去逼尿肌的膀胱模型可直接进入尿路上皮下层，用于研究在储尿和排尿过程中，尿路上皮下层/固有层中生物活性介质可利用性的局部调控机制。该制备方法 closely 模拟完整膀胱的充盈状态，并允许在无系统性影响的情况下进行压力-容积研究。
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摘要
摘要
既往研究已证实，固定在尤斯灌流室中并暴露于静水压变化或机械牵张的扁平膀胱黏膜片、在静水压变化、牵张、细胞肿胀或流体剪切力作用下的培养尿路上皮细胞，以及在膀胱充盈末期的膀胱腔内，均可释放化学物质。这些发现促使人们推测，在膀胱充盈过程中，这些介质同样会在尿路上皮下层（SubU）/固有层（LP）中释放，并作用于膀胱壁深层的细胞，从而最终调控膀胱的兴奋性。然而，此类研究至少存在两个明显局限性：1）上述方法均无法直接提供关于介质在SubU/LP中实际存在的信息；2）所使用的刺激并非生理性刺激，不能真实模拟膀胱的自然充盈过程。本文中，我们介绍一种可在膀胱充盈过程中直接获取膀胱黏膜尿路上皮下表面的实验方法。我们建立的小鼠去逼尿肌膀胱制备模型，能够高度模拟完整膀胱的充盈过程，并可在排除脊髓反射和逼尿肌平滑肌干扰信号的情况下，进行膀胱的压力-容积研究。利用这一新型的去逼尿肌膀胱模型，我们近期证明了膀胱腔内测得的介质浓度不能作为SubU/LP在膀胱充盈期间释放或存在介质的可靠替代指标。该模型可用于研究在膀胱充盈过程中由尿路上皮释放、经代谢生成和/或转运至SubU/LP的信号分子，这些分子可向膀胱的神经元和平滑肌传递信息，从而在控尿和排尿过程中调节膀胱的兴奋性。
引言
该模型的目的是在膀胱充盈的不同阶段，实现对膀胱黏膜黏膜下层的直接接触。
膀胱在充盈过程中必须避免过早收缩，并在达到临界容积和压力时排空。在膀胱充盈过程中，尿液的异常潴留或排泄通常与膀胱逼尿肌平滑肌（DSM）的兴奋性异常有关。DSM的兴奋性由平滑肌细胞内在的因素以及膀胱壁内不同类型细胞产生的影响共同决定。尿膀胱壁由尿路上皮（黏膜）、尿路上皮下层（SubU）/固有层（LP）、逼尿肌平滑肌（DSM）和浆膜组成（图1A）。尿路上皮由伞状细胞（即尿路上皮的最外层）、中间细胞和基底细胞（即尿路上皮的最内层）构成。多种类型的细胞存在于SubU/LP中，包括间质细胞、成纤维细胞、传入神经末梢、小血管和免疫细胞。目前普遍认为，膀胱尿路上皮是一种感觉器官，可通过向黏膜下层释放介质来启动排尿反射和控尿机制，这些介质可影响SubU/LP和DSM中的细胞1,2,3。这些假设主要基于以下研究：已证实当黏膜组织暴露于静水压变化时会释放介质4,5；当培养的尿路上皮细胞受到牵张6,
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方案
本文所述所有涉及动物的实验程序均按照美国国立卫生研究院 实验动物护理和使用的指南 内华达大学机构动物使用与护理委员会
注意：本研究所呈现的模型是在保留尿路上皮及黏膜下层/固有层（SubU/LP）完整的前提下，去除逼尿肌，以使研究者能够在膀胱充盈过程中直接接触黏膜下层/固有层（图1B）。
1. 无逼尿肌膀胱制备的解剖
- 将分离的膀胱置于一个培养皿中，皿内盛有冷（10 °C）且用5% CO2/95% O2气体饱和的 Krebs 碳酸氢盐溶液（KBS），其成分为（mM）：118.5 NaCl、4.2 KCl、1.2 MgCl2、23.8 NaHCO3、1.2 KH2PO4、11.0 葡萄糖、1.8 CaCl2（pH 7.4）13。
- 将分离膀胱顶部的一小部分用针固定在铺有 Sylgard 的解剖皿中，皿内充满 KBS 溶液。确保针穿过浆膜层或逼尿肌最外缘组织，远离面对黏膜下层/固有层（SubU/LP）的逼尿肌内侧边缘。
- 在显微....
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结果
小鼠去逼尿肌膀胱制备物的壁保持完整，包含除逼尿肌层（DSM）和浆膜以外的所有层次。原理性研究证明，去逼尿肌的膀胱壁包括尿路上皮和固有层/黏膜下层（SubU/LP），而tunica muscularis及浆膜则不存在（图2）13。
无逼尿肌膀胱的充盈过程近似于正常膀胱的充盈。图3展示了在不同灌注速率、容积和腔内压力下，离体膀胱标本灌注实验装置的示意图。小鼠离体完整膀胱和去上皮膀胱标本需要较宽范围的灌注容积才能达到排尿压力13。完整与去上皮标本的压力-容积关系极为相似（视频1、视频2以及图4）。因此，无逼尿肌膀胱标本适用于研究尿路上皮.......
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讨论
膀胱具有两个功能：储存尿液和排空尿液。这些功能的正常运作需要对腔内体积和压力进行适当的机械感知，并通过膀胱壁内的细胞传导信号，以调节逼尿肌的兴奋性。人们认为，膀胱黏膜（尿路上皮）可通过释放多种信号分子进入固有层/黏膜下层（SubU/LP），影响膀胱壁内多种细胞类型，从而调控膀胱的兴奋性。目前，大多数对尿路上皮来源介质的表征研究依赖于使用无法模拟生理性膀胱充盈状态的膀胱组织制备物（例如，扁平的膀胱壁片、膀胱壁条或培养细胞）。在膀胱充盈末期检测膀胱腔内释放的介质含量，常被用作推断这些介质从尿路上皮对侧释放的依据。然而，近期研究表明，膀胱腔内的介质含量并不能代表膀胱壁深层区域的实际可用浓度13。为了进一步理解膀胱尿路上皮、固有层/黏膜下层（SubU/LP）与逼尿肌（DSM）之间局部信号传导机制，亟需发展可在膀胱充盈过程中直接获取SubU/LP区域样本的新实验方法。
在此，我们展示了一种新型的动物膀胱模型，该模型通过去除逼尿肌，从而在膀胱充盈期间直接获取来自尿路上皮在固有层/黏膜下层（SubU/LP）释放的介质
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披露
本工作的部分内容此前已发表于《生理学杂志》（PMCID: PMC6418748；DOI:10.1113/JP27692413）。Wiley and Sons, Inc. 已授权使用该出版物中的材料。作者无任何财务或其他利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目 DK41315 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | 费舍尔 | C79 | 来源灵活 |
| 葡萄糖 | 费舍尔 | D16 | 来源灵活 |
| 解剖针 | 精细科学工具 | 26002-20 | 来源灵活 |
| 输液泵 | 肯特科学 | GenieTouch | 来源灵活 |
| KCl | 费舍尔 | P217 | 来源灵活 |
| KH2PO4 | 费舍尔 | P284 | 来源灵活 |
| 光源 | SCHOTT ACEI | 来源灵活 | |
| 显微镜 | 奥林巴斯 SZX7 | 可灵活使用任意显微镜 | |
| MgCl2 | 费舍尔 | M33 | 来源灵活 |
| NaCl | 费舍尔 | S671 | 来源灵活 |
| NaHCO3 | 费舍尔 | S233 | 来源灵活 |
| 25G针头 | 贝克顿·迪金森 | 305122 | 来源灵活 |
| 器官浴槽 | 定制 | 来源灵活；我们由Radnoti解剖皿制成 | |
| PE-20导管 | Intramedic | 427405 | 来源灵活 |
| 压力传感器 | AD仪器 | 来源灵活 | |
| S&T镊子 | 精细科学工具 | 00632-11 | 来源灵活 |
| 压力-容积分析软件 | AD Instruments | Power lab | |
| 尼龙缝线，6-0 | AD外科 | S-N618R13 | 来源灵活 |
| 丝线缝线，6-0 | 通过布雷因特里科学公司采购的Deknatel | 07J1500190 | 来源灵活 |
| 1 mL注射器 | 贝克顿·迪金森 | 309602 | 来源灵活 |
| Vannas弹簧剪 | 精细科学工具 | 15000-08 | 来源灵活 |
| 水循环器 | 百特 | K-MOD 100 | 来源灵活 |
参考文献
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology
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