有几何特征的硅晶圆的制备

1. 创建具有所需几何特征的照片蒙版。使用计算机辅助绘图软件设计功能。对于负光刻，使特征不透明，蒙版的其余部分透明。
   注:对于在 18 mm 直径盖玻片上进行图案化，将每个实验条件的特征组合到 10 x 10 mm 区域，以确保步骤 3 中生成的模具适合盖玻片。
2. 在 100 mm 硅晶片上旋转涂层负光刻胶。使用光刻胶数据表确定旋转的速度和长度，以生成 100-250 μm 的胶片厚度。
   注: 应调整胶片厚度，使图案宽度与模具高度的纵横比尽可能接近 1:1。但是，我们建议最小厚度为 100 μm，因为任何较少的模具都会产生易撕裂的精致模具。
3. 根据产品数据表处理光刻胶。这通常涉及软烘烤、带光掩膜的外光照射、曝光后烘烤、发育和硬烘烤。例如，表1概述了用于处理该协议中使用的晶圆的过程。
   注意:处理硅片时要小心，因为它们是脆弱的。一旦生成，晶圆可以重复使用，只要它们不损坏。

2. 准备盖玻片

1. 酸洗"顶"盖玻片的制备
   1. 将直径18毫米#1厚度盖片放入玻璃培养皿中。适当的盖玻片数量取决于菜的大小。对于 100 mm 的盘子，一次准备 50-100 个盖玻片。通过本节其余部分给出的体积量对应于 100 mm 的盘。
   2. 将 20 mL 的 1 M HCl 添加到培养皿中，轻轻摇动盘子以分散盖玻片。确保所有盖玻片都浸没，并从盖玻片之间释放气泡。在室温下孵育过夜，轻轻摇动。
      注意:HCl 是酸性和腐蚀性的。使用 HCl 时，请小心谨慎并佩戴适当的个人防护装备。
   3. 从菜的德坎特HCl。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
   4. 丢弃最终洗涤后，向盘子中加入 20 mL 的 100% 乙醇。使用钳子，分别拆下盖玻片，并在两片滤纸之间排列以干燥。
   5. 将干燥的盖玻片存放在密封的容器中。酸洗盖玻片可以提前准备，并在无尘条件下储存一个月或更长时间。
2. 谷醛活性"底"盖玻片的制备
   注:有关其他详细信息^7，9，请参阅前面的方法。
   1. 将直径为 18 mm #1厚度盖片放入培养皿中。
   2. 将 20 mL 的 0.2 M HCl 添加到培养皿中，轻轻摇动盘子以分散盖玻片。确保所有盖玻片都浸没，并从盖玻片之间释放气泡。在室温下孵育过夜，轻轻摇动。
   3. 从菜的德坎特HCl。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
   4. 丢弃最终洗涤后，加入 20 mL 的 0.1 M NaOH，轻轻摇动以分散和浸入盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时。
   5. 从菜的德坦·纳奥。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
   6. 丢弃最后洗涤后，在超纯水中加入 20 mL 的 1:200 稀释 3-氨基丙烯氧氧烷，轻轻摇动以分散和浸没盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时或过夜。
      注意:3-氨基丙烯是易燃的，可能导致皮肤刺激。小心处理，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地处置法规丢弃废物。
   7. 从盘中稀释的3-氨基丙烯氧硅溶液。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动10分钟。弃水，重复至少5次洗涤。在继续之前，清除所有三氨基丙烯酸酯至关重要。
   8. 丢弃最后洗涤液后，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中加入 1:140 稀释 70% 谷醛的 20 mL，轻轻摇动以分散和浸没盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时或过夜。
      注意:70%的谷醛是有毒的，可能导致皮肤刺激。小心处理，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地处置法规丢弃废物。
   9. 从盘子里稀释的谷醛溶液中分出。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
   10. 丢弃最终洗涤液后，加入 20 mL 的 100% 乙醇。使用钳子，分别拆下盖玻片，并在两片滤纸之间排列以干燥。
   11. 将干燥的盖玻片存放在密封的容器中。谷醛活性覆盖唇可提前制备并储存长达六个月。

3. 生成用于图案的 ECM 配体模具

1. 生成聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 中间图章
   1. 按重量将 PDMS 底座与 PDMS 固化剂以 10:1 的比例混合。彻底混合。
      注:对于 PDMS 的初始应用，准备大约 100 克 PDMS 以填充 100 mm 的盘。对于后续应用，仅从硅片特征所在的盘中心取出 PDMS，并准备 20-30 克新的 PDMS。
   2. 将 PDMS 混合物在干燥器中脱气 30-60 分钟或直到所有气泡被去除。
   3. 将步骤 1 中的改性硅片放入塑料 100 mm 盘中。缓慢均匀地将 PDMS 混合物倒在晶圆表面。点击工作表面上的碟子，从晶圆表面释放任何气泡。
   4. 将 PDMS 混合物浇注在晶圆上 10 分钟或直到所有气泡被去除或进入 PDMS 表面。
   5. 在 70°C 烘烤 PDMS 2 小时，让其冷却至室温。
   6. 使用手术刀或盒式切刀，从包含几何特征的盘子中心切出 PDMS 部分。
   7. 将 PDMS 切成大约 10 x 10 mm 的正方形，每个方块都包含单个实验条件的特征。这些在协议的后续步骤中称为"标记"。
2. 生成 PDMS 的平板
   1. 按重量将 PDMS 底座与 PDMS 固化剂以 8:1 的比例混合。准备约20克每100毫米菜使用。彻底混合。
   2. 将 PDMS 混合物在干燥器中脱气 30-60 分钟或直到所有气泡被去除。
   3. 缓慢均匀地将 PDMS 倒入干净的 100 mm 盘中。点击工作表面上的盘子以释放任何气泡。
   4. 在 70°C 烘烤 PDMS 2 小时，让其冷却至室温。
   5. 从盘中取出 PDMS。反转使与盘底接触的 PDMS 表面朝上。
   6. 对于步骤 3.1 中生成的每个图章，切割 15 x 15 mm 平方的 PDMS。这些在协议的后续步骤中称为"平板"。
3. 生成模具
   1. 将 PDMS 的平板放在 150 mm 盘盖或其他平面上，以便于操作。确保板材之间的间距足够（例如，对于 150 mm 的盘，可排列 9 块均匀间距的平板）。
   2. 将步骤 3.1 中生成的每个图章反转到 PDMS 的平板上，以便图章上的要素与 PDMS 的平板接触。用钳子轻轻按压邮票顶部，以确保均匀接触。
   3. 小心地将 PDMS 邮票/板对固定在盘子底座上，使盖子以一定角度静止。这有助于在下一步中芯化UV固化聚合物。
   4. 在每个邮票/板对的顶部界面上放置一小滴UV固化聚合物。在重力的辅助下，聚合物在表面张力下会恶在两者之间。
      注:本协议可能使用许多不同的UV固化聚合物。我们选择 Norland 光学胶粘剂 74 具有以下特性:i） 暴露于紫外线时快速固化;ii） 固化后从 PDMS 邮票中轻松去除，iii） 手动压力对玻璃盖玻片的牢固附着力。
   5. 一旦聚合物完全通过，将盖上邮票/板对平放在工作表面上。在每个印章/板界面的剩余三面放置一小滴UV固化聚合物。
   6. 使用 200 μL 移液器尖端，将聚合物滴连接在冲压/板界面边缘。这将创建一个边界，该边框将在步骤 4 中保存配体解决方案。
      注意:在戳边周围加工聚合物时要小心。如果戳/板接口中断，聚合物将芯在特征下方，模具将无法正确形成。
   7. 小心地将邮票/板对放入紫外线灭菌盒中。使用无菌"Str"电源设置，并曝光 10 分钟。
   8. 从紫外线灭菌盒中取出冲压/板对。使用两对钳子，轻轻取下 PDMS 标记，同时按住 UV 固化聚合物形成的平板和模具。
   9. 使用钳子，小心地拆下模具并反转，使与 PDMS 平板接触的表面朝上。
      注:模具很细腻。在交给它们时要小心，特别是最初将它们从 PDMS 中取出时，这样它们就不会撕裂。
   10. 将倒置的模具放回紫外线灭菌盒中。使用无菌"Str"电源设置，并曝光 3 分钟。

4. 在盖玻上图案 ECM 配体

1. 将模具压到酸洗盖玻片上
   1. 将每个模具的酸洗盖玻片放在干净的实验室薄膜上。
   2. 使用钳子，小心地将每个模具，平面向下，放在酸洗盖玻片上。放置使要素以中心放在盖玻上。
   3. 在每个模具的顶部放置一小块实验室薄膜。牢牢均匀地按下模具，在模具和盖玻片之间产生强烈的接触。
      注:这是一个关键步骤！用力将压在模具的整个表面上。如果未创建足够的触点，配体溶液将在模具和盖玻片之间泄漏，并且图案将失败。可选:为了确认模具与盖玻片之间的充分接触，将100μL的超纯无菌水移液到每个模具表面，并在室温下孵育。1 小时后，检查泄漏。从成功粘结模具中吸水并继续进行。
2. 等离子体清洁模具盖玻片表面，以增加亲水性
   1. 将带有模具的盖玻片放入等离子清洁剂中。应用高功率等离子体 30 s。
3. ECM 配体溶液的制备
   注:如果可能，所有后续步骤都应在无菌条件下完成。
   1. 将无菌 100 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 8.0 溶液放在冰上。冰冷后，加入母蛋白和胶原蛋白，分别达到225微克/mL和25微克/mL的浓度。可选:对于故障排除或配体可视化，在配体溶液中包括荧光标记配体。
      1. 注: 与此方法一起使用不同的 ECM 配体。对于不同的配体，可能需要额外的优化来确定理想的浓度、孵育时间和孵育温度。有关详细信息，请参阅讨论部分。
   2. 将配体溶液移至每个模具的表面。对于由 10 x 10 mm 方形图章制成的模具，请为每个模具应用 100 μL。
   3. 检查模具特征中是否有气泡。如有必要，请使用细尖钳子或 2 μL 移液器尖端从特征中去除气泡。
      注:这是一个关键步骤！如果气泡仍停留在盖玻片表面，配体不会吸附到表面，因此产生的图案不完整。
   4. 将带有配体的模版盖板放入盘中，用实验室薄膜包裹，并在4°C孵育过夜。

5. 配体转移到聚丙烯酰胺凝胶

1. 从每个盖玻片中去除配体溶液和模具
   1. 从模具表面吸出配体溶液。配体溶液可在4°C下收集和储存，并重复使用长达一个月。
   2. 使用钳子，用模具将盖玻片短暂地浸入含有无菌 PBS 的盘子中，以便清洗。
   3. 用模具将盖玻片短暂地浸入无菌 PBS 的第二道菜中，以便清洗。
   4. 从盖玻片表面拆下模具。小心不要弄破盖玻片。
   5. 将盖玻片短暂地浸入含有超纯无菌水的盘子中，以去除 PBS 洗洗的盐分。轻触盖玻片的边缘，进行精细的任务擦除，以清除多余的水。
   6. 在惰性气体（如氮气）下干燥盖玻片。标记盖玻片的底面，以便从此时向前跟踪方向。小心使图案的一侧朝上。
   7. 对每个模版盖玻片重复步骤 5.1.1 到 5.1.6。
2. 制作具有图案盖玻片的聚丙烯酰胺水凝胶
   注:参考之前的方法了解其他细节^7，9消毒所有用于制造聚丙烯酰胺凝胶的盖、管和垫片，方法是用 10% 漂白剂清洗过夜，用水冲洗至少 5 次以去除漂白剂，用70%乙醇短暂清洗。将所有碎件放在精细的任务湿巾上，在使用前晾干。
   1. 制备聚丙烯酰胺溶液以获得所需的水凝胶弹性（表2）。混合所有组件，除了荧光微球和硫酸钾 （PPS）。
      注:每次准备1%的亚硫酸钾溶液新鲜。
   2. 在真空下将聚丙烯酰胺溶液、微球和PPS在单独的管中脱气30分钟。
   3. 对于每个图案盖玻片，准备一个谷醛激活的"底部"盖玻片，上面放置一个垫片（18 mm 外径18毫米，内径14毫米）。
   4. 脱气后，对微球进行短暂声波，并在聚丙烯酰胺溶液中加入适当的体积。混合通过移液向上和向下，小心不要引入气泡。简要的声波。
   5. 将适当的PPS体积添加到聚丙烯酰胺溶液中。上下移液混合溶液，小心不要引入气泡。
      注:添加PPS后，在聚丙烯酰胺聚合之前，快速完成步骤5.2.6至5.2.11。
   6. 移液器 75-150 μL（取决于垫片的厚度）到每个谷醛激活盖玻片的中心。
   7. 使用钳子，将图案盖玻片放在每个谷氨酸活性覆盖滑片上，并用聚丙烯酰胺和垫片，使图案配体面对聚丙烯酰胺溶液。如果加入足够的聚丙烯酰胺溶液，表面张力将芯在两个盖玻片之间的聚丙烯酰胺，并且不存在气泡。
   8. 拿起每个聚丙烯酰胺"三明治"，并仔细触摸一侧的微妙任务擦拭，以清除多余的聚丙烯酰胺溶液。
   9. 小心地将每个聚丙烯酰胺"三明治"放入带有与 15 mL 锥形底管兼容的螺纹的盖架中。方向应使谷醛盖玻片的底部与盖架底部接触，并且图案盖玻片位于顶部。
   10. 将 15 mL 锥形底管拧入每个盖架，将聚丙烯酰胺"三明治"固定到位。管子应紧紧防止泄漏，但要小心不要过度拧紧和开裂盖玻片。
   11. 在室温下，在200 x g的回转桶中将聚丙烯酰胺"三明治"离心10分钟。从离心机中取出管子，并放置在管架中，以保持方向 50 分钟，以确保完全聚合。用箔片盖住，防止荧光微球漂白。
       注: 使用此方法执行 TFM 时，离心至关重要。离心力将所有微球移动到单个平面上，该平面最终将位于水凝胶表面的正下方。这是成像微球位移的理想选择，用于计算单元生成的牵引应力。如果不执行TFM，微球可以被排除在聚丙烯酰胺溶液中，聚合可以在台面发生，无需离心。
   12. 从管中取出聚合的聚丙烯酰胺"三明治"，然后浸入 100 mm 的盘中。在实验室薄膜中包裹，在室温下孵育3小时，或在4°C下孵育3小时。
3. 用于播种细胞的图案凝胶的制备
   1. 使用手术刀和钳子小心地从聚丙烯酰胺"三明治"中取出图案盖玻片和垫片，同时它仍然淹没在 PBS 中。在聚合过程中，图案配体将转移到聚丙烯酰胺上，并在去除盖玻片后保持。聚丙烯酰胺凝胶将仍然附着在谷醛活性盖玻片上。
      注:这是一个关键步骤！聚丙烯酰胺必须浸入PBS中，同时去除盖玻片，否则配体图案将被破坏。
   2. 将每个带有图案聚丙烯酰胺的盖玻片放入盖架中。在盖玻片顶部和垫片所在的聚丙烯酰胺周围放置垫片（外径 18 mm，内径 14 mm）。将锯掉的 15 mm 锥形底管拧入盖架，在底部形成带图案的聚丙烯酰胺的孔。这些组件适合标准 12 孔板的井，便于操作。
   3. 将 500 μL 的 PBS 添加到井组件中，清洗每个凝胶。在室温下孵育10分钟，轻轻摇动。取出 PBS 并重复两次，共进行三次。
   4. 完成PBS洗涤后，将500μL的敲除-DMEM培养基加入凝胶中，并在37°C孵育过夜。凝胶可在37°C下用介质保存长达5天，然后再播种细胞。
   5. 在播种细胞的前一天，更换除孔-DMEM，以进行完整的KSR培养，并在37°C孵育过夜。

6. 在图案凝胶上培养 hESC

注:如果计划在TFM后修复免疫染色样本，在播种细胞之前拍摄无应力微球位置的图像。在这种情况下，应在步骤 4.3.1 中使用荧光标记配体，以便在播种和微球在这些区域成像之前知道细胞的最终位置。

1. 在将图案聚丙烯酰胺凝胶播种之前，在条件性 KSR 介质中制备的母凝胶涂层板上制备的库存 hESC 培养物和二次无进料培养物，如前所述^9。
   注:通过在KSR培养基质培养辐照小鼠胚胎成纤维细胞，辅以4纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF），生成条件KSR培养基。每 24 小时收集和更换一次介质。
2. 从 hESC 中吸出介质。使用挖空-DMEM 介质短暂洗涤。加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，辅以10μM Y27632（Rho激酶抑制剂），在37°C孵育5-10分钟。
3. 加入与血清的培养因，以抑制胰蛋白酶。轻轻吸出培养液和移液器在盘子上，以去除细胞。继续轻轻移液，将所有细胞分离到单个细胞。
4. 收集细胞悬浮液和离心机在200 x g3分钟。
5. 吸出上清液，将颗粒重新悬浮在等效体积的KSR介质中进行清洗。在 200 x g下离心 3 分钟。
6. 在条件化的KSR介质中吸附上清液并重新悬浮颗粒，辅以10纳克/mL bFGF和10μM Y27632。
7. 使用血细胞计对细胞进行计数，并将细胞悬浮液调整到每mL300，000个细胞的浓度。移液器 500 μL 的细胞悬浮液到每个图案凝胶上（每个凝胶 150，000 个细胞）。
8. 播种后3小时，使用移液器小心地从每个凝胶中吸出介质，并更换为新鲜的经过调节的KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF和10μM Y27632。这将去除未粘附于聚丙烯酰胺的图案区域的多余细胞。
   注:这是一个关键步骤！在此阶段，细胞将松散地附着在有图案的配体上。交换介质时要非常小心，不要分离单元格。在后续步骤中，每个介质交换都应同等小心。
9. 播种后24小时，使用移液器小心吸气介质，并更换条件KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF和5μM Y27632。
10. 播种后48小时，使用移液器小心吸气介质，并更换条件KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF。这将从介质中去除Rho激酶抑制剂，实验可以在播种后72小时的第二天开始。

7. 执行 TFM

1. 如果需要，在所需的实验条件下执行 TFM，如前面描述^{的那样 9。}
2. 如果在播种细胞之前对无应力微球位置进行了成像，则在采取强调的微球位置后修复细胞，并执行免疫染色以确定相对于高牵引力和低牵引力区域感兴趣的蛋白质的定位。

结果

试图在符合要求的基材上培养受控几何体中的 hESC 时，需要克服的主要挑战是在基材表面生成同质的 ECM-配体图案。此方法中提出的策略是首先在玻璃盖玻片表面生成所需的图案，然后在凝胶聚合过程中将该图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面（图1）因此，在进行水凝胶聚合和图案转移之前，必须确保在玻璃盖玻片表面成功创建所需的图案（图1B）。根据对转移到聚丙烯酰胺的荧光配体图案的成像，配体似乎只存在于聚丙烯酰胺表面的单个平面上，尽管我们没有精确描述该层的厚度。在玻璃盖玻片上观察到两种常见的缺陷类型，每种缺陷都有自己的误差源。第一种是荧光配体的外观，其范围超出所需图案的边缘（图1C，上图），由于模具中出现小撕裂或密封不足，荧光配体溶液泄漏。玻璃盖玻片的模具。第二种是出现不完整的图案（

讨论

为了简化一个漫长而详细的协议，此方法包括三个关键阶段:1） 在玻璃盖玻片上生成 ECM 配体图案，2） 在凝胶聚合过程中将图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶，以及 3） 在图案水凝胶。在这三个阶段中，每个阶段都必须考虑一些关键步骤。为了在玻璃盖玻上生成高保真图案，必须将模具牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且必须在向模具表面添加配体溶液后清除所有气泡（图 1C.如果配体溶液由于与盖玻片接触不良而通过模具泄漏，配体将转移到聚丙烯酰胺水凝胶的整个表面，hESCs 将不局限于所需的菌体几何形状（图4C）。将图案配体转移到聚丙烯酰胺的最重要步骤是将顶盖滑从水凝胶中轻轻分离，同时所有组件仍淹没在 PBS 中。如果水凝胶在分离过程中没有被淹没，则图案可能完全被破坏。此外，如果分离发生得太快，水凝胶的表面可能会撕裂或损坏。水凝胶越软，在分离过程中就越有损坏的风险。最后，在模式水凝胶上的 hESC 种子和培养过程中，用户在交换介质时必须非常小心移液器。hESCs 在整...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶	Gibco	25300054
100 mm 玻璃培养皿	Fisher Scientific	08-747B
100 mm 塑料培养皿	Fisher Scientific	FB0875712
15 mL 锥形底管	Corning	352095
150 mm 塑料培养皿	Fisher Scientific	FB0875714
18 mm直径 #1 盖玻片	Thermo Scientific	18CIR-1
2% 双丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0142
3-氨基丙基三甲氧基硅烷	ACROS 有机物	313251000
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140
铝箔	Fisher Scientific	01-213-100
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma-Aldrich	F0291
漂白	Clorox	N/A
离心机，带摆动桶	Eppendorf	22623508	型号：5804 R
胶原蛋白	康宁	354236
Dessicator	Fisher Scientific	08-642-7
乙醇	Fisher Scientific	AC615095000
胎儿牛血清	Gibco	16000044
荧光微球	Thermo Scientific	F8821
镊子（用于盖玻片）	Fisher Scientific	16-100-122
镊子（用于晶圆）	Fisher Scientific	17-467-328
凝胶支架	N/A	N/A	凝胶支架是定制的 3D 打印，可根据要求提供 CAD 图纸
戊二醛	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
热板	Fisher Scientific	HP88854100
盐酸	Fisher Scientific	A144S-500
异丙醇	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes（精细任务湿巾）	Kimberly-Clark Professional	34120
Knockout 血清替代物	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
掩模对准器（用于光刻）	Karl Suss America， Inc.	Karl Suss MJB3 掩模对准器
Matrigel	Corning	354277
显微镜 牵引力	尼康	N/A	型号：Eclipse TE200 U
电动定位平台	Prior Scientific	N/A	型号：HLD117
氮气	Airgas	NI 250
Norland 光学胶 74（紫外线固化聚合物）	Norland产品	NOA 74
烘箱	Thermo Scientific	PR305225G
封口膜（实验室胶片）	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS （Sylgard 184）	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services， Inc.	N/A	光掩模是定制的。可根据要求提供我们设计的 CAD 图纸
等离子清洗机	Fisher Scientific	NC9332171
垫片塑料	Marian Chicago	HT6135
垫片塑料	TAP 塑料	N/A	聚碳酸酯板，.01 英寸厚
氯化钾（用于制造 PBS）	Fisher Scientific	P217-500
磷酸二氢钾（用于制备 PBS）	Fisher Scientific	P285-500
过硫酸钾	ACROS 有机物	424185000
手术刀	Fisher Scientific	14-840-00
硅晶片	电子显微镜科学	71893-06	P 型，3 英寸，硅晶片
氯化钠（用于制造 PBS）	Fisher Scientific	S271-1
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-100
磷酸氢二钠二水合物（用于制备 PBS）	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050 光刻胶	MicroChem	SU8-3000
SU8-显影	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
紫外线消毒盒	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS 基因接头紫外线室
Y27632（Rho 激酶抑制剂）	StemCell Technologies	72304