利用人原代前列腺上皮细胞，我们报道了一种基于球体的、无需生物标志物的功能性鉴定干细胞样细胞的新方法，该方法通过标记保留实验实现。本文详细描述了BrdU、CFSE或Far Red进行二维细胞标记、三维球体形成、通过免疫细胞化学鉴定标记保留的干细胞样细胞以及通过FACS分离细胞的逐步实验方案。
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摘要
摘要
尽管成体干细胞研究已取得进展，但从组织样本中鉴定和分离干细胞仍是一个主要挑战。成体组织中的定居干细胞在微环境限制下通常处于相对静止状态，但在无锚定的三维（3D）培养条件下，它们会进入细胞周期，并进行对称和不对称细胞分裂，从而产生干细胞和祖细胞。后者增殖迅速，是不同谱系分化阶段的主要细胞群体，可形成异质性类球体。利用原代正常人前列腺上皮细胞（HPrEC），已建立一种基于类球体的标记滞留检测方法，可在单细胞分辨率下实现对类球体起始干细胞的鉴定和功能分离。
将HPrEC或细胞系在二维（2D）培养条件下与BrdU共同培养10天，以使BrdU掺入所有分裂细胞（包括自我更新的干细胞）的DNA中。随后转移至三维（3D）培养体系中进行为期5天的洗脱，此期间干细胞通过不对称分裂实现自我更新，并启动球状体形成。相对静息的子代干细胞保留带有BrdU标记的亲本DNA，而子代前体细胞则快速增殖，从而丢失BrdU标记。BrdU可替换为CFSE或Far Red前体荧光染料，从而可通过FACS实现活体干细胞的分离。干细胞特性可通过体外球状体形成实验、体内组织再生检测以及记录其对称/不对称细胞分裂行为加以验证。所分离的标记物保留型干细胞可进一步用于多种下游分子与生物学研究，包括RNA-seq、ChIP-seq、单细胞捕获、代谢活性检测、蛋白质组分析、免疫细胞化学、类器官形成以及体内组织再生实验。重要的是，这种无需标记物的功能性干细胞分离方法能够从多个器官来源的新鲜癌组织样本及癌细胞系中鉴定出类干细胞，表明其具有广泛的应用前景。该方法可用于鉴定癌症类干细胞的生物标志物、筛选靶向癌症类干细胞的药物，并发现癌症治疗中的新靶点。
引言
人类前列腺腺体包含具有分泌功能的腔面型上皮细胞，其下方为基底细胞，同时还存在一种不常见的神经内分泌细胞成分。这些上皮细胞来源于一种稀有的前列腺干细胞群体，这类干细胞在体内相对静息，作为修复系统在人的一生中维持腺体的稳态1。尽管已有诸多进展，前列腺干细胞的鉴定与功能性分离仍是该领域面临的主要挑战。干细胞生物标志物，包括基于细胞表面标志物的方法结合流式细胞术，是干细胞研究中常用的技术手段2,3,4。然而，由于标志物组合及抗体特异性的差异，富集与分离的结果存在广泛变异5,6，这引发了对所分离细胞身份的质疑。另一种广泛用于类干细胞富集的方法是三维（3D）球体培养2,3,4。尽管组织原位的干细胞在体内因微环境限制而相对静息，但在三维基质培养中它们会进行细胞分裂（包括对称和不对称分裂），产生干细胞和祖细胞，并快速增殖向特定谱系分化7,
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方案
所有细胞操作和培养基配制均应在II级生物安全柜（BSC）中采用无菌技术进行。
1. HPrEC 细胞在二维条件下的培养与维持
- 在室温下，用 2 mL 浓度为 2.5 µg/cm2 的纤连蛋白溶液包被 100 mm 培养皿，过夜孵育。吸除溶液后，在生物安全柜中将培养皿晾干 45 分钟。包被好的纤连蛋白培养皿可在 4 ˚C 保存 2–4 周。
- 向包被有纤连蛋白的 100 mm 培养皿中加入 9 mL 前列腺上皮细胞生长培养基（例如 PrEGM），并将培养皿置于 37 ˚C 的 CO2 培养箱中保温。
- 在 37 ˚C 水浴中解冻一管冻存的 HPrEC 细胞（2 x 105/mL），并将细胞重悬于 10 mL 预热的培养基中。
- 在室温下以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。吸除并弃去上清液。
- 用 1 mL 预热的培养基充分重悬细胞。通过移液将 1 mL 细胞悬液直接接种至含有 9 mL 预热培养基的纤连蛋白包被的 100 mm 培养皿中（培养基与细胞总体积为 10 mL）。将培养皿放回 37 ˚C 的 CO2 培养箱中。
- 每 2 天更换一次培养基。操作时，小心吸除全部旧培养基，并加入 10 mL 新鲜的预热培养基。
- 约 5 天后，确....
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结果
将原代正常人前列腺上皮细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，并在二维培养条件下维持细胞生长（图1a）。当转移至含有基底膜基质的三维培养环境后，分化型上皮细胞逐渐死亡，仅有前列腺干细胞能够在无贴壁依赖的培养条件下存活，并在5天内形成球状细胞集落（图1b）。
在二维培养中对前列腺上皮细胞进行双重标记，随后在三维培养中形成球状体，结果显示BrdU、CFSE和Far Red在同一标记保留细胞中存在共定位（图2a-i）。
第5天类球体中的标记保留细胞表现出干细胞特征。双重免疫染色显示，标记保留细胞中角蛋白KRT14的表达水平较低；细胞连接蛋白E-cadherin14减少；干细胞早期标志物蛋白Wnt10B
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讨论
尽管缺乏特异性和选择性，使用多种干细胞表面标志物进行流式细胞术仍是干细胞研究中常用的方法1,5,6。虽然在三维培养系统中形成球状体是富集原代上皮细胞（包括HPrEC）中稀有干细胞群体的另一种有效方法，但所获得的球状体仍然是干细胞与前体细胞的异质性混合物2,3,4。在前列腺球状体中，与快速增殖的前体细胞相比，干细胞相对处于静息状态，因此可通过长期示踪标记保留实验对其进行鉴定。
本文总结的方法描述了使用 BrdU、CFSE 和/或远红前体染料对 HPrEC 进行标记13。尽管在快速增殖的细胞中，BrdU、CFSE 和/或远红前体染料均会在每次细胞分裂时被迅速稀释，但还存.......
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披露
作者没有需要披露的财务关系。
致谢
本研究由美国国家癌症研究所资助，项目编号为 R01-CA172220（GSP, WYH）和 R01-ES02207（GSP, WYH）。我们感谢伊利诺伊大学芝加哥分校流式细胞术核心设施在细胞分选方面的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL 结核菌素注射器 | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL 微量离心管，无菌 | |||
| 100 mm 培养皿 | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12 孔培养板 | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL 离心管 | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 × 22 mm 盖玻片，方形 | Corning | 284522 | 用于 MatTek 35 mm 培养皿 |
| 24 × 50 mm 盖玻片 | Corning | 2975245 | |
| 26G × 1.5 英寸皮下注射针头 | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 带玻璃底的 35 mm 培养皿 | MatTek Corp | P35G-0-10-C | 0 号玻璃底，未包被， 经辐照处理 |
| 40 µm 孔径尼龙细胞筛 | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 培养箱，37 °C | Forma | ||
| 50 mL 离心管 | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管，带滤网 snap cap | Corning | 352235 | 35 µm 尼龙网 |
| 6 孔培养板 | Corning | 353046 | |
| 8 孔腔室载玻片 | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| 含 DAPI 的水性封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | 一种核荧光染料 |
| 二级生物安全柜 | |||
| BrdU（5-溴-2’-脱氧尿苷） | Sigma-Aldrich | B5002 | DMSO 中 1 mM 储存液 |
| 适用于 1.5 mL 微量离心管的离心机 | Eppendorf | ||
| 适用于 15 mL 管的离心机 | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯） | Thermo Fisher Scientific | C34554 | DMSO 中 5 mM 储存液 |
| 细胞松弛素 D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS 细胞分选仪 MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| 远红前体染料 | Thermo Fisher | C34564 | DMSO 中 5 mM 储存液 |
| 胎牛血清（FBS） | |||
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | 用于包被 100 mm 培养皿 |
| 带彩色数字相机的荧光显微镜 | Carl Zeiss | Axioskop 20 荧光显微镜；彩色数字 Axiocamera | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC（原代正常人前列腺上皮细胞） | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | 来自 3 名年轻（19–21 岁）无疾病器官捐献者混合样本；1 × 105 个细胞/mL；保存于液氮中 |
| 冰桶和冰 | |||
| 带数字相机的倒置显微镜 | |||
| Matrigel，低生长因子，无酚红 | Corning | 356239 | |
| 甲醇 | Corning | A452-4 | |
| 小鼠抗 BrdU 抗体 | Cell Signaling | 5292S | |
| 小鼠 IgG 抗体（阴性对照） | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 移液器及吸头，多种规格 | |||
| PrEGM（ProstaLife 上皮细胞生长培养基） | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| 碘化丙啶（PI） | R & D Systems | 5135/10 | PBS 中 10 μg/mL PI，4 °C 避光保存 |
| 血清移液管，多种规格 | |||
| 用于类球体计数和尺寸测量的软件 | |||
| 软件：使用 Imaris 软件（具备自由绘图功能）生成 3D 图像 | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| 水浴锅，37 °C | |||
| 使用透射光倒置荧光共聚焦显微镜获取 z 轴层扫图像 |
参考文献
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells
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