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方法文章

在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性

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DOI：

10.3791/60334

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2019年9月28日

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1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

本文内容

摘要

可将细胞外基质配体图案化修饰到聚丙烯酰胺水凝胶上，从而在柔性的基底上实现人胚胎干细胞在限定区域内的克隆培养。该方法可与牵引力显微镜技术及生物化学检测相结合，用于研究组织几何形态、细胞自身产生的力学力与细胞命运决定之间的相互作用。

摘要

人类胚胎干细胞在体外表现出一种独特的能力，能够通过自我组织形成与胚胎发生过程中初级胚层形成相对应的细胞命运特化模式，从而响应形态发生素。因此，这些细胞是研究驱动早期人类发育机制的有力工具。我们开发了一种方法，将人类胚胎干细胞培养在具有顺应性的基底上受限的克隆中，以控制克隆的几何形状及其力学环境，从而重现胚胎发生过程中潜在的物理参数。该方法的关键在于能够在聚丙烯酰胺水凝胶表面生成具有明确定义的细胞外基质配体图案，以促进细胞黏附。这一目标通过以下步骤实现：首先制备具有理想几何图案的掩膜模板，然后利用这些模板在玻璃盖玻片上形成细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移至聚丙烯酰胺水凝胶上。该方法还兼容牵引力显微镜技术，使用户能够测量并绘制受限克隆内细胞产生的力的分布情况。结合标准的生物化学检测方法，这些测量结果可用于研究力学信号在早期人类发育过程中对命运特化和形态发生所起的作用。

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有广阔前景。这些细胞的多能性使其能够分化为任何类型的成体细胞。尽管在引导hESCs向特定细胞类型分化方面已取得显著进展，但要从头生成完整的组织或器官仍然极为困难de novo1,2,3,4,5。这主要归因于人们对人类发育过程中驱动组织形成的机制了解尚有限。为了填补这一知识空白，近年来涌现出多种利用胚胎干细胞模拟早期胚胎及后续发育阶段的方法6,7,8,9,10,11,12,13。

在首次建立人类胚胎干细胞（hESC）系后不久，研究即证明由hESC形成的拟胚体能够自发产生三个原始胚层的细胞146。然而，由于拟胚体在大小和形态上固有的不可控性，其胚层组织存在显著变异，无法准确模拟早期胚胎中的胚层排列。最近，Warmflash等人开发了一种通过微图形化技术将hESC集落限制在玻璃基底上的方法，从而实现了对集落大小和几何形状的精确控制与一致性8。在BMP4（早期发育中的重要形态发生素）存在的情况下，这些受限的集落能够自我组织，稳定地分化为代表三个原始胚层的不同细胞命运。尽管该模型为研究原始胚层建立的机制提供了有力工具，但其命运特化的模式仍未能精确重现胚胎发生过程中所观察到的组织结构和形态发生过程15。更为忠实地模拟早期胚胎发育的方法是将hESC嵌入三维Matrigel基质（一种细胞外基质，ECM）中11，该方法迄今为hESC在体外自我组织并模拟胚胎早期发育阶段的能力提供了最有力的证据。然而，该方法结果重复性差，因此无法适用于多种可用于揭示自我组织与命运特化潜在机制的检测手段。

鉴于现有方法及其各自的局限性，我们致力于开发一种可在模拟早期胚胎细胞外环境的条件下，可重复地培养具有特定几何形态的人胚胎干细胞（hESC）集落的方法。为实现这一目标，我们采用可调节弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶来控制基底的力学特性。通过对原肠胚阶段鸡胚胎进行原子力显微镜检测，我们发现上胚层的弹性模量范围为数百帕（pascals）至数个千帕（kilopascals）。因此，我们重点制备弹性模量处于该范围内的聚丙烯酰胺水凝胶，作为hESC集落的培养基底。我们改进了此前在聚丙烯酰胺水凝胶上培养hESC的方法7,9，以实现对集落几何形态的稳定控制。具体方法是：首先通过微加工的掩膜模板，将细胞外基质（ECM）配体（即Matrigel）图案化地修饰在玻璃盖玻片表面，该步骤如先前报道所述16。随后，我们设计了一种新颖的技术，在聚丙烯酰胺水凝胶聚合过程中，将图案化的配体转移至其表面。本文所述方法包括：利用光刻技术制备具有目标几何图案的硅片，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制这些几何特征形成印章，再利用这些印章制备掩膜模板，最终实现配体在玻璃盖玻片表面的图案化及其向聚丙烯酰胺水凝胶的转移。

除了重现早期胚胎的力学环境外，将人胚胎干细胞（hESC）集落限制在聚丙烯酰胺基底上，还可通过牵引力显微镜（TFM）测量细胞自身产生的力，正如我们先前方法中所报道的那样9。简而言之，可将荧光微球嵌入聚丙烯酰胺凝胶中作为基准标记物；在将hESC接种到图案化基底后，通过成像这些微球的位移来计算细胞产生的力。此外，所得的牵引力图谱可与传统检测方法（如免疫荧光染色）相结合，以研究在受限的hESC集落中细胞产生之力的分布如何调控或调节下游信号通路。我们预计这些方法将揭示机械力在早期胚胎发育过程中细胞命运决定的模式形成中起着关键作用，而这一作用目前尚未受到足够重视。

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方案

 本文所述所有涉及人类胚胎干细胞（hESCs）使用的方法均已获得加利福尼亚大学旧金山分校人类配子、胚胎与干细胞研究（GESCR）委员会的批准。

1. 具有几何特征的硅片制备

  1. 制作具有目标几何特征的光刻掩模。使用计算机辅助制图软件设计所需特征。若使用负性光刻胶，则需将特征区域设为不透光，其余部分设为透光。
    注意：若要在直径为18 mm的盖玻片上进行图案化，应将每种实验条件的特征集中于10 × 10 mm的区域内，以确保第3步生成的模板能够适配盖玻片。
  2. 在100 mm硅片上旋涂负性光刻胶。参考光刻胶的产品数据表，设定旋涂速度和时间，以获得100–250 µm的薄膜厚度。
    注意：应调整膜厚，使图案宽度与模板高度的宽高比尽可能接近1:1。然而，建议最小厚度为100 µm，因为更薄的膜会形成脆弱的模板，容易撕裂。
  3. 根据产品数据表对光刻胶进行处理。通常包括前烘、在掩模对准仪中使用光刻掩模进行紫外曝光、曝光后烘烤、显影和坚膜烘烤。例如，本实验方案所用硅片的处理步骤详见表1。
    注意：操作硅片时需谨慎，因其质地脆弱。只要未受损伤，硅片可重复使用多次。

2. 盖玻片的准备

  1. 酸洗制备 "顶部" 盖玻片
    1. 将直径18 mm、1号厚度的盖玻片放入玻璃培养皿中。盖玻片的数量应根据培养皿的大小而定。对于100 mm的培养皿，建议每次准备50–100片盖玻片。本节后续步骤中的体积用量均以100 mm培养皿为基准。
    2. 向培养皿中加入 20 mL 1 M HCl，轻轻摇动培养皿以分散盖玻片。确保所有盖玻片均完全浸没，并去除盖玻片之间的气泡。室温下轻轻振荡孵育过夜。
      警告：盐酸具有酸性和腐蚀性。操作盐酸时应小心谨慎，并穿戴适当的个人防护装备。
    3. 将盐酸从培养皿中倾倒掉。加入20 mL超纯水，轻轻振荡洗涤10分钟。弃去水相，重复洗涤，共洗涤五次。
    4. 弃去最后一次洗涤液后，向培养皿中加入 20 mL 100% 乙醇。用镊子逐个取出盖玻片，并夹在两层滤纸之间晾干。
    5. 将干燥的盖玻片储存于密封容器中。经酸洗处理的盖玻片可预先制备，在无尘条件下可保存一个月或更长时间。
  2. 制备 戊二醛活化的 "底部" 盖玻片
    注意：更多细节请参见之前的方法7,9.
    1. 将直径为18 mm、厚度为1号的盖玻片放入培养皿中。
    2. 向培养皿中加入 20 mL 0.2 M HCl，轻轻摇动培养皿以分散盖玻片。确保所有盖玻片均完全浸没，并去除盖玻片之间的气泡。室温下轻轻摇动孵育过夜。
    3. 将盐酸从培养皿中倾倒掉。加入20 mL超纯水，轻轻振荡洗涤10分钟。弃去水相，重复洗涤，共洗涤五次。
    4. 弃去最后一次洗涤液后，加入20 mL 0.1 M NaOH，轻轻振荡使盖玻片分散并完全浸没。室温下轻柔振荡孵育1小时。
    5. 将 NaOH 从培养皿中倾倒出去。加入 20 mL 超纯水，轻轻振荡洗涤 10 分钟。弃去水相，重复洗涤，共洗涤五次。
    6. 弃去最后一次洗涤液后，加入20 mL用超纯水按1:200稀释的3-aminopropyltrimethoxysilane溶液，轻轻振荡使盖玻片分散并完全浸没。室温下轻柔振荡孵育1小时或过夜。
      警告：3-氨基丙基三甲氧基硅烷易燃，可引起皮肤刺激。操作时需小心，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地废弃处理规定处置废弃物。
    7. 将稀释的3-aminopropyltrimethoxysilane溶液从培养皿中倾出。加入20 mL超纯水，轻轻振荡洗涤10分钟。弃去水相，重复洗涤至少五次。在进入下一步之前彻底去除全部3-aminopropyltrimethoxysilane至关重要。
    8. 弃去最后一次洗涤液后，加入20 mL用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:140稀释的70%戊二醛溶液，轻轻振荡使盖玻片分散并完全浸没。室温下轻轻振荡孵育1小时或过夜。
      警告：70% 戊二醛具有毒性，可引起皮肤刺激。操作时需小心，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地废弃处理规定处置废弃物。
    9. 将稀释的戊二醛溶液从培养皿中倾出。加入20 mL超纯水，轻轻振荡洗涤10分钟。弃去水相，重复洗涤，共洗涤五次。
    10. 弃去最后一次洗涤液后，加入20 mL 100%乙醇。用镊子逐个取出盖玻片，夹在两张滤纸之间干燥。
    11. 将干燥的盖玻片储存于密封容器中。戊二醛活化的盖玻片可预先制备，储存时间最长可达六个月。

3. 用于图案化细胞外基质配体的模板制备

  1. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）中间印章
    1. 按重量比10:1将PDMS基础剂与PDMS固化剂混合，充分搅拌均匀。
      注：首次使用PDMS时，准备约100 g PDMS以填满一个100 mm培养皿。后续应用中，仅需从培养皿中心取出含有硅片微结构的部分，并准备20–30 g新PDMS。
    2. 将混合后的PDMS置于真空干燥器中脱气30–60分钟，直至所有气泡完全去除。
    3. 将第1步中修饰后的硅片放入一个塑料100 mm培养皿中。缓慢且均匀地将PDMS混合物倾倒在硅片表面。轻敲培养皿于工作台面，以释放硅片表面附着的气泡。
    4. 将倾倒在硅片上的PDMS混合物再次置于真空干燥器中脱气10分钟，或直至所有气泡完全逸出或上浮至PDMS表面。
    5. 在70 °C下烘烤PDMS 2小时，随后冷却至室温。
    6. 使用手术刀或美工刀，从培养皿中心切割出含有微结构特征的PDMS区域。
    7. 将PDMS切成约10 × 10 mm的正方形小片，每片包含单一实验条件所需的微结构。在本实验方案后续步骤中，这些小片被称为"印章"。
  2. 制备平整的PDMS薄片
    1. 按重量比8:1将PDMS基础剂与PDMS固化剂混合。每个100 mm培养皿约需准备20 g PDMS，充分搅拌均匀。
    2. 将混合后的PDMS置于真空干燥器中脱气30–60分钟，直至所有气泡完全去除。
    3. 缓慢且均匀地将PDMS倒入洁净的100 mm培养皿中。轻敲培养皿于工作台面，以释放其中的气泡。
    4. 在70 °C下烘烤PDMS 2小时，随后冷却至室温。
    5. 将PDMS从培养皿中取出，并翻转使其原先与培养皿底部接触的表面朝上。
    6. 针对第3.1步中制得的每个印章，裁剪一块15 × 15 mm的PDMS薄片。在本实验方案后续步骤中，这些薄片被称为"平整薄片"。
  3. 制备模板（stencil）
    1. 将PDMS平整薄片排列在150 mm培养皿的盖子上或其他平坦表面上，以便于操作。确保各薄片之间留有足够间距（例如，在150 mm培养皿盖上可均匀排列九块平整薄片）。
    2. 将第3.1步中制得的每个印章翻转后压在一块平整PDMS薄片上，使印章上的微结构与平整薄片表面接触。用镊子轻轻按压印章顶部，确保接触均匀。
    3. 将承载PDMS印章/薄片组合的盖子小心地斜靠在培养皿底部上，使盖子呈倾斜状态。此操作有助于下一步中毛细作用引导紫外光固化聚合物的渗透。
    4. 在每组印章/薄片组合的顶部接口处滴加少量紫外光固化聚合物。该聚合物将在表面张力和重力作用下被毛细吸入两层之间。
      注：本方案中可使用多种不同的紫外光固化聚合物。我们选用Norland光学胶74（Norland Optical Adhesive 74），因其具备以下特性：i）在紫外光照射下快速固化；ii）固化后易于从PDMS印章上剥离；iii）在手动加压条件下能牢固粘附于玻璃盖玻片。
    5. 待聚合物完全渗透后，将盖子平放于工作台面。在每组印章/薄片接口的其余三侧各滴加一小滴紫外光固化聚合物。
    6. 使用200 µL移液枪头，将印章/薄片接口边缘的聚合物液滴连接起来，形成一圈封闭边界，以便在第4步中容纳配体溶液。
      注：操作时需小心处理印章边缘的聚合物。若印章与薄片之间的界面被破坏，聚合物将渗入微结构下方，导致模板无法正确形成。
    7. 小心将印章/薄片组合放入紫外灭菌箱中，使用无菌"Str"功率设置，照射10分钟。
    8. 从紫外灭菌箱中取出印章/薄片组合。使用两把镊子，一手固定由紫外光固化聚合物形成的模板和平整薄片，另一手轻轻取下PDMS印章。
    9. 用镊子小心取下模板并翻转，使原先与PDMS平整薄片接触的表面朝上。
      注：模板较为脆弱，操作时需格外小心，尤其是在初次从PDMS上剥离时，避免撕裂。
    10. 将翻转后的模板重新放入紫外灭菌箱中，使用无菌"Str"功率设置，照射3分钟。

4. 在盖玻片上构建细胞外基质配体图案

  1. 将模板压在酸洗过的盖玻片上
    1. 将每张模板对应的酸洗盖玻片放置在一块洁净的实验室薄膜上。
    2. 使用镊子小心地将每个模板平整朝下放置在酸洗过的盖玻片上，确保模板的图案居中。
    3. 在每个模板上方覆盖一小片实验室薄膜，用力且均匀地按压模板，使模板与盖玻片之间形成牢固的贴合。
      注意：此步骤至关重要！必须在整个模板表面施加足够的压力。若贴合不充分，配体溶液会渗入模板与盖玻片之间，导致图案化失败。可选：为确认模板与盖玻片之间贴合充分，可在每个模板表面加入100 µL超纯无菌水，并在室温下孵育。1小时后检查是否渗漏。对成功结合的模板吸除水分后继续后续操作。
  2. 对带有模板的盖玻片表面进行等离子清洗以增强亲水性
    1. 将带有模板的盖玻片放入等离子清洗仪中，以高功率进行等离子处理30秒。
  3. 细胞外基质（ECM）配体溶液的制备
    注意：如有可能，所有后续步骤均应在无菌条件下完成。
    1. 将无菌的100 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 8.0溶液置于冰上。待其充分冷却后，加入Matrigel和胶原蛋白，使其终浓度分别为225 µg/mL和25 µg/mL。可选：为便于故障排查或配体可视化，可在配体溶液中加入荧光标记的配体。
      1. 注意：本方法可使用不同的细胞外基质配体。对于不同配体，可能需要进一步优化以确定最佳浓度、孵育时间和孵育温度。详见讨论部分。
    2. 将配体溶液滴加至每个模板表面。对于由10 × 10 mm方形印章制成的模板，每个模板加入100 µL。
    3. 检查模板图案区域是否存在气泡。如有必要，使用尖头镊子或2 µL移液枪头去除图案区域内的气泡。
      注意：此步骤至关重要！若气泡残留在盖玻片表面，配体将无法吸附至表面，导致最终图案不完整。
    4. 将带有配体的模板化盖玻片放入培养皿中，用实验室薄膜包裹，并在4 °C下孵育过夜。

5. 配体转移至聚丙烯酰胺凝胶

  1. 从每张盖玻片上移除配体溶液和模板
    1. 从模板表面吸除配体溶液。配体溶液可收集后于4 °C保存，并在一个月内重复使用。
    2. 使用镊子将带有模板的盖玻片短暂浸入含有无菌 PBS 的培养皿中进行清洗。
    3. 将带有模板的盖玻片短暂浸入第二皿无菌 PBS 中进行清洗。
    4. 从盖玻片表面移除模板，注意不要弄破盖玻片。
    5. 将盖玻片短暂浸入盛有超纯无菌水的培养皿中，以去除PBS洗涤残留的盐分。用盖玻片边缘轻触精细擦拭纸，吸去多余水分。
    6. 在惰性气体（如氮气）环境下干燥盖玻片。从此步骤开始，在盖玻片底面做标记以记录其方向。注意保持图案面朝上。
    7. 对每一片带有模板的盖玻片重复步骤 5.1.1 至 5.1.6。
  2. 使用带有图案的盖玻片制备聚丙烯酰胺水凝胶 
    注意：更多细节请参见之前的方法7,9  使用10%次氯酸钠溶液过夜浸泡用于制备聚丙烯酰胺凝胶的所有盖帽架、试管和间隔片进行灭菌，随后用清水冲洗至少五次以去除残留的次氯酸钠，再用70%乙醇短暂清洗。将所有部件置于无菌生物安全柜内的精细擦拭纸上晾干后备用。
    1. 制备聚丙烯酰胺溶液以获得目标水凝胶弹性（表 2）。除荧光微球和过硫酸钾（PPS）外，将所有组分混合在一起。
      注意：每次使用前需新鲜配制1%过硫酸钾溶液。
    2. 将聚丙烯酰胺溶液、微球和PPS分别置于真空下脱气30分钟。
    3. 对于每个图案化盖玻片，准备一份戊二醛活化的 "底部" 盖玻片上放置一个垫片（外径18 mm，内径14 mm）。
    4. 脱气后，将微球短暂超声处理，并加入适量至聚丙烯酰胺溶液中。通过上下吹打混匀，注意避免引入气泡。再次短暂超声处理。
    5. 向聚丙烯酰胺溶液中加入适量的PPS。用移液器上下吹打混合溶液，注意避免引入气泡。
      注意：加入PPS后，需迅速完成步骤5.2.6至5.2.11，以免聚丙烯酰胺发生聚合。
    6. 用移液器将75–150 µL（根据间隔垫厚度而定）加至每张戊二醛活化的盖玻片中心。
    7. 使用镊子将带有图案的盖玻片放置到每张经戊二醛活化的含聚丙烯酰胺和间隔物的盖玻片上，使图案化的配体面向聚丙烯酰胺溶液。若加入的聚丙烯酰胺溶液量充足，表面张力会将聚丙烯酰胺吸入两张盖玻片之间，且不会产生气泡。
    8. 取出每一块聚丙烯酰胺凝胶 "三明治" 并轻轻将侧面接触一块洁净的擦拭纸，以吸走多余的聚丙烯酰胺溶液。
    9. 小心地放置每一块聚丙烯酰胺凝胶 "三明治" 放入一个螺纹与15 mL锥底管兼容的盖帽架中。放置方向应使戊二醛盖玻片的底部接触盖帽架的底部，而带有图案的盖玻片位于上方。
    10. 将15 mL锥底离心管旋入每个盖子固定架中，以固定聚丙烯酰胺凝胶 "三明治" 就位。试管应拧紧以防止泄漏，但需注意不要过度拧紧而导致盖玻片破裂。
    11. 离心聚丙烯酰胺凝胶 "三明治" 在离心管中，使用摆桶转子于200 × g条件下离心 g 室温下离心10分钟。将离心管从离心机中取出，放入试管架中保持原有方向，继续静置50分钟以确保完全聚合。用铝箔覆盖，避免荧光微球发生漂白。
      注意：使用该方法进行牵引力显微镜（TFM）实验时，离心步骤至关重要。离心力可将所有微球集中至单一平面，最终位于水凝胶表面下方较浅位置。此分布状态有利于成像微球的位移，进而用于计算细胞产生的牵引应力。若不进行TFM实验，可省略在聚丙烯酰胺溶液中添加微球的步骤，且聚合过程可在台面上静置完成，无需离心。
    12. 去除聚合的聚丙烯酰胺 "三明治" 从离心管中取出样本，放入盛有PBS的100 mm培养皿中。用封口膜包裹，于室温孵育3小时，或于4 °C过夜孵育。
  3. 用于细胞接种的图案化凝胶制备
    1. 使用解剖刀和镊子小心地从聚丙烯酰胺上移除带有图案的盖玻片和间隔层 "三明治" 在保持浸没于PBS中的同时，图案化配体将在聚丙烯酰胺聚合过程中转移至凝胶，并在移除盖玻片后仍保留在凝胶上。聚丙烯酰胺凝胶将保持与戊二醛活化的盖玻片结合。
      注意： 这是关键的一步！ 在去除盖玻片时，聚丙烯酰胺必须浸没在PBS中，否则配体图案将被破坏。
    2. 将每张带有图案化聚丙烯酰胺的盖玻片放入帽状支架中。在盖玻片上方、聚丙烯酰胺周围（即间隔物原来所在位置）放置一个垫圈（外径18 mm，内径14 mm）。将截去底部的15 mm锥底离心管旋入帽状支架，形成一个以图案化聚丙烯酰胺为底部的孔室。这些组件可适配标准12孔板的孔，便于操作。
    3. 向每个胶孔中加入500 µL PBS进行洗涤。室温下轻轻振荡孵育10分钟。吸除PBS，重复洗涤两次，共洗涤三次。
    4. 最后一次 PBS 洗涤后，向凝胶中加入 500 µL knockout-DMEM 培养基，于 37 °C 培养过夜。在接种细胞前，凝胶可在含培养基的条件下于 37 °C 保存最多 5 天。
    5. 细胞接种前一天，将敲除型DMEM更换为完全KSR培养基，37 °C过夜培养。

6. 在图案化凝胶上培养人胚胎干细胞

注意：如果计划在TFM之后对样品进行固定以进行免疫染色，应在接种细胞之前拍摄未受应力的微球位置图像。在此情况下，步骤4.3.1中应使用荧光标记的配体，以便在接种前确定细胞的最终位置，并可在这些区域对微球进行成像。

  1. 在接种至图案化聚丙烯酰胺凝胶之前，按照先前所述方法9，将人胚胎干细胞（hESC）储备培养物及在Matrigel包被培养板上制备的次级无饲养层培养物维持于条件化KSR培养基中。
    注意：通过在补充有4 ng/mL基础成纤维细胞生长因子（bFGF）的KSR培养基中培养经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞来制备条件化KSR培养基。每24小时收集 并更换一次培养基。
  2. 吸除hESC培养基，用Knockout-DMEM培养基短暂洗涤。加入含10 µM Y27632（Rho激酶抑制剂）的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5–10分钟。
  3. 加入含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化。轻柔吸除培养基，并用移液器反复吹打培养皿表面以收集细胞。继续轻柔吹打，使所有细胞脱离并解离成单细胞悬液。
  4. 收集细胞悬液，在200 × g下离心3分钟。
  5. 吸除上清液，将沉淀物重悬于等体积的KSR培养基中进行洗涤，随后在200 × g下离心3分钟。
  6. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于补充有10 ng/mL bFGF和10 µM Y27632的条件化KSR培养基中。
  7. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞悬液调整至浓度为每毫升300,000个细胞。向每块图案化凝胶中加入500 µL细胞悬液（每块凝胶接种150,000个细胞）。
  8. 接种后3小时，使用移液器小心吸除每块凝胶上的培养基，并更换为新鲜的、补充有10 ng/mL bFGF和10 µM Y27632的条件化KSR培养基。此步骤可去除未黏附至聚丙烯酰胺凝胶图案化区域的多余细胞。
    注意：此为关键步骤！ 此时细胞与图案化配体的黏附尚不牢固。更换培养基时务必格外小心，避免细胞脱落。后续各步骤中的每次换液操作均需保持同等谨慎。
  9. 接种后24小时，使用移液器小心吸除培养基，并更换为补充有10 ng/mL bFGF和5 µM Y27632的条件化KSR培养基。
  10. 接种后48小时，使用移液器小心吸除培养基，并更换为补充有10 ng/mL bFGF的条件化KSR培养基。此操作可从培养基中去除Rho激酶抑制剂，实验可在次日（即接种后72小时）开始。

7. 执行 TFM

  1. 在需要时，按照先前所述方法9在所需的实验条件下进行牵引力显微镜检测（TFM）。
  2. 若在接种细胞前已拍摄未受力微球的位置，则在获取受力状态下微球位置后固定细胞，并进行免疫荧光染色，以确定目标蛋白相对于高牵引力和低牵引力区域的定位情况。

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结果

在柔性的基底上培养具有可控几何形状集落的人胚胎干细胞（hESCs）时，主要挑战在于如何在基底表面生成均一的细胞外基质（ECM）配体图案。本方法所采用的策略是，首先在玻璃盖玻片表面构建所需的图案，随后在水凝胶聚合过程中将该图案转移至聚丙烯酰胺水凝胶表面（图1A）。因此，在进行水凝胶聚合及图案转移之前，必须确保玻璃盖玻片表面已成功形成目标图案（图1B）。根据转移至聚丙烯酰胺上的荧光配体图案的成像结果，荧光配体仅存在于聚丙烯酰胺表面的单一平面内，尽管我们并未精确测定该层的厚度。在玻璃盖玻片上生成图案后，常观察到两类缺陷，每类缺陷均有其特定的误差来源。第一类缺陷是荧光配体超出目标图案边缘（图1C，上图），这通常是由于掩膜出现微小撕裂或掩膜与玻璃盖玻片之间密封不充分，导致荧光配体溶液泄漏所致。第二类缺陷是...

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讨论

为了简化一个冗长且详细的实验方案，本方法包含三个关键步骤：1）在玻璃盖玻片上生成细胞外基质（ECM）配体的图案；2）在水凝胶聚合过程中将图案转移至聚丙烯酰胺水凝胶上；3）将人胚胎干细胞（hESCs）接种到图案化水凝胶上。这三个阶段中的每一个都存在必须注意的关键操作步骤。为了在玻璃盖玻片上生成高保真度的图案，需将模板牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且在将配体溶液加入模板表面后必须去除所有气泡（图1C）。如果由于模板与盖玻片接触不良导致配体溶液发生泄漏，则配体会转移到聚丙烯酰胺水凝胶的整个表面，从而使hESCs无法被限制在预期的克隆几何形状内（图4C）。将图案化配体转移至聚丙烯酰胺水凝胶过程中最关键的步骤是：在所有组件仍浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）中的条件下，轻柔地将上层盖玻片从水凝胶上分离。如果在分离过程中水凝胶未保持浸没状态，图案可能会被完全破坏。此外，若分离速度过快，水凝胶表面可能发生撕裂或其他损伤。水凝胶越软，在分离过程中越容易受损。最后...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢加州再生医学研究所（CIRM）资助项目 RB5-07409 提供的资金支持。J.M.M. 感谢 FuiBoon Kai、Dhruv Thakar 和 Roger Oria 在本方法的建立与问题排查过程中提供的诸多有益讨论。J.M.M. 还感谢加州大学旧金山分校（UCSF）Discovery Fellowship 对其研究工作的持续支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶Gibco25300054
100 mm 玻璃培养皿Fisher Scientific08-747B
100 mm 塑料培养皿Fisher ScientificFB0875712
15 mL 圆底离心管Corning352095
150 mm 塑料培养皿Fisher ScientificFB0875714
18 mm 直径 #1 盖玻片Thermo Scientific18CIR-1
2% 双丙烯酰胺Bio-Rad161-0142
3-氨基丙基三甲氧基硅烷ACROS Organics313251000
40% 丙烯酰胺Bio-Rad161-0140
铝箔Fisher Scientific01-213-100
碱性成纤维细胞生长因子Sigma-AldrichF0291
漂白剂CloroxN/A
带摆动桶的离心机Eppendorf22623508型号：5804 R
胶原蛋白Corning354236
干燥器Fisher Scientific08-642-7
乙醇Fisher ScientificAC615095000
胎牛血清Gibco16000044
荧光微球Thermo ScientificF8821
镊子（用于盖玻片）Fisher Scientific16-100-122
镊子（用于晶圆）Fisher Scientific17-467-328
凝胶支架N/AN/A凝胶支架为定制3D打印件，CAD图纸可应要求提供
戊二醛Fisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
加热板Fisher ScientificHP88854100
盐酸Fisher ScientificA144S-500
异丙醇Fisher ScientificA416-500
Kimwipes（精密擦拭纸）Kimberly-Clark Professional34120
无血清替代物Gibco10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
掩模对准器（用于光刻）Karl Suss America, Inc.Karl Suss MJB3 Mask Aligner
MatrigelCorning354277
牵引力显微镜NikonN/A型号：Eclipse TE200 U
电动定位载物台Prior ScientificN/A型号：HLD117
氮气AirgasNI 250
Norland 光学胶 74（紫外光固化聚合物）Norland ProductsNOA 74
烘箱Thermo ScientificPR305225G
Parafilm（实验室封口膜）Fisher Scientific13-374-12
PDMS（Sylgard 184）Fisher ScientificNC9285739
光刻掩模CAD/Art Services, Inc.N/A光刻掩模为定制制作，设计的CAD图纸可应要求提供
等离子清洗机Fisher ScientificNC9332171
垫圈用塑料Marian ChicagoHT6135
间隔片用塑料TAP PlasticsN/A聚碳酸酯片，厚度0.01英寸
氯化钾（用于配制PBS）Fisher ScientificP217-500
磷酸二氢钾（用于配制PBS）Fisher ScientificP285-500
过硫酸钾ACROS Organics424185000
手术刀Fisher Scientific14-840-00
硅晶圆Electron Microscopy Sciences71893-06类型P，3英寸硅晶圆
氯化钠（用于配制PBS）Fisher ScientificS271-1
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100
磷酸氢二钠二水合物（用于配制PBS）Fisher ScientificS472-500
SU8-3050 光刻胶MicroChemSU8-3000
SU8 显影液MicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
紫外灭菌箱Bio-RadN/ABio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632（Rho激酶抑制剂）StemCell Technologies72304

参考文献

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在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性
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