NEMO IKK绑定域的生产、结晶和结构确定

Summary

我们描述了通过X射线晶体学测定NEMOIKK结合域的结构确定方案。这些方法包括蛋白质表达、纯化和表征，以及成功优化晶体和确定无结合形式蛋白质的结构的策略。

Abstract

NEMO 是一种脚手架蛋白，通过将 IKK 复合物与激酶 IKK® 和 IKK® 组装在 NF-+B 通路中起着至关重要的作用。激活后，IKK复合磷酸化I+B分子，导致NF-βB核易位和目标基因的激活。抑制NEMO/IKK相互作用是NF-βB通路活性调节的一种有吸引力的治疗范例，使NEMO成为抑制剂设计和发现的目标。为了便于NEMO抑制剂的发现和优化过程，我们设计了NEMO的IKK结合域的改进结构，允许以apo形式和与小分子量抑制剂结合的蛋白质的结构测定。在这里，我们介绍了用于NEMOIKK绑定域的设计、表达和结构特征化的策略。蛋白质在大肠杆菌细胞中表达，在变性条件下溶解，并通过三个色谱步骤进行纯化。我们讨论了用于结构测定的晶体获取协议，并描述了数据采集和分析策略。这些方案将广泛适用于NEMO和小分子抑制剂复合物的结构测定。

Introduction

NF-βB通路被激活，以响应各种刺激，包括细胞因子，微生物产品和压力，以调节目标基因的表达负责炎症和免疫反应，细胞死亡或生存和增殖^1。包括炎症和自身免疫性疾病以及癌症^{2、3、4、5}在内的病理学都与途径的过度激活有关，这使得NF-βB活性的调节成为开发新疗法^6、7的首要目标。

规范的NF-βB通路与负责淋巴组织生成和B细胞活化的非规范通路有区别，前者依赖脚手架蛋白NEMO（NF-B必需调制器^8），以组装IKK复合物与激酶IKK®和IKK®。IKK复合物负责I+B+（βB抑制剂）的磷酸化，以降解为目标，释放NF-βB二聚体，将NF-βB二聚体转移到核进行基因转录^1，因此是开发调节NF-B活性抑制剂的诱人靶点。

我们的研究重点是NEMO和IKK+之间的蛋白质-蛋白质相互作用的表征，针对NEMO开发IKK复杂形成小分子抑制剂。NEMO的最小结合域，需要结合IKK®，包括残留物44-111，其结构已确定在复杂的与对应于IKK®序列701-745⁹的肽。NEMO 和 IKK® 形成四螺旋束，其中 NEMO 二分器将 IKK® （701-745） 的两个螺旋体容纳在具有扩展交互接口的拉长开槽中。IKK®（734-742），也称为NEMO绑定域（NBD），定义了最重要的结合热点，其中两个基本色氨酸（739，741）深埋在NEMO口袋中。复杂结构的细节有助于针对NEMO的小分子抑制剂的基于结构的设计和优化。同时，很难在NEMO中重现由在晶体中观察到的长IKK®（701-745）的基基（701-745）的结合引起的整个构象变化（即NEMO盘绕-螺旋二聚体）的完全构象变化，而未结合的NEMO或NEMO与小分子抑制剂结合的结构可能代表了基于结构的药物设计和抑制剂优化的更好目标。

全长NEMO和包含IKK绑定域的较小截断构造已经证明，通过X射线晶体学和核磁共振（NMR）方法^10，在未绑定形式的结构确定中，我们设计了一个改进版本的NEMO的IKK绑定域。事实上，未绑定形式的NEMO（44-111）只是部分折叠，并经历构象交换，因此，我们设置稳定其二体结构，盘绕折叠和稳定，同时保持IKK®的绑定亲和力。通过在蛋白质的N-和C-termini上附加理想二分线圈序列¹¹的三个七分体，以及一系列四点突变，我们产生了NEMO-EEAA，一个构造完全二分体并折叠在一个盘绕线圈中，从而挽救了IKK结合亲和力到全长NEMO¹²的纳米摩尔范围。作为另一个优势，我们希望盘绕式适配器（基于GCN4序列）将促进结晶，并最终通过分子替换帮助X射线结构确定。卷绕式适配器也同样被利用，既提高了稳定性，改善了溶液行为，又有利于三角线圈和抗体片段^13、14的结晶。NEMO-EEAA 易于表达和纯化从Escherichia. 大肠杆菌细胞与可夹层的Histidine标签，是可溶性的，折叠在一个稳定的二分卷线圈，并易于结晶，与衍射到1.9°。GCN4有序盘绕线圈区域的存在，可进一步帮助使用GCN4¹⁵的已知结构进行分子替换，从而逐步利用NEMO-EEAA晶体的数据。

鉴于使用 apo-NEMO-EEAA 获得的结果，我们相信此处描述的协议也可以应用于存在小肽（如 NBD 肽）或小分子抑制剂的 NEMO-EEAA 的结晶，目的是了解 NEMO 抑制的要求以及初始铅抑制剂对高亲和力的基于结构的优化。鉴于许多盘绕域的可塑性和动态性^16，使用盘绕式适配器在帮助结构确定方面可以发现更普遍的适用性。

Protocol

1. 晶体学构造设计

1. 使用T7启动子在大肠杆菌中表达的^{载体中克隆}NEMO-EEAA序列，包括N端六核-histidine标记和蛋白酶裂解位点。
   注:在此协议中，我们使用经过修改的载体，包括N端六角体-赫丁标记和烟草蚀刻病毒（TEV）裂解位^10。该载体促进蛋白质结晶的He标记的裂解，在所需蛋白质序列开始之前只留下GSW残留物的短暂延伸。从中派生该的矢量和替代矢量列在"材料表"中。在此协议中，对原始NEMO（44-111）序列的后续修改是逐步引入的，如前¹⁰所述，使用侧定向诱变。我们最初试图将 NEMO 盘绕线圈的二分器固定到 N 端或 C 端，以应用理想的盘绕线圈适配器（长度至少为三个七分之子）。或两者。双盘线圈是早期结晶试验中最有前途的，后来它被修改引入突变，以改善结晶，如前¹²所述。

2. 大规模表达他的₆标记NEMO-EEAA

1. 将结构转换为 BL21（DE3） 称职单元。储存在-80°C作为电池甘油库存。
2. 第 1 天 – 准备细胞启动培养。在125 mL Erlenmeyer 烧瓶中，加入 20 mL 的极棒溴溶液和 20 μL 的 100 mg/mL 阿比西林库存。加入几微升的细胞甘油库存（从-80°C储存BL21（DE3）的能型细胞与载体转化）。
3. 在 37°C、220 rpm（约 15 小时）下摇动 10 mL 起动机培养基。
4. 第 2 天 – 从起动机，稀释到 OD₆₀₀ = 0.1 在 250 mL 的神奇兄弟。将安西林添加到100μg/mL的最终浓度中。增长到 OD₆₀₀ = 0.8-1.0。
   1. 将等丙基β-D-1-硫丙酮（IPTG）加入500μM，在37°C下生长4小时。
   2. 测量 4 小时后诱导培养的 OD_600。

3. 净化他的₆标记NEMO-EEAA

1. 在4°C下以3，800 x g旋转细胞培养20分钟。
2. 保存细胞颗粒并丢弃培养基。
   注:此时，细胞颗粒可以保存并储存在-20°C，以便以后进行纯化。
3. 在含有20mM Tris、150 mM NaCl、10 mM Imidazole、2 mM MgCl 2、0.5m mm苯基硫磺酸氟化物、2 mM二硫磷醇（DTT）和3 μL的苯甲酸核酸酶的40 mL裂解缓冲液中重新悬浮细胞。
   注:镍固定金属电亲色谱（IMAC）柱与2 mM DTT兼容。或者，可以使用 0.2 mM 三元（2 瓶环乙）磷脂 （TCEP）。
4. 将重新悬浮的细胞拆分为两个 20-25 mL 等分。
5. 使用法国压榨机（约压力25，000 psi）对细胞进行释放，每个等分重复2-3次（在冷藏室）。
   注:或者，细胞可以通过声波进行分发（未在本协议中测试）。
6. 将尿素添加到细胞解糖中，最终浓度为8 M，允许在摇动平台上孵育至少2小时或过夜。除透析外，可在室温下执行此和所有以下纯化步骤。
7. 第3天 – 将莱沙转移到超离心管并平衡重量，确保莱沙液填充管至少满3/4。在 25°C 下以 125，000 x g旋转莱沙45分钟。将上清液放入 100 mL 烧杯中，以装载到柱上。
   注:在4°C下离心会导致尿素崩溃。
8. 在快速液相色谱系统上，以 5 mL/min 的速度从 IMAC 5 mL 柱中去除 25 mL 超纯 H₂O 的乙醇， 其次是25 mL的洗脱缓冲液，含有20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0，然后是 25 mL 的装订缓冲液，包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM DMIDazole、2 mM DTT、8M 尿素、pH 8.0。
9. 将尿素以3 mL/min的孵育物加载到IMAC柱上，收集流过。以 3 mL/min 的装订缓冲器清洗 10 列卷的列。
10. 在柱上重新折叠 NEMO-EEAA 结构，通过以 3 mL/min 的速度用重新折叠缓冲液重新折叠 20 列体积的列，包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0。
11. 在 12 列体积梯度上执行 NEMO-EEAA 的梯度洗脱，从 10 到 500 mM Imidazole，在分数收集板（1 mL 分数）中收集所有洗脱液。
12. 继续在 500 mM imidazole 下为两列卷洗脱，继续收集。
13. 运行硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的分数，以确定NEMO-EEAA在洗脱馏分中的存在。
    注:我们使用10%丙烯酰胺，MES缓冲液。
14. 含有纯靶蛋白的池分数。
15. 通过布拉德福德测定¹⁷测量蛋白质浓度。
    注:这是估计标记裂解蛋白酶量所必需的。

4. 他的₆标签裂解和纯化

1. 在TEV:NEMO-EEAA蛋白的1:10重量比中加入TEV，以割下他的₆个标签。TEV蛋白酶在室内被净化。
   注:分别优化完全裂解所需的TEV量、时间和温度。
   1. 特快TEV蛋白酶，S219V突变^体18在BL21（DE3）-RIL细胞和纯化如前¹⁹所述。如步骤 2 所述，通过法国印刷机短暂生长细胞，并使用 IMAC 列进行纯化。将最终蛋白质储存在25 mM磷酸钠缓冲液中，pH 7.8，150 mM NaCl，1 mM EDTA，2 mM DTT，20%v/v甘油。
2. 在 4 L 的 20 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中对样品进行一夜（约 15 小时）的透析，以允许裂解并去除样品中多余的 imidazole，以便随后进行纯化。
3. 第4天 – 从透析中取出样品。运行来自 TEV 裂解的样品的 SDS-PAGE 凝胶，以确保裂解完成。
4. 在快速液相色谱系统上，以 5 mL/min 的速度从 IMAC 5 mL 柱中取出 25 mL 超纯 H₂O 的乙醇， 其次是25 mL的洗脱缓冲液，包含20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0，然后是包含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole、2 mM DTT、pH 8.0 的装订缓冲液。
5. 使用 TEV 切碎的 NEMO-EEAa 以 1 mL/min 的速度加载列。割取的NEMO-EEAA在流中会洗去:收集在96孔分数收集板（1 mL分数）。以 1 mL/min 的速度清洗 5 列卷的 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM imidazole，继续收集分数收集板。
6. Elute TEV 和清洁他的₆-NEMO-EEAA 与三列卷 20 mM Tris， 150 mM NaCl， 500 mM imidazole， 2 mM DTT， pH 8.0， 收集 50 mL 烧瓶的洗脱.
7. 运行流通分数的 SDS-PAGE 凝胶，以确定存在已割的 NEMO-EEAA。
8. 池流通过分数包含切合的NEMO-EEAA结构，并使用搅拌细胞浓缩器浓缩至5 mL。膜分子量切断（MWCO） = 3 kDa。
9. 使用 3 kDa MWCO 膜，在 2 L 的 20 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中进行透析浓缩样品，2 小时。
10. 第 5 天 – 在尺寸排除色谱 （SEC） 16 mm x 60 cm 柱（34 μm 平均颗粒大小）上加载 5 mL 的直径样品，在 2 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 中以 1 mL/min 的速度加载。根据样本量，对其他列重复上述步骤。
11. 汇集与二分位 NEMO-EEAA 对应的分数。
    注:NEMO-EEAA洗脱在60-65 mL之间，对应于更大的分子量蛋白质，由于二分线圈的细长性质。
12. 使用搅拌细胞浓缩器和MWCO = 3 kDa膜浓缩，最终浓度为113 μM（1.65 mg/mL）。
13. 将蛋白质与储存在4°C（稳定1个月以上）处。

5. 稀疏矩阵筛选

注:该协议使用市售屏幕进行结晶试验，并使用结晶机器人设置坐落实验。晶体图像由成像器自动收集。

1. 使用市售的稀疏基质筛（见材料表），移液器60μL的稀疏基质溶液进入2滴腔结晶板的96口井中的每一口，用于坐式滴蒸汽扩散（储液）。
2. 使用机器人滴定器，以1.65mg/mL的比例以1.65mg/mL分配100 nL的蛋白质溶液，在滴1中分配储液溶液，最终体积为200 nL;然后66 nL的蛋白质溶液与134 nL的储液罐溶液，最终体积为200 nL，滴2（1:2比率）。
3. 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。
   注:如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。
4. 将托盘储存在结晶成像器存储处，温度为 20°C，检查自动收集的图像是否存在晶体，两天后开始。
   注:结晶筛选与构造优化同时进行。初始晶体在以下条件下形成（材料表中列出的商业屏幕）:a） 0.1M Tris， pH 8.0， 30 % v/v 聚乙烯乙二醇 （PEG） MME 550， 5% 聚α-谷氨酸， 200-400 kDa 低分子量聚合物 （PGA-LM）;b） 0.1 M Tris， pH 7.8， 20% w PEG MME 2k， 5% PGA-LM;c） 0.1 M Tris，pH 7.8，20% 带 PEG 3350，5% PGA-LM。稀疏矩阵屏幕晶体的晶格均匀性较差;因此，使用交叉极化成像，它们看起来会很差。使用紫外线成像确保晶体中含有蛋白质。获得最终衍射质量晶体所需的种子库生成步骤如下。

6. 种子库存生成

注:我们可重新获得0.1M Tris pH 8.0、5%PGA-LM、3.6% w/v PEG 20k 的种子生成晶体。然而，晶体将表现出高镶嵌性，不适合在此阶段收集数据。

1. 使用种子生成试剂盒，用晶体移液，将整个滴液移出整个滴，并将50μL的结晶条件溶液放入提供的小瓶中，从而准备种子库存。
2. 涡旋种子股票3分钟，脉冲20秒和10秒关闭。
3. 以 1:10 的增量连续稀释种子库存，以 1:10，000 递增。将所有稀释液储存在 4°C 下，以便进一步使用。

7. 精细屏幕

1. 设计精细的屏幕，改变 Tris、PGA-LM 和 PEG 的条件。不同/PEG 长度，适用于单个托盘。
   注:用于NEMO-EEAA结构测定的晶体的精细屏幕采用以下条件:0.1M Tris pH 8;在 1-12 列中，PGA-LM 从 8 到 0% 不等。A-H行筛选了不同的PEG，浓度在列1-12中变化如下。A: PEG 200 （0-40% v/v）;B: PEG 400 （0-40% v/v）;C: PEG MME 500 （0-40% v/v）;D: PEG 1000 （0-30% w/v）;E: PEG 3350 （0-30% w/v）;F: PEG 6k （0-30% w/v）;G: PEG 10k （0-20% w/v）;H: PEG 20k （0-20% w/v）。晶体出现在井 H4 中（5.45% w/v PEG 20k，5.8% w/v PGA-LM）。在此协议中，使用蛋白质晶体学屏幕构建器液体处理程序来构建屏幕。
2. 种子蛋白库存在1:25体积比为1:1，000种子稀释。
   注:NEMO-EEAA的浓度将略有下降，但晶体仍然会形成。
3. 重复步骤 2 使用 1:10，000 种子稀释，相同的 1:25 体积比。
4. 使用滴定器，以1.65mg/mL分配100 nL的蛋白质溶液，将种子库存稀释1:1，000，以1:1的比例与储层溶液在滴1中，最终体积为200 nL。重复下降2，但与1:10，000稀释种子库存存在。
5. 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。
   注:如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。
6. 将托盘存储在成像器存储处，温度为 20°C，检查两天后收集的图像是否存在晶体。
7. 使用交叉偏振成像仪检查晶体的晶格均匀性，以选择单一条件设置以下托盘。

8. 生成用于数据收集的晶体

1. 在 Tris、PGA-LM 和 PEG 条件周围设计单一条件屏幕，通过交叉极化图像分析，生成均匀的晶体，并生成可能的最大晶体。
   注:这些条件下的晶体形状不规则，大部分是矩形薄片。选择晶体边缘定义良好且厚度可能最大的条件至关重要。
2. 手工制作20 mL的结晶条件。
3. 使用多通道移液器，在 2 个滴腔、96 孔结晶板中每孔分配 60 μL，用于坐式滴蒸汽扩散。
4. 按照步骤 6.2 中所述准备种子库。
5. 如步骤 6.3 所述分配蛋白质。
6. 点胶后立即使用 3 英寸宽的密封胶带密封板。
   注:如果暴露在大气中超过2-3分钟，滴液将干涸。
7. 将托盘以 20°C 的温度存储在成像器中，并每天检查图像是否存在晶体。
8. 检查晶体的交叉极化图像的晶格均匀性，选择晶体进行数据收集。

9. 低温保护剂的测定

1. 要测试低温保护剂，请创建与结晶条件相对应的库存溶液，但每个组分的浓度分别高 30%、20%、10% 和 5%。加入低温保护剂体积将导致与结晶条件相同的组件的最终浓度。
   注:对于在 0.1 M Tris 结晶条件下以 30% 浓度测试低温保护剂，从 0.143 M Tris 的库存溶液开始，然后再添加低温保护剂。
2. 通过低温试剂试剂试剂盒，通过在 70% 的结晶条件库存溶液中按低温条件体积混合 30% 的低温条件，创建 10 μL 的样品，在原始结晶条件下最终浓度为 30% 低温保护剂。彻底混合。
   1. 使用 10 μL 移液器，采用 5 μL 的测试低温保护溶液，并将移液器尖端放入液氮中。如果观察到冰，丢弃。
   2. 以 30% 的检测速度测试所有低温保护剂。对于成功的解决方案，重复20%，然后10%和5%的低温保护剂。
   3. 利用成功的低温保护溶液，具有最小百分比的低温保护剂，在存在晶体的测试液中加入0.5 μL溶液。观察显微镜下，定时晶体在条件中持续多长时间，如果不是无限期的话。
      注:这些晶体仅用于测试，将被丢弃。对于NEMO-EEAA，12%1，2-丙二醇是最佳的低温保护剂溶液。12% 占稀释低温保护剂溶液将体验到晶体滴约 100 nL， 为大约 1，2- 丙二醇 10% 的最终浓度.

10. 水晶循环

1. 在运送到同步加速器前1-2天循环晶体。
   注:晶体直径约为60-100微米:0.05~0.10毫米环是循环的理想选择。
2. 把胶带从井顶切下来。
3. 将含有12%1，2-丙烯醇的结晶溶液的0.5 μL直接添加到井中。
   注:由于100 nL的滴液稀释，1，2-丙狄醇的最终浓度现在约为10%（由于蒸汽扩散，从最初的200 nL开始减少近似滴量）。
4. 从井中循环晶体。
   注:晶体通常生长在井底，但会从环轻轻轻推后脱落。一旦脱落，循环。
5. 将含有低温循环的晶体储存在浸入液体_N2的冰球中。
6. 将这些圆盘储存在德瓦尔烧瓶中的液体_N2中，直到它们准备好在同步加速器上装运X射线衍射。

11. 数据收集

1. 收集 X 射线衍射数据。在此协议中，使用 AMX 光束线 （ID: 17-ID-1），国家同步辐射光源 II。
   注:数据是在现场收集的，但可以远程收集。在交叉极化图像中显示晶格均匀性的晶体区域收集数据。将晶体放置在循环中，以便数据收集不涉及晶体的"差"区域，而晶体在测速仪中旋转。提供最佳分辨率的数据来自在晶体扩展的边缘收集约 5 x 5 μm 大小。使用栅格识别晶体上的最佳区域以收集²⁰。

12. X射线数据处理

1. 使用 XDS IDXREF 程序将数据集处理为最高分辨率（1.8 Ω），以确定空间组、单元单元和溶剂含量。
2. 使用 XDS 集成程序集成数据。
3. 使用 STARANISO 服务器从 XDS XSCALE 程序进行过程缩放强度，对数据的衍射极限表面使用 I/μI 截止平均值 1.2。
   注: 数据不会以真正的椭圆体剪切。保留高于 I/+I 的 1.2 截止点以上的所有数据。由于非球形截断，计算为球形完整性的数据的统计信息较差。椭圆完整性为 88%，最高分辨率分别为:1.88 Ω、2.10 Ω 和 2.55 Ω 沿 a+、b+ 和 c 轴。

13. 结构解决方案

1. 利用GCN4的X射线结构（PDB:4DMD）15作为分子替换的搜索模型，在PHENIX22中使用^MRage21。4DMD 结构在 MRage 中被定义为"集合"，MRage 解决方案成功地构建了与 NEMO-EEAA 的 N 端线圈适配器相对应的结构部分，与搜索模型相同，适用于二分器中的两个链。
   注:在 PHASER 中关闭各向异性校正，否则数据将进一步缩减。
2. 利用在PHENIX和手动建筑（使用2F_o-Fc和F_o-Fc映射，在库特^24）中连续的自动构建²³来构建结构的其余部分。
3. 使用库特^24，使用库特24将仍然缺失的残留物手动构建到模型中，基于2F_o-Fc和F_o-Fc映射。
   注:最后阶段涉及为每个单体构建 4 个 N 端子残留物和 4 个 C 端子残留物。侧链放置也根据需要手动调整。
4. 使用 PHENIX 计算复合省略映射，并省略结构 10%。

14. 结构改进

1. 使用"凤凰"优化优化结构。针对散装溶剂和立体化学权重运行初始细化，将 RMSbond 和 RMSangle 约束分别放宽到 0.01 和 1.0。继续改进单个 B 因子、TLS 参数和占用。

Results

NEMO IKK结合域的克隆、表达和纯化。
本研究中遵循的协议获得NEMO-EEAA的最终序列（图1A），它产生衍射质量晶体，涉及所有中间结构的表达和表征，包括在N和或C-终点站添加线圈适配器，突变C76A，C95S和突变E56A，E57A。图1B显示了在整个纯化过程中收集的样品的SDS-PAGE凝胶，如图1C中的方案所述。该蛋白质在大肠杆菌中过度表达，并呈带状，大约在SDS-PAGE凝胶上的14 kDa MW重量标记处出现（通道3，收获时收集的细胞，在莱姆利样品缓冲液中被莱沙，辅以8M尿素）。蛋白质在第一个 IMAC 柱后显得纯净，并在 SDS-PAGE 凝胶（通道 9）上的 14 和 28 kDa MW 标记器的水平上显示单体和二分线带。TEV 裂解几乎是按照协议完成，蛋白质洗脱与第二个 IMAC ...

Discussion

NEMO在未绑定形式的结晶尝试没有成功，包括使用全长蛋白质的尝试和包括IKK结合域的几种截断结构。我们对NEMO的IKK结合域（残留物44-111）的生物物理表征，通过循环双色、NMR光谱和荧光各向异性表明，该结构，尽管能够结合IKK®，但存在于一种构象交换状态，不适合结晶^9，10。我们的方法涉及设计 NEMO 的 IKK 绑定域，该域采用更稳定、折叠和原生样的构象，消除了防止结晶的灵活性。与NEMO（44-111）序列的N-和C-termini融合的理想卷绕域适配器具有稳定原生NEMO的二分盘线圈褶皱和促进结晶¹⁴的优点。通过SDS-PAGE、尺寸排除色谱、圆形双色谱、荧光各向异性和NMR光谱法，每一步都监测一系列蛋白质结构的行为，如前^10、12所述。尽管在所有所需参数上逐步改进，但在引入E56A、E57A突变之前，没有任何构造产生衍射质量晶体。这些突变是...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% w/v γ-PGA （Na + 形式，LM）	分子尺寸	MD2-100-150	用于 NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO 透析膜	光谱/Por	132724	用于透析去除咪唑
Amicon 搅拌细胞	Millipose Sigma	UFSC 05001	用于蛋白质浓度
氯化铵	Millipore Sigma	G8270	用于最小培养基标记
Benzonase 核酸酶	Millipore Sigma	9025-65-4	用于消化核酸
BL21-CodonPlus （DE3）-RIL 感受态细胞	安捷伦科技	型号：230245	TEV 表达
CryoPro	Hampton Research	HR2-073	冷冻保护剂试剂盒
D-葡萄糖（葡萄糖）	Millipore Sigma	A9434	用于最小培养基标记
Difco Terrific Broth ThermoFisher		DF043817	用于培养生长
二硫苏糖醇 > 99%	Goldbio	DTT25	用于减少二硫化物
大肠杆菌：Rosetta 2 （DE3）	Novagen	71400-3	未标记的NEMO-EEAA
表达 配方	Formulatrix		液体处理器/屏幕生成器
HCl –1.0 M 溶液	Hampton Research	HR2-581	用于 NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg	GE Healthcare	28989333	用于体积排阻纯化
HisTrap HP 5 mL 色谱柱	GE Healthcare	17524802	用于纯化 His 标记的 NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS	分子维度	MD1-59	用于 NEMO-EEAA 的稀疏基质筛选
HT 96 Morpheous	Molecular Dimensions	MD1-46	用于 NEMO-EEAA
咪唑	ThermoFisher	288-32-4	用于从 His 捕获柱洗脱
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Goldbio	I2481C5	用于诱导培养物
MRC2 结晶板	Hampton Research	HR3-083	结晶板
NT8 - 滴落器	配方
结晶 pET-16b	Millipore Sigma	69662	用于克隆 NEMO-EEAA
pET-45b	Millipore Sigma	71327	用于克隆 NEMO-EEAA
苯甲基磺酰氟	ThermoFisher	36978	用于抑制蛋白酶
聚碳酸酯瓶 用于超速离心机 45 型转子Ti	Beckmann Coulter	339160	超速离心瓶
聚乙二醇 20,000	Hampton Research	HR2-609	用于 NEMO-EEAA
pRK793 （TEV）	Addgene	质粒 8827	用于 TEV 生产
QuikChange XL II	安捷伦科技	200522	定点诱变
所需的瓶盖组件：	Beckmann Coulter	355623	Ultracenttrifuge 瓶盖
ROCK IMAGER	Formulatrix		结晶成像仪
种子珠套件	Hampton Research	HR2-320	种子生成
氯化钠 ≥ 99%	Millipore Sigma	S9888	用于缓冲纯化溶液
TCEP（Tris （2-Carboxyethyl） phosphine Hydrochloride）Goldbio		TCEP1	还原剂
The Berkeley Screen	Rigaku	MD15-Berekely	用于 NEMO-EEAA 的稀疏基质筛选
PGA 筛选	分子尺寸	MD1-50	用于 NEMO-EEAA
Tris 的精细筛选结晶 – 1.0 M 溶液	Hampton Research	HR2-589	用于 NEMO-EEAA
超纯 Tris 缓冲液的精细筛选结晶（粉末规格）	Thermofisher	15504020	用于纯化溶液的缓冲
尿素	ThermoFisher	29700	用于 NEMO-EEAA 的变性