NEMO IKK绑定域的生产、结晶和结构确定
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Summary
我们描述了通过X射线晶体学测定NEMOIKK结合域的结构确定方案。这些方法包括蛋白质表达、纯化和表征，以及成功优化晶体和确定无结合形式蛋白质的结构的策略。
Abstract
NEMO 是一种脚手架蛋白，通过将 IKK 复合物与激酶 IKK® 和 IKK® 组装在 NF-+B 通路中起着至关重要的作用。激活后，IKK复合磷酸化I+B分子，导致NF-βB核易位和目标基因的激活。抑制NEMO/IKK相互作用是NF-βB通路活性调节的一种有吸引力的治疗范例，使NEMO成为抑制剂设计和发现的目标。为了便于NEMO抑制剂的发现和优化过程，我们设计了NEMO的IKK结合域的改进结构，允许以apo形式和与小分子量抑制剂结合的蛋白质的结构测定。在这里，我们介绍了用于NEMOIKK绑定域的设计、表达和结构特征化的策略。蛋白质在大肠杆菌细胞中表达，在变性条件下溶解，并通过三个色谱步骤进行纯化。我们讨论了用于结构测定的晶体获取协议，并描述了数据采集和分析策略。这些方案将广泛适用于NEMO和小分子抑制剂复合物的结构测定。
Introduction
NF-βB通路被激活，以响应各种刺激，包括细胞因子，微生物产品和压力，以调节目标基因的表达负责炎症和免疫反应，细胞死亡或生存和增殖1。包括炎症和自身免疫性疾病以及癌症2、3、4、5在内的病理学都与途径的过度激活有关，这使得NF-βB活性的调节成为开发新疗法6、7的首要目标。
规范的NF-βB通路与负责淋巴组织生成和B细胞活化的非规范通路有区别，前者依赖脚手架蛋白NEMO（NF-B必需调制器8），以组装IKK复合物与激酶IKK®和IKK®。IKK复合物负责I+B+（βB抑制剂）的磷酸化，以降解为目标，释放NF-βB二聚体，将NF-βB二聚体转移到核进行基因转录1，因此是开发调节NF-B活性抑制剂的诱人靶点。
我们的研究重点是NEMO和IKK+之间的蛋白质-蛋白质相互作用的表征，针对NEMO开发IKK复杂形成小分子抑制剂。NEMO的最小结合域，需要结合IKK®，包括残留物44-111，其结构已确定在复杂的与对应于IKK®序列701-7459的肽。NEMO 和 IKK® 形成四螺旋束，其中 NEMO 二分器将 IKK® （701-745） 的两个螺旋体容纳在具有扩展交互接口的拉长开槽中。IKK®（734-742），也称为NEMO绑定域（NBD），定义了最重要的结合热点，其中两个基本色氨酸（739，741）深埋在NEMO口袋中。复杂结构的细节有助于针对NEMO的小分子抑制剂的基于结构的设计和优化。同时，很难在NEMO中重现由在晶体中观察到的长IKK®（701-745）的基基（701-745）的结合引起的整个构象变化（即NEMO盘绕-螺旋二聚体）的完全构象变化，而未结合的NEMO或NEMO与小分子抑制剂结合的结构可能代表了基于结构的药物设计和抑制剂优化的更好目标。
全长NEMO和包含IKK绑定域的较小截断构造已经证明，通过X射线晶体学和核磁共振（NMR）方法10，在未绑定形式的结构确定中，我们设计了一个改进版本的NEMO的IKK绑定域。事实上，未绑定形式的NEMO（44-111）只是部分折叠，并经历构象交换，因此，我们设置稳定其二体结构，盘绕折叠和稳定，同时保持IKK®的绑定亲和力。通过在蛋白质的N-和C-termini上附加理想二分线圈序列11的三个七分体，以及一系列四点突变，我们产生了NEMO-EEAA，一个构造完全二分体并折叠在一个盘绕线圈中，从而挽救了IKK结合亲和力到全长NEMO12的纳米摩尔范围。作为另一个优势，我们希望盘绕式适配器（基于GCN4序列）将促进结晶，并最终通过分子替换帮助X射线结构确定。卷绕式适配器也同样被利用，既提高了稳定性，改善了溶液行为，又有利于三角线圈和抗体片段13、14的结晶。NEMO-EEAA 易于表达和纯化从Escherichia. 大肠杆菌细胞与可夹层的Histidine标签，是可溶性的，折叠在一个稳定的二分卷线圈，并易于结晶，与衍射到1.9°。GCN4有序盘绕线圈区域的存在，可进一步帮助使用GCN415的已知结构进行分子替换，从而逐步利用NEMO-EEAA晶体的数据。
鉴于使用 apo-NEMO-EEAA 获得的结果，我们相信此处描述的协议也可以应用于存在小肽（如 NBD 肽）或小分子抑制剂的 NEMO-EEAA 的结晶，目的是了解 NEMO 抑制的要求以及初始铅抑制剂对高亲和力的基于结构的优化。鉴于许多盘绕域的可塑性和动态性16，使用盘绕式适配器在帮助结构确定方面可以发现更普遍的适用性。
Protocol
1. 晶体学构造设计 使用T7启动子在大肠杆菌中表达的载体中克隆NEMO-EEAA序列，包括N端六核-histidine标记和蛋白酶裂解位点。注：在此协议中，我们使用经过修改的载体，包括N端六角体-赫丁标记和烟草蚀刻病毒（TEV）裂解位10。该载体促进蛋白质结晶的He标记的裂解，在所需蛋白质序列开始之前只留下GSW残留物的短暂延伸。从中派生该的矢量和替代矢量列在”材料表”中。在此协议中，对原始NEMO（44-111）序列的后续修改是逐步引入的，如前10所述，使用侧定向诱变。我们最初试图将 NEMO 盘绕线圈的二分器固定到 N 端或 C 端，以应用理想的盘绕线圈适配器（长度至少为三个七分之子）。或两者。双盘线圈是早期结晶试验中最有前途的，后来它被修改引入突变，以改善结晶，如前12所述。 2. 大规模表达他的6标记NEMO-EEAA 将结构转换为 BL21（DE3） 称职单元。储存在-80°C作为电池甘油库存。 第 1 天 – 准备细胞启动培养。在125 mL Erlenmeyer 烧瓶中，加入 20 mL 的极棒溴溶液和 20 μL 的 100 mg/mL 阿比西林库存。加入几微升的细胞甘油库存（从-80°C储存BL21（DE3）的能型细胞与载体转化）。 在 37°C、220 rpm（约 15 小时）下摇动 10 mL 起动机培养基。 第 2 天 – 从起动机，稀释到 OD600 = 0.1 在 250 mL 的神奇兄弟。将安西林添加到100μg/mL的最终浓度中。增长到 OD600 = 0.8-1.0。 将等丙基β-D-1-硫丙酮（IPTG）加入500μM，在37°C下生长4小时。 测量 4 小时后诱导培养的 OD600。 3. 净化他的6标记NEMO-EEAA 在4°C下以3，800 x g旋转细胞培养20分钟。 保存细胞颗粒并丢弃培养基。注：此时，细胞颗粒可以保存并储存在-20°C，以便以后进行纯化。 在含有20mM Tris、150 mM NaCl、10 mM Imidazole、2 mM MgCl 2、0.5m mm苯基硫磺酸氟化物、2 mM二硫磷醇（DTT）和3 μL的苯甲酸核酸酶的40 mL裂解缓冲液中重新悬浮细胞。注：镍固定金属电亲色谱（IMAC）柱与2 mM DTT兼容。或者，可以使用 0.2 mM 三元（2 瓶环乙）磷脂 （TCEP）。 将重新悬浮的细胞拆分为两个 20-25 mL 等分。 使用法国压榨机（约压力25，000 psi）对细胞进行释放，每个等分重复2-3次（在冷藏室）。注：或者，细胞可以通过声波进行分发（未在本协议中测试）。 将尿素添加到细胞解糖中，最终浓度为8 M，允许在摇动平台上孵育至少2小时或过夜。除透析外，可在室温下执行此和所有以下纯化步骤。 第3天 – 将莱沙转移到超离心管并平衡重量，确保莱沙液填充管至少满3/4。在 25°C 下以 125，000 x g旋转莱沙45分钟。将上清液放入 100 mL 烧杯中，以装载到柱上。注：在4°C下离心会导致尿素崩溃。 在快速液相色谱系统上，以 5 mL/min 的速度从 IMAC 5 mL 柱中去除 25 mL 超纯 H2O 的乙醇， 其次是25 mL的洗脱缓冲液，含有20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0，然后是 25 mL 的装订缓冲液，包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM DMIDazole、2 mM DTT、8M 尿素、pH 8.0。 将尿素以3 mL/min的孵育物加载到IMAC柱上，收集流过。以 3 mL/min 的装订缓冲器清洗 10 列卷的列。 在柱上重新折叠 NEMO-EEAA 结构，通过以 3 mL/min 的速度用重新折叠缓冲液重新折叠 20 列体积的列，包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0。 在 12 列体积梯度上执行 NEMO-EEAA 的梯度洗脱，从 10 到 500 mM Imidazole，在分数收集板（1 mL 分数）中收集所有洗脱液。 继续在 500 mM imidazole 下为两列卷洗脱，继续收集。 运行硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的分数，以确定NEMO-EEAA在洗脱馏分中的存在。注：我们使用10%丙烯酰胺，MES缓冲液。 含有纯靶蛋白的池分数。 通过布拉德福德测定17测量蛋白质浓度。注：这是估计标记裂解蛋白酶量所必需的。 4. 他的6标签裂解和纯化 在TEV：NEMO-EEAA蛋白的1：10重量比中加入TEV，以割下他的6个标签。TEV蛋白酶在室内被净化。注：分别优化完全裂解所需的TEV量、时间和温度。 特快TEV蛋白酶，S219V突变体18在BL21（DE3）-RIL细胞和纯化如前19所述。如步骤 2 所述，通过法国印刷机短暂生长细胞，并使用 IMAC 列进行纯化。将最终蛋白质储存在25 mM磷酸钠缓冲液中，pH 7.8，150 mM NaCl，1 mM EDTA，2 mM DTT，20%v/v甘油。 在 4 L 的 20 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中对样品进行一夜（约 15 小时）的透析，以允许裂解并去除样品中多余的 imidazole，以便随后进行纯化。 第4天 – 从透析中取出样品。运行来自 TEV 裂解的样品的 SDS-PAGE 凝胶，以确保裂解完成。 在快速液相色谱系统上，以 5 mL/min 的速度从 IMAC 5 mL 柱中取出 25 mL 超纯 H2O 的乙醇， 其次是25 mL的洗脱缓冲液，包含20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0，然后是包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0 的装订缓冲液。 使用 TEV 切碎的 NEMO-EEAa 以 1 mL/min 的速度加载列。割取的NEMO-EEAA在流中会洗去：收集在96孔分数收集板（1 mL分数）。以 1 mL/min 的速度清洗 5 列卷的 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole，继续收集分数收集板。 Elute TEV 和清洁他的6-NEMO-EEAA 与三列卷 20 mM Tris， 150 mM NaCl， 500 mM imidazole， 2 mM DTT， pH 8.0， 收集 50 mL 烧瓶的洗脱. 运行流通分数的 SDS-PAGE 凝胶，以确定存在已割的 NEMO-EEAA。 池流通过分数包含切合的NEMO-EEAA结构，并使用搅拌细胞浓缩器浓缩至5 mL。膜分子量切断（MWCO） = 3 kDa。 使用 3 kDa MWCO 膜，在 2 L 的 20 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中进行透析浓缩样品，2 小时。 第 5 天 – 在尺寸排除色谱 （SEC） 16 mm x 60 cm 柱（34 μm 平均颗粒大小）上加载 5 mL 的直径样品，在 2 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中以 1 mL/min 的速度加载。根据样本量，对其他列重复上述步骤。 汇集与二分位 NEMO-EEAA 对应的分数。注：NEMO-EEAA洗脱在60-65 mL之间，对应于更大的分子量蛋白质，由于二分线圈的细长性质。 使用搅拌细胞浓缩器和MWCO = 3 kDa膜浓缩，最终浓度为113 μM（1.65 mg/mL）。 将蛋白质与储存在4°C（稳定1个月以上）处。 5. 稀疏矩阵筛选 注：该协议使用市售屏幕进行结晶试验，并使用结晶机器人设置坐落实验。晶体图像由成像器自动收集。 使用市售的稀疏基质筛（见材料表），移液器60μL的稀疏基质溶液进入2滴腔结晶板的96口井中的每一口，用于坐式滴蒸汽扩散（储液）。 使用机器人滴定器，以1.65mg/mL的比例以1.65mg/mL分配100 nL的蛋白质溶液，在滴1中分配储液溶液，最终体积为200 nL;然后66 nL的蛋白质溶液与134 nL的储液罐溶液，最终体积为200 nL，滴2（1：2比率）。 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。注：如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。 将托盘储存在结晶成像器存储处，温度为 20°C，检查自动收集的图像是否存在晶体，两天后开始。注：结晶筛选与构造优化同时进行。初始晶体在以下条件下形成（材料表中列出的商业屏幕）：a） 0.1M Tris， pH 8.0， 30 % v/v 聚乙烯乙二醇 （PEG） MME 550， 5% 聚α-谷氨酸， 200-400 kDa 低分子量聚合物 （PGA-LM）;b） 0.1 M Tris， pH 7.8， 20% w PEG MME 2k， 5% PGA-LM;c） 0.1 M Tris，pH 7.8，20% 带 PEG 3350，5% PGA-LM。稀疏矩阵屏幕晶体的晶格均匀性较差;因此，使用交叉极化成像，它们看起来会很差。使用紫外线成像确保晶体中含有蛋白质。获得最终衍射质量晶体所需的种子库生成步骤如下。 6. 种子库存生成 注：我们可重新获得0.1M Tris pH 8.0、5%PGA-LM、3.6% w/v PEG 20k 的种子生成晶体。然而，晶体将表现出高镶嵌性，不适合在此阶段收集数据。 使用种子生成试剂盒，用晶体移液，将整个滴液移出整个滴，并将50μL的结晶条件溶液放入提供的小瓶中，从而准备种子库存。 涡旋种子股票3分钟，脉冲20秒和10秒关闭。 以 1：10 的增量连续稀释种子库存，以 1：10，000 递增。将所有稀释液储存在 4°C 下，以便进一步使用。 7. 精细屏幕 设计精细的屏幕，改变 Tris、PGA-LM 和 PEG 的条件。不同/PEG 长度，适用于单个托盘。注：用于NEMO-EEAA结构测定的晶体的精细屏幕采用以下条件：0.1M Tris pH 8;在 1-12 列中，PGA-LM 从 8 到 0% 不等。A-H行筛选了不同的PEG，浓度在列1-12中变化如下。A： PEG 200 （0-40% v/v）;B： PEG 400 （0-40% v/v）;C： PEG MME 500 （0-40% v/v）;D： PEG 1000 （0-30% w/v）;E： PEG 3350 （0-30% w/v）;F： PEG 6k （0-30% w/v）;G： PEG 10k （0-20% w/v）;H： PEG 20k （0-20% w/v）。晶体出现在井 H4 中（5.45% w/v PEG 20k，5.8% w/v PGA-LM）。在此协议中，使用蛋白质晶体学屏幕构建器液体处理程序来构建屏幕。 种子蛋白库存在1：25体积比为1：1，000种子稀释。注：NEMO-EEAA的浓度将略有下降，但晶体仍然会形成。 重复步骤 2 使用 1：10，000 种子稀释，相同的 1：25 体积比。 使用滴定器，以1.65mg/mL分配100 nL的蛋白质溶液，将种子库存稀释1：1，000，以1：1的比例与储层溶液在滴1中，最终体积为200 nL。重复下降2，但与1：10，000稀释种子库存存在。 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。注：如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。 将托盘存储在成像器存储处，温度为 20°C，检查两天后收集的图像是否存在晶体。 使用交叉偏振成像仪检查晶体的晶格均匀性，以选择单一条件设置以下托盘。 8. 生成用于数据收集的晶体 在 Tris、PGA-LM 和 PEG 条件周围设计单一条件屏幕，通过交叉极化图像分析，生成均匀的晶体，并生成可能的最大晶体。注：这些条件下的晶体形状不规则，大部分是矩形薄片。选择晶体边缘定义良好且厚度可能最大的条件至关重要。 手工制作20 mL的结晶条件。 使用多通道移液器，在 2 个滴腔、96 孔结晶板中每孔分配 60 μL，用于坐式滴蒸汽扩散。 按照步骤 6.2 中所述准备种子库。 如步骤 6.3 所述分配蛋白质。 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。注：如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。 将托盘以 20°C 的温度存储在成像器中，并每天检查图像是否存在晶体。 检查晶体的交叉极化图像的晶格均匀性，选择晶体进行数据收集。 9. 低温保护剂的测定 要测试低温保护剂，请创建与结晶条件相对应的库存溶液，但每个组分的浓度分别高 30%、20%、10% 和 5%。加入低温保护剂体积将导致与结晶条件相同的组件的最终浓度。注：对于在 0.1 M Tris 结晶条件下以 30% 浓度测试低温保护剂，从 0.143 M Tris 的库存溶液开始，然后再添加低温保护剂。 通过低温试剂试剂试剂盒，通过在 70% 的结晶条件库存溶液中按低温条件体积混合 30% 的低温条件，创建 10 μL 的样品，在原始结晶条件下最终浓度为 30% 低温保护剂。彻底混合。 使用 10 μL 移液器，采用 5 μL 的测试低温保护溶液，并将移液器尖端放入液氮中。如果观察到冰，丢弃。 以 30% 的检测速度测试所有低温保护剂。对于成功的解决方案，重复20%，然后10%和5%的低温保护剂。 利用成功的低温保护溶液，具有最小百分比的低温保护剂，在存在晶体的测试液中加入0.5 μL溶液。观察显微镜下，定时晶体在条件中持续多长时间，如果不是无限期的话。注：这些晶体仅用于测试，将被丢弃。对于NEMO-EEAA，12%1，2-丙二醇是最佳的低温保护剂溶液。12% 占稀释低温保护剂溶液将体验到晶体滴约 100 nL， 为大约 1，2- 丙二醇 10% 的最终浓度. 10. 水晶循环 在运送到同步加速器前1-2天循环晶体。注：晶体直径约为60-100微米：0.05~0.10毫米环是循环的理想选择。 把胶带从井顶切下来。 将含有12%1，2-丙烯醇的结晶溶液的0.5 μL直接添加到井中。注：由于100 nL的滴液稀释，1，2-丙狄醇的最终浓度现在约为10%（由于蒸汽扩散，从最初的200 nL开始减少近似滴量）。 从井中循环晶体。注：晶体通常生长在井底，但会从环轻轻轻推后脱落。一旦脱落，循环。 将含有低温循环的晶体储存在浸入液体N2的冰球中。 将这些圆盘储存在德瓦尔烧瓶中的液体N2中，直到它们准备好在同步加速器上装运X射线衍射。 11. 数据收集 收集 X 射线衍射数据。在此协议中，使用 AMX 光束线 （ID： 17-ID-1），国家同步辐射光源 II。注：数据是在现场收集的，但可以远程收集。在交叉极化图像中显示晶格均匀性的晶体区域收集数据。将晶体放置在循环中，以便数据收集不涉及晶体的”差”区域，而晶体在测速仪中旋转。提供最佳分辨率的数据来自在晶体扩展的边缘收集约 5 x 5 μm 大小。使用栅格识别晶体上的最佳区域以收集20。 12. X射线数据处理 使用 XDS IDXREF 程序将数据集处理为最高分辨率（1.8 Ω），以确定空间组、单元单元和溶剂含量。 使用 XDS 集成程序集成数据。 使用 STARANISO 服务器从 XDS XSCALE 程序进行过程缩放强度，对数据的衍射极限表面使用 I/μI 截止平均值 1.2。注： 数据不会以真正的椭圆体剪切。保留高于 I/+I 的 1.2 截止点以上的所有数据。由于非球形截断，计算为球形完整性的数据的统计信息较差。椭圆完整性为 88%，最高分辨率分别为：1.88 Ω、2.10 Ω 和 2.55 Ω 沿 a+、b+ 和 c 轴。 13. 结构解决方案 利用GCN4的X射线结构（PDB：4DMD）15作为分子替换的搜索模型，在PHENIX22中使用MRage21。4DMD 结构在 MRage 中被定义为”集合”，MRage 解决方案成功地构建了与 NEMO-EEAA 的 N 端线圈适配器相对应的结构部分，与搜索模型相同，适用于二分器中的两个链。注：在 PHASER 中关闭各向异性校正，否则数据将进一步缩减。 利用在PHENIX和手动建筑（使用2Fo-Fc和Fo-Fc映射，在库特24）中连续的自动构建23来构建结构的其余部分。 使用库特24，使用库特24将仍然缺失的残留物手动构建到模型中，基于2Fo-Fc和Fo-Fc映射。注：最后阶段涉及为每个单体构建 4 个 N 端子残留物和 4 个 C 端子残留物。侧链放置也根据需要手动调整。 使用 PHENIX 计算复合省略映射，并省略结构 10%。 14. 结构改进 使用”凤凰”优化优化结构。针对散装溶剂和立体化学权重运行初始细化，将 RMSbond 和 RMSangle 约束分别放宽到 0.01 和 1.0。继续改进单个 B 因子、TLS 参数和占用。
Representative Results
NEMO IKK结合域的克隆、表达和纯化。本研究中遵循的协议获得NEMO-EEAA的最终序列（图1A），它产生衍射质量晶体，涉及所有中间结构的表达和表征，包括在N和或C-终点站添加线圈适配器，突变C76A，C95S和突变E56A，E57A。图1B显示了在整个纯化过程中收集的样品的SDS-PAGE凝胶，如图1C</strong…
Discussion
NEMO在未绑定形式的结晶尝试没有成功，包括使用全长蛋白质的尝试和包括IKK结合域的几种截断结构。我们对NEMO的IKK结合域（残留物44-111）的生物物理表征，通过循环双色、NMR光谱和荧光各向异性表明，该结构，尽管能够结合IKK®，但存在于一种构象交换状态，不适合结晶9，10。我们的方法涉及设计 NEMO 的 IKK 绑定域，该域采用更稳定、折叠和原生样的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢D.Madden教授在整个项目中进行了许多有益的讨论。我们感谢D.Bolon教授赠送含有优化的GCN4线圈的质粒。我们感谢郭博士的NEMO质粒。我们感谢克里斯蒂娜·阿诺迪、塔马尔·巴西亚什维利和艾米·肯尼迪演示了这个程序。我们感谢达特茅斯生物晶体学核心设施以及化学、生物化学和细胞生物学系对晶体成像设备的使用，并感谢 BioMT 人员的支持。这项研究使用了国家同步辐射光源II的AMX光束线，这是美国能源部（DOE）科学用户设施办公室，由布鲁克黑文国家实验室根据合同号为能源能源科学办公室运营。DE-SC0012704。我们感谢NSLS II的工作人员的支持。这项工作由NIH赠款R03AR066130、R01GM133844、R35GM128663和P20GM1131332以及Munck-Pfefferkorn小说和互动赠款资助。
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
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Cite This Article
Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).