方法文章

在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学

DOI：

10.3791/60334

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2019年9月28日

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1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

本文内容

摘要

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细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。

摘要

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人类胚胎干细胞通过细胞命运规范的自组织模式，在胚胎形成过程中与原发生殖层形成相对应，表现出独特的能力，对体外形态作出反应。因此，这些细胞是一个强大的工具，用以检查推动早期人类发展的机制。我们开发了一种方法，在符合要求的基质的密闭菌落体中培养人类胚胎干细胞，以控制菌落的几何及其机械环境，以便重新概括物理参数，胚胎发生的基础。该方法的主要特点是能够生成具有定义细胞外基质配体的形态的聚丙烯酰胺水凝胶，以促进细胞附着。这是通过制造具有所需几何图案的模具，使用这些模具在玻璃盖玻片上创建细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶中来实现的。该方法还与牵引力显微镜兼容，允许用户测量和绘制在密闭菌落区内细胞生成力的分布图。结合标准生化测定，这些测量可用于检查机械线索在早期人类发展过程中的命运规范和形态形成中的作用。

引言

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人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有很大的应用前景。这些细胞的多能性质使它们能够分化成任何成人细胞类型。虽然在将hESCs的命运引向特定细胞类型方面已经取得巨大进展，但仍然很难产生整个组织或器官，即第1、2、3、4， 5.这在很大程度上是由于对在人类发展期间推动这些组织形成的机制了解有限。为了填补这一知识空白，近年来出现了一些方法，用胚胎干细胞6、7、8、9对早期胚胎及其发育阶段进行建模。 ，10，11，12，13.

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方案

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此处描述的所有与使用 hESCs 相关的方法均已获得加州大学旧金山分校人类游戏、胚胎和干细胞研究 （GESCR） 委员会的批准。

1. 具有几何特征的硅晶圆的制备

  1. 创建具有所需几何特征的照片蒙版。使用计算机辅助绘图软件设计功能。对于负光刻，使特征不透明，蒙版的其余部分透明。
    注:对于在 18 mm 直径盖玻片上进行图案化，将每个实验条件的特征组合到 10 x 10 mm 区域，以确保步骤 3 中生成的模具适合盖玻片。
  2. 在 100 mm 硅晶片上旋转涂层负光刻胶。使用光刻胶数据表确定旋转的速度和长度，以生成 100-250 μm 的胶片厚度。
    注: 应调整胶片厚度，使图案宽度与模具高度的纵横比尽可能接近 1:1。但是，我们建议最小厚度为 100 μm，因为任何较少的模具都会产生易撕裂的精致模具。
  3. 根据产品数据表处理光刻胶。这通常涉及软烘烤、带光掩膜的外光照射、曝光后烘烤、发育和硬烘烤。例如，表1概述了用于处理该协议中使用的晶圆的过程。
    注意:处理硅片时要小心，因为它们是脆弱的。一旦生成，晶圆可以重复使用，只要它们不损坏。

2. 准备盖玻片

  1. 酸洗"顶"盖玻片的制备
    1. 将直径18毫米#1厚度盖片放入玻璃培养皿中。适当的盖玻片数量取决....

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结果

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试图在符合要求的基材上培养受控几何体中的 hESC 时，需要克服的主要挑战是在基材表面生成同质的 ECM-配体图案。此方法中提出的策略是首先在玻璃盖玻片表面生成所需的图案，然后在凝胶聚合过程中将该图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面（图1）因此，在进行水凝胶聚合和图案转移之前，必须确保在玻璃盖玻片表面成功创建所需的图案（图1B）。根据对转移到聚丙烯酰胺的荧光配体图案的成像，配体似乎只存在于聚丙烯酰胺表面的单个平面上，尽管我们没有精确描述该层的厚度。在玻璃盖玻片上观察到两种常见的缺陷类型，每种缺陷都有自己的误差源。第一种是荧光配体的外观，其范围超出所需图案的边缘（图1C，上图），由于模具中出现小撕裂或密封不足，荧光配体溶液泄漏。玻璃盖玻片的模具。第二种是出现不完整的图案（

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讨论

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为了简化一个漫长而详细的协议，此方法包括三个关键阶段:1） 在玻璃盖玻片上生成 ECM 配体图案，2） 在凝胶聚合过程中将图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶，以及 3） 在图案水凝胶。在这三个阶段中，每个阶段都必须考虑一些关键步骤。为了在玻璃盖玻上生成高保真图案，必须将模具牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且必须在向模具表面添加配体溶液后清除所有气泡（图 1C.如果配体溶液由于与盖玻片接触不良而通过模具泄漏，配体将转移到聚丙烯酰胺水凝胶的整个表面，hESCs 将不局限于所需的菌体几何形状（图4C）。将图案配体转移到聚丙烯酰胺的最重要步骤是将顶盖滑从水凝胶中轻轻分离，同时所有组件仍淹没在 PBS 中。如果水凝胶在分离过程中没有被淹没，则图案可能完全被破坏。此外，如果分离发生得太快，水凝胶的表面可能会撕裂或损坏。水凝胶越软，在分离过程中就越有损坏的风险。最后，在模式水凝胶上的 hESC 种子和培养过程中，用户在交换介质时必须非常小心移液器。hESCs 在整.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们想感谢CIRM赠款RB5-07409的资助。J.M.M.感谢FuiBoon Kai、DhruvThakar和RogerOria为指导这种方法的生成和故障排除进行的各种讨论。J.M.M.还感谢UCSF发现奖学金对他的工作的持续支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶Gibco25300054
100 mm 玻璃培养皿Fisher Scientific08-747B
100 mm 塑料培养皿Fisher ScientificFB0875712
15 mL 锥形底管Corning352095
150 mm 塑料培养皿Fisher ScientificFB0875714
18 mm直径 #1 盖玻片Thermo Scientific18CIR-1
2% 双丙烯酰胺Bio-Rad161-0142
3-氨基丙基三甲氧基硅烷ACROS 有机物313251000
40% 丙烯酰胺Bio-Rad161-0140
铝箔Fisher Scientific01-213-100
碱性成纤维细胞生长因子Sigma-AldrichF0291
漂白CloroxN/A
离心机，带摆动桶Eppendorf22623508型号：5804 R
胶原蛋白康宁354236
DessicatorFisher Scientific08-642-7
乙醇Fisher ScientificAC615095000
胎儿牛血清Gibco16000044
荧光微球Thermo ScientificF8821
镊子（用于盖玻片）Fisher Scientific16-100-122
镊子（用于晶圆）Fisher Scientific17-467-328
凝胶支架N/AN/A凝胶支架是定制的 3D 打印，可根据要求提供 CAD 图纸
戊二醛Fisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
热板Fisher ScientificHP88854100
盐酸Fisher ScientificA144S-500
异丙醇Fisher ScientificA416-500
Kimwipes（精细任务湿巾）Kimberly-Clark Professional34120
Knockout 血清替代物Gibco10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
掩模对准器（用于光刻）Karl Suss America， Inc.Karl Suss MJB3 掩模对准器
MatrigelCorning354277
显微镜 牵引力尼康N/A型号：Eclipse TE200 U
电动定位平台Prior ScientificN/A型号：HLD117
氮气AirgasNI 250
Norland 光学胶 74（紫外线固化聚合物）Norland产品NOA 74
烘箱Thermo ScientificPR305225G
封口膜（实验室胶片）Fisher Scientific13-374-12
PDMS （Sylgard 184）Fisher ScientificNC9285739
PhotomaskCAD/Art Services， Inc.N/A光掩模是定制的。可根据要求提供我们设计的 CAD 图纸
等离子清洗机Fisher ScientificNC9332171
垫片塑料Marian ChicagoHT6135
垫片塑料TAP 塑料N/A聚碳酸酯板，.01 英寸厚
氯化钾（用于制造 PBS）Fisher ScientificP217-500
磷酸二氢钾（用于制备 PBS）Fisher ScientificP285-500
过硫酸钾ACROS 有机物424185000
手术刀Fisher Scientific14-840-00
硅晶片电子显微镜科学71893-06P 型，3 英寸，硅晶片
氯化钠（用于制造 PBS）Fisher ScientificS271-1
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100
磷酸氢二钠二水合物（用于制备 PBS）Fisher ScientificS472-500
SU8-3050 光刻胶MicroChemSU8-3000
SU8-显影MicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
紫外线消毒盒Bio-RadN/ABio-Rad GS 基因接头紫外线室
Y27632（Rho 激酶抑制剂）StemCell Technologies72304
剂 剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug dis....

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