我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。
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本文内容
摘要
摘要
作为中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞积极调控大脑发育和稳态，其功能障碍可能引发人类疾病。近年来在揭示稳态下小胶质细胞的分子特征及其在环境刺激下基因表达变化方面已取得显著进展。随着单细胞基因组学技术的发展与成熟，人们日益认识到小胶质细胞的异质性可能构成了其在不同发育阶段和病理条件下发挥多样化功能的基础。通过高效分离特定感兴趣区域的小胶质细胞，并对单个细胞进行高灵敏度的分析，可进一步解析此类异质性。本文提供了一种从单只成年小鼠单侧脑半球不同脑区快速分离小胶质细胞的详细实验方案。同时展示了如何将分选后的小胶质细胞用于基于孔板的深度单细胞RNA测序。我们还讨论了该方法在其他应用场景中的可适应性，并提供了优化系统以适应大规模研究的指导建议。
引言
小胶质细胞占所有神经细胞的5%−10%，是分布于中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞1。在血脑屏障的保护下，健康成年大脑中的典型小胶质细胞具有许多细长的突起，这些突起可快速伸展和回缩，以与实质中的神经元及其他胶质细胞相互作用。在特定发育阶段或受到损伤及疾病相关的免疫刺激时，小胶质细胞还可转变为阿米巴样形态，表现出增强的吞噬功能1,2,3,4。近年来令人振奋的研究发现明确表明，小胶质细胞绝非对脑源性或病理信号无动于衷的旁观者，而是在调控大脑发育和稳态中发挥关键作用，例如支持神经元存活、修剪未成熟突触、促进少突胶质细胞系细胞分化以及血管生成1。随着小胶质细胞更多功能被揭示，人类遗传学研究进一步推动了这一领域的热潮，这些研究表明许多神经退行性疾病风险基因（如TREM2）主要甚至仅在小胶质细胞中表达5,6,7。鉴于其在发育中的重要性及可能驱动疾病的作用，近年来人们投入巨大努力以深入理解小胶质细胞的基因调控....
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方案
所有涉及啮齿类动物的实验程序均符合斯坦福大学指南，该指南遵循国家和州的法律法规及政策。所有动物实验程序均经斯坦福大学实验动物护理与使用委员会批准。
注意：所有溶液和缓冲液的组成均在材料表中提供。
1. 细胞分离当天的准备工作
- 准备以下试剂并置于冰上预冷：培养基 A（50 mL）、磁珠激活细胞分选（MCS）缓冲液（30 mL）、流式细胞分选（FACS）缓冲液（25 mL）、磷酸盐缓冲液（PBS；30 mL）、DNase（320 µL）和RNase抑制剂（30 µL）。
注意：此处提供的体积足以从单只小鼠半脑的4个脑区（例如皮层、小脑、海马和纹状体）中分离小胶质细胞。若使用更多组织，请相应扩大体积。 - 将四个洁净的2 mL Dounce匀浆器置于冰上，每个匀浆器中加入含80 µL DNase（12,500 单位/mL）和5 µL RNase抑制剂的2 mL 培养基 A。将研杵放入15 mL离心管中并在冰上预冷。
- 标记四个6 cm培养皿，注明用于组织收集的脑区，并在每个培养皿中加入200 µL预冷的培养基 A，置于冰上。另取一个6 cm培养皿加入约5 mL 培养基 A用于解剖。
注意：使用前确保所有试剂均....
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结果
本方案描述了一种从一个成年灌注脑半球的不同脑区分离和分选小胶质细胞的方法，并随后进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们使用Dounce匀浆器制备单细胞悬液，并将其作为富集小胶质细胞的第一步。匀浆不足或过度均会降低细胞得率。此外，成年小鼠脑组织含有较高水平的髓鞘，若未充分去除，也可能降低分选效率和得率。因此，在进行抗体染色前，我们使用台盼蓝染色和血细胞计数板在显微镜下检查细胞悬液，以评估细胞得率、存活率以及髓鞘去除效果（步骤4.9）（图1）。此时，皮层组织的总细胞数应超过30,000，其他组织应超过5,000。细胞存活率应超过90%，且髓鞘碎片较少。
我们使用流式细胞分选仪（FACS）来分选小胶质细胞（或髓系细胞），这些细胞通常表现为CD45低表达且CD11b阳性。对于皮质组织而言，成功的分离应能从所有活的单细胞中获得超过80%的小胶质细胞（图2）。死亡/濒死细胞群仅占制备细胞的一小部分（约10%）。
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讨论
小胶质细胞会主动与中枢神经系统中的其他细胞类型相互作用，并且对环境刺激非常敏感。为了在分离过程中尽量减少炎症反应及其基因表达的异常变化，本方案在先前发表的方法9基础上进行了优化，现可实现从单只小鼠单侧脑半球的多个脑区并行分离小胶质细胞。组织和试剂始终保持低温，实验需及时完成（从解剖到分选约需3.5小时），并根据组织量有限的特点减少了洗涤步骤和试剂用量。我们选择使用Dounce匀浆法而非其他匀浆方法（如酶消化法），因为机械解离可杀死并去除神经元和其他胶质细胞，同时对小胶质细胞造成的损伤或激活较小9,18。然而，过度匀浆可能会降低小胶质细胞的得率，应予以避免。已有研究显示，基于机械解离结合磁珠法去除髓鞘，再进行FACS分选的流程对小胶质细胞的激活程度较低，这体现在经典炎症基因（如 Tnf、Il1b、Nos2 和 Nfkb2）的表达水平极低9（
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Mariko L. Bennett、Liana Nicole Bonanno 和 Spyros Darmanis 在本实验方案开发过程中提供的帮助。同时感谢斯坦福共享流式分选设施（Stanford Shared FACS Facility）的 Meredith Weglarz 和 Lisa Nichols，以及斯坦福蛋白质与核酸设施（PAN）的 Yen Tran 和 Michael Eckart 在拍摄过程中给予的大力支持。本工作由 JPB 基金会和 Vincent J. Coates 基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 M 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP 混合液 | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ 平衡盐溶液 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart 预混液 | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管，带细胞筛帽 | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI 高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒（1 bp – 6,000 bp） | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | 工作液：12500 单位/ml |
| DTT，分子级 | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA 外参混合液 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 A 套组（96 个索引） | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 B 套组（96 个索引） | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 C 套组（96 个索引） | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 D 套组（96 个索引） | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| λ外切酶（5 U/μl） | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| 小鼠 Fc 封闭剂 | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| 髓鞘去除磁珠 | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA 样本制备试剂盒 | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（150 个循环） | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS（10X），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX 磁珠 | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | 染色：1:1000 |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| 大鼠单克隆抗小鼠/人 CD11b，Brilliant Violet 421（克隆 M1/70） | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | 染色：1:300 |
| 大鼠单克隆抗小鼠 CD45，PE/Cy7（克隆 30-F11） | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | 染色：1:300 |
| 重组 RNase 抑制剂 | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe 逆转录酶（100 U/μl） | Clontech | Cat# 639538 | 含 5x 第一链缓冲液 |
| 寡核苷酸 | |||
| 0.1 μM ISPCR 寡核苷酸：5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli 等, 2014) | ||
| Oligo-dT30VN 引物：5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli 等, 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3'（"r" 代表核糖核苷酸，"+" 代表 LNA 碱基） | (Picelli 等, 2014) | ||
| 溶液 | |||
| FACS 缓冲液 | 配方：经无菌过滤的 1% FBS、2 mM EDTA、25 mM HEPES 溶于 1X PBS | ||
| MCS 缓冲液 | 配方：经无菌过滤的 0.5% BSA、2 mM EDTA 溶于 1X PBS | ||
| 培养基 A | 配方：15 mM HEPES、0.5% 葡萄糖溶于不含酚红的 1X HBSS | ||
| 培养板 | |||
| 384 孔刚性 PCR 微孔板，Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| 硬壳 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad | HSP9631 | |
| 其他 | |||
| Dumont #55 镊子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce 匀浆器，2 ml | Wheaton | 357422 | |
| 大型去除非目标细胞柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 大型选择柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand 支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| 筛网（70 μm） | Falcon | 352350 | |
| 设备 | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| 生物分析仪 | Agilent | 2100 | |
| 片段分析仪 | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS 纳升级移液机器人 | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
参考文献
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
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重印与许可
