利用人原代前列腺上皮细胞，我们报道了一种基于球体的、无需生物标志物的功能性鉴定干细胞样细胞的新方法，该方法通过标记保留实验实现。本文详细描述了BrdU、CFSE或Far Red进行二维细胞标记、三维球体形成、通过免疫细胞化学鉴定标记保留的干细胞样细胞以及通过FACS分离细胞的逐步实验方案。
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摘要
摘要
尽管成体干细胞研究已取得进展，但从组织样本中鉴定和分离干细胞仍是一个主要挑战。成体组织中的定居干细胞在微环境限制下通常处于相对静止状态，但在无锚定的三维（3D）培养条件下，它们会进入细胞周期，并进行对称和不对称细胞分裂，从而产生干细胞和祖细胞。后者增殖迅速，是不同谱系分化阶段的主要细胞群体，可形成异质性类球体。利用原代正常人前列腺上皮细胞（HPrEC），已建立一种基于类球体的标记滞留检测方法，可在单细胞分辨率下实现对类球体起始干细胞的鉴定和功能分离。
将HPrEC或细胞系在二维（2D）培养条件下与BrdU共同培养10天，以使BrdU掺入所有分裂细胞（包括自我更新的干细胞）的DNA中。随后转移至三维（3D）培养体系中进行为期5天的洗脱，此期间干细胞通过不对称分裂实现自我更新，并启动球状体形成。相对静息的子代干细胞保留带有BrdU标记的亲本DNA，而子代前体细胞则快速增殖，从而丢失BrdU标记。BrdU可替换为CFSE或Far Red前体荧光染料，从而可通过FACS实现活体干细胞的分离。干细胞特性可通过体外球状体形成实验、体内组织再生检测以及记录其对称/不对称细胞分裂行为加以验证。所分离的标记物保留型干细胞可进一步用于多种下游分子与生物学研究，包括RNA-seq、ChIP-seq、单细胞捕获、代谢活性检测、蛋白质组分析、免疫细胞化学、类器官形成以及体内组织再生实验。重要的是，这种无需标记物的功能性干细胞分离方法能够从多个器官来源的新鲜癌组织样本及癌细胞系中鉴定出类干细胞，表明其具有广泛的应用前景。该方法可用于鉴定癌症类干细胞的生物标志物、筛选靶向癌症类干细胞的药物，并发现癌症治疗中的新靶点。
引言
人类前列腺腺体包含具有分泌功能的腔面型上皮细胞，其下方为基底细胞，同时还存在一种不常见的神经内分泌细胞成分。这些上皮细胞来源于一种稀有的前列腺干细胞群体，这类干细胞在体内相对静息，作为修复系统在人的一生中维持腺体的稳态1。尽管已有诸多进展，前列腺干细胞的鉴定与功能性分离仍是该领域面临的主要挑战。干细胞生物标志物，包括基于细胞表面标志物的方法结合流式细胞术，是干细胞研究中常用的技术手段2,3,4。然而，由于标志物组合及抗体特异性的差异，富集与分离的结果存在广泛变异5,6，这引发了对所分离细胞身份的质疑。另一种广泛用于类干细胞富集的方法是三维（3D）球体培养2,3,4。尽管组织原位的干细胞在体内因微环境限制而相对静息，但在三维基质培养中它们会进行细胞分裂（包括对称和不对称分裂），产生干细胞和祖细胞，并快速增殖向特定谱系分化7,8。所形成的球体是异质性混合物，包含处于不同谱系分化阶段的干细胞和祖细胞，包括早期和晚期祖细胞。因此，使用完整球体进行的检测并非特异性针对干细胞，导致对干细胞独特特性的鉴定结论不明确。因此，建立能够鉴定并分离前列腺干细胞与其子代祖细胞的检测方法至关重要。为此，本实验方案的目标是建立一种检测体系，以实现从人前列腺组织中高效鉴定和分离干细胞，并进一步对其生物学功能进行可靠的下游分析。
长期5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记保留技术被广泛用于体内和体外干细胞谱系示踪，其原理基于干细胞较长的倍增时间9,10。本文所述的前列腺干细胞鉴定与分离方法，基于在混合上皮细胞群体中具有相对静息特性和标记保留能力的细胞。此外，根据“永生链DNA”假说，只有干细胞能够进行不对称细胞分裂。其中，干细胞作为子代细胞保留较老的亲代DNA，而祖细胞（即定向分化的子代细胞）则获得新合成的DNA。上述干细胞的独特特性被用于在原代培养中对亲代干细胞进行BrdU标记，随后在转移至三维无锚定球体培养并洗脱BrdU后追踪其标记保留情况。尽管大多数原代前列腺上皮细胞在二维培养中保持基底细胞和过渡扩增细胞表型，但在转入三维培养系统后，仍存在极少量多能干细胞，可通过形成球体或在相应培养基条件下完全分化为类器官，从而维持上皮稳态3,12。在本实验方案中，我们利用HPrEC前列腺球体或基于前列腺球体的BrdU、CFSE或Far Red标记保留实验，结合荧光激活细胞分选（FACS），在单细胞水平上鉴定球体中的标记保留干细胞13。
重要的是，我们进一步证实了早期类球体中示踪剂滞留细胞相较于具有谱系定向的前体细胞所具备的干细胞特性。这些特性包括干细胞的不对称分裂、体外类球体形成能力以及体内组织再生能力，自噬活性升高、核糖体生物合成增强以及代谢活性降低。随后进行了RNA测序分析，发现示踪剂滞留的类球体细胞中存在差异表达的基因，这些基因可能作为人前列腺干细胞的新型生物标志物。这种基于类球体的示踪剂滞留方法也可应用于癌症标本，以类似地鉴定出少量的癌干细胞样细胞，从而为干预治疗耐药细胞群体提供转化研究机会13。下文以人原代前列腺上皮细胞（HPrEC）为例，介绍基于前列腺类球体的示踪剂滞留检测方法。
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方案
所有细胞操作和培养基配制均应在II级生物安全柜（BSC）中采用无菌技术进行。
1. HPrEC 细胞在二维条件下的培养与维持
- 在室温下，用 2 mL 浓度为 2.5 µg/cm2 的纤连蛋白溶液包被 100 mm 培养皿，过夜孵育。吸除溶液后，在生物安全柜中将培养皿晾干 45 分钟。包被好的纤连蛋白培养皿可在 4 ˚C 保存 2–4 周。
- 向包被有纤连蛋白的 100 mm 培养皿中加入 9 mL 前列腺上皮细胞生长培养基（例如 PrEGM），并将培养皿置于 37 ˚C 的 CO2 培养箱中保温。
- 在 37 ˚C 水浴中解冻一管冻存的 HPrEC 细胞（2 x 105/mL），并将细胞重悬于 10 mL 预热的培养基中。
- 在室温下以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。吸除并弃去上清液。
- 用 1 mL 预热的培养基充分重悬细胞。通过移液将 1 mL 细胞悬液直接接种至含有 9 mL 预热培养基的纤连蛋白包被的 100 mm 培养皿中（培养基与细胞总体积为 10 mL）。将培养皿放回 37 ˚C 的 CO2 培养箱中。
- 每 2 天更换一次培养基。操作时，小心吸除全部旧培养基，并加入 10 mL 新鲜的预热培养基。
- 约 5 天后，确保细胞培养物融合度达到 ~70–80%。通过在 37 ˚C 下用 3 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 孵育 5 分钟进行酶消化。
- 加入 3 mL 含 10% FBS 的预热 PBS 以终止消化反应。
- 将细胞收集至 50 mL 离心管中，在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。吸除并弃去上清液。
- 用 30 mL 预热的培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液等量分装至三个新的纤连蛋白包被的 100 mm 培养皿中，用于下一次传代。
注：原代 HPrEC 细胞可在不改变其基底上皮细胞特性的前提下传代 ~3–5 次。上皮细胞表型可通过免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）检测基底上皮细胞标志物细胞角蛋白 5 和 p63 的表达来验证。
2. 使用 BrdU、CFSE 或远红前体染料标记 HPrEC
注意：细胞可直接进入步骤 2.1 或先进行步骤 2.2，随后按步骤 3.1 所述转移至 3D 前列腺球体培养体系。
- 使用 BrdU 对细胞进行单标记
- 将 2 × 105 个 HPrEC 细胞接种于纤连蛋白包被的 100 mm 培养皿中，加入 10 mL 含 1 µM BrdU 的预温培养基，培养 10 天（经历两次传代），以确保所有细胞（包括前列腺干细胞和前体细胞）均被标记。
- 培养 10 天后，小心吸除含 BrdU 的 PrEGM 培养基，并用 5 mL 预温的 PBS 洗涤细胞，重复洗涤 1 次。
- 按照步骤 1.7–1.8 所述方法进行酶消化处理。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
- 将 BrdU 标记后的细胞沉淀（5 × 104 个）重悬于 500 µL 冰冷的（1:1）基底膜基质/培养基中，转移至三维前列腺球体培养体系（见步骤 3.1）中培养 5 天，使球体形成过程中 BrdU 充分洗脱（约经历 6 个细胞周期）。
- 使用 BrdU 与 CFSE 或 Far Red 前体染料对细胞进行双标记
- 若需对活细胞进行共标记，取步骤 2.1 中已用 BrdU 孵育 10 天的预标记细胞，在第 10 天加入 5 µM CFSE 或 Far Red 活细胞荧光前体染料，共同孵育 30 分钟。
- 小心吸除含 BrdU 及 CFSE 或 Far Red 前体染料的培养基，并用 5 mL 预温 PBS 洗涤细胞，重复洗涤 1 次。
- 按照步骤 1.7–1.8 所述方法进行酶消化处理。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，移除并弃去上清液。
- 将共标记的细胞（5 × 104 个）重悬于 500 µL 冰冷的（1:1）基底膜基质/培养基中，转移至三维前列腺球体培养体系（见第 3.1 节）中培养 5 天，使球体形成过程中 BrdU 与 CFSE 或 Far Red 充分洗脱（约经历 6 个细胞周期）。
- 按照步骤 4.1、4.2、4.3 或 5 所述方法，对球体中的标记保留细胞（第 5 天前列腺球体）进行检测。
注：羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）和 Far Red 是长效荧光前体染料，在标记细胞中可长期保留。活细胞内的细胞酯酶可裂解其乙酸基团，从而激活绿色或红色荧光分子，使其变为不可透过细胞膜的形式并滞留于细胞内。
3. 三维基底膜培养系统中前列腺球体的形成
- 在三维基底膜基质系统中培养前列腺球体
- 在 4 ˚C 下过夜解冻基底膜基质，使用前保持在冰上。
- 将 1 mL 冰冷的基底膜基质轻轻加入等体积的冰冷培养基中。通过上下吹打缓慢混匀，避免产生气泡。
注意：用 100 µL 该溶液预包被 12 孔板每孔底部。这将最大限度减少细胞穿过基质并在底部以单层形式生长的情况。 - 将 5 × 104 个 HPrEC 细胞重悬于总体积为 500 µL 的冰冷（1:1）基底膜基质/培养基混合液中。
- 将 500 µL 该细胞悬液沿每孔底部边缘加入。
- 轻轻旋转培养板，使混合物均匀分布于孔边缘。将培养板置于 37 ˚C、CO2 培养箱中孵育 30 分钟，使基质凝固。
- 基质凝固后，每孔加入 1 mL 预热的培养基覆盖。切勿扰动基底膜基质环。使用移液枪时应小心对准孔中央，缓慢加入培养基。
注意：加入已凝固的基底膜基质时，培养基必须预热至 37 ˚C。若接触冷或低温培养基，基底膜基质会失去完整性并溶解。 - 每隔 2 天更换一次培养基。小心吸除约 500 µL 废液，然后加入 500 μL 新鲜的预热培养基。
- 使用倒置显微镜监测前列腺球体的形成和生长，持续 5–7 天。
- 前列腺球体的传代
- 通过小心吸除尽可能多的培养基来收获球体。避免扰动或吸起凝固基质的漂浮碎片。
- 加入 1 mL 消化酶溶液（基底膜基质:分散酶按 1:2 比例）。通过反复吹打充分混匀。
- 将培养板置于 37 ˚C、CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
- 对沉降至培养皿底部的前列腺球体进行成像，用于计数球体数量并测量其大小。
- 将球体混合物收集至 15 mL 离心管中。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，使球体沉淀。吸除并弃去上清液。
- 用 500 µL 预热的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化，将球体解离为单细胞，并将悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
- 将微量离心管置于 37 ˚C、CO2 培养箱中孵育 5 分钟。
- 加入含 10% FBS 的 500 µL 预热 PBS 终止胰蛋白酶反应。将消化后的球体悬液通过装有 26 G 针头的 1 mL 注射器反复吹打 5 次，以彻底解离为单细胞。
- 在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液并弃去。
- 将细胞沉淀重悬于 1 mL 预热培养基中，并通过孔径为 40 µm 的尼龙细胞滤网过滤。
- 在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。吸除并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 1 mL 冰冷的（1:1）基底膜基质/培养基混合液中，并接种至三维基底膜基质系统中，进行前列腺球体的第二次传代培养。
4. 通过免疫荧光染色鉴定保留 BrdU 的前列腺干细胞
- 将附着的前列腺球体继续培养至长出单层细胞，随后进行免疫荧光（IF）染色，用于前列腺干细胞的二维成像。
- 通过dispase消化收获前列腺球体，具体步骤如3.2.1–3.2.3所述。将球体置于1.5 mL微量离心管中，以500 x g离心 g 5 分钟后弃去上清液。
- 将球体重悬于1 mL预热的培养基中。
- 在8孔腔室载玻片中，每孔加入约50个前列腺球体，每孔加入200 µL培养基，在37 ˚C培养箱中孵育过夜，以促进球体的贴壁与外向生长。
- 第2天，吸除并弃去培养基。用200 µL PBS洗涤过度生长的细胞球，持续5分钟。
- 在 -20 ˚C 条件下，用 200 µL/孔的冰甲醇固定球状结构 20 分钟。
- 用 200 µL/孔 PBS 洗涤球体，每次 5 分钟，重复 2 次。
- 用 200 µL/孔的 2N HCl 在室温下酸洗小球 30 分钟。
- 用 200 µL/孔 PBS 洗涤球体，每次 5 分钟，重复 3 次。
- 加入100 µL封闭液（含5%正常山羊血清的PBST，即含0.25% Triton X-100的PBS），在室温下孵育30分钟。
- 吸去封闭液，每孔加入含2%正常山羊血清和1:200稀释的鼠抗人BrdU一抗的PBST溶液100 µL，置于湿盒中4 ˚C过夜孵育。
注：小鼠IgG抗体用作阴性对照。 - 吸弃一抗溶液，加入200 µL PBS洗涤5分钟，重复洗涤2次。
- 每孔加入含2%正常山羊血清和1:500稀释的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗的PBST溶液100 µL，于室温避光孵育2小时。
- 吸除二抗溶液，加入200 µL PBS洗涤5分钟，重复3次。
- 用含 DAPI 的水溶性封片剂（约 25–40 µL）封片。
- 使用荧光显微镜和彩色数码相机获取染色后的球体/细胞的图像。
- 前列腺类球体全组织免疫荧光染色用于前列腺干细胞三维成像
注意：进行整体免疫荧光染色时，前列腺球体需使用1.5 mL微量离心管进行操作。- 通过dispase消化收获前列腺球体，具体步骤如3.2.1–3.2.3所述。将球体置于1.5 mL微量离心管中，以500 x g离心 g 5分钟。吸出上清液并弃去。
- 用1 mL 4%多聚甲醛在室温下重悬并固定球体20 min。将球体在500 x g 5 分钟。吸出上清液并弃去。
- 通过在1 mL PBS中重悬沉淀来洗涤球体。将球体在500 x g 5 分钟。吸出上清液并弃去。重复 1 次。
- 将沉淀重悬于1 mL 2N HCl中，酸洗30分钟。
- 用1 mL PBS洗涤球体5分钟，然后在500 x g下离心 g 5 分钟。吸出上清液并弃去。重复 3 次。
- 将约15–30个球体重悬于100 µL封闭液中（PBST含5%正常山羊血清，PBST为含0.25% Triton X-100的PBS），室温孵育30分钟。
- 为去除封闭液，将球体在500 x g 5 分钟后，吸出并弃去上清液。
- 将球体重悬于含有2%正常山羊血清和1:200稀释的鼠抗人BrdU一抗的100 µL PBST中，4 ˚C过夜孵育。
- 用1 mL PBS重悬沉淀物以洗涤球体，随后在500 x g下离心球体。 g 5 分钟。吸除上清液并弃去。重复 1 次。
- 将球体重悬于含有2%正常山羊血清和1:1,000稀释的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗的100 µL PBST中，室温孵育2小时。
- 通过在1 mL PBS中重悬沉淀来洗涤球体。将球体在500 x g 5 分钟。吸出上清液并弃去。重复 1 次。
- 将球体重悬于30–50 µL含DAPI的水性封片剂中。为防止球体压扁，将其接种至由35 mm未包被培养皿与玻璃底盖玻片构成的凹槽内。随后将盖玻片覆盖于培养皿上，封住凹槽。
- 使用透射光倒置荧光共聚焦显微镜获取整个球体的Z轴层扫图像。利用具有自由绘图功能的成像软件将这些Z轴层扫图像转换为三维图像。
注意：小鼠IgG抗体用作阴性对照。
- 配对细胞分析（4天方案）
- 将BrdU标记的细胞球培养至第5天。
- 第1天：用1 mL分散酶消化液从基底膜基质中收获球状体。按照步骤3.2.1–3.2.11所述，在1.5 mL微量离心管中加入500 µL预热的0.05%胰蛋白酶/EDTA，将球状体解离为单细胞。
- 将细胞重悬于1 mL预热的培养基中。
- 将分散的单个细胞（每孔约300–500个）接种于8孔腔室载玻片中，每孔加入200 µL培养基，过夜培养以促进细胞贴壁。
- 第2天：更换培养基，加入含2 µM细胞松弛素D的培养基200 µL，37 ˚C孵育过夜，使细胞进行一次分裂并停滞于晚中期至后期阶段。
- 第3–4天：吸除并弃去培养基。每孔加入200 µL预冷甲醇，在-20 ˚C固定细胞20分钟。按照步骤4.1.5–4.1.14所述BrdU免疫染色方案进行操作。
- 使用荧光显微镜拍摄成对细胞的图像，确保两个细胞核之间的距离小于30 µm。根据BrdU滞留情况，判断成对的干细胞正在进行对称性或不对称性细胞分裂。
注意：BrdU标记保留的前列腺干细胞通过对称分裂产生两个均等保留BrdU的子代干细胞，而经历不对称分裂的干细胞则产生一个保留全部BrdU的子代干细胞和另一个丢失BrdU标记的子代前体细胞。
5. 通过FACS分选分离保留CFSE标记的前列腺干细胞
- 第5天：在3D培养中，将6孔培养板内生长的CFSE标记的第5天前列腺球体的培养基更换为2 mL分散酶溶液（基底膜基质与分散酶按1:2比例混合），反复吹打数次以充分混匀。
- 将培养板置于 CO₂ 培养箱中孵育2 37 ˚C 培养箱中孵育 30 分钟以消化基质。
- 将球体混合物收集至15 mL离心管中。以500 x g 室温下离心5分钟。吸除上清液并弃去。
- 将球状沉淀重悬于500 µL预热的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液中，转移至1.5 mL微量离心管。
- 将球体在 CO2 37 ˚C 培养箱中孵育 5 分钟。加入 500 µL 含 10% FBS 的预温 PBS。
- 将细胞球通过装有26 G针头的1 mL注射器反复吹打5次，以完全解离为单细胞。
- 以 500 x g 室温下孵育5分钟。吸除并弃去上清液。
- 将细胞重悬于1 mL含有1 µg/mL碘化丙啶（PI）的预热培养基中，以标记死细胞。室温孵育1分钟。
- 以 500 x g 离心细胞 g 室温下孵育5分钟。吸除并弃去上清液。
- 将细胞重悬于1 mL预热的培养基中。在500 x g 室温下孵育5分钟。吸除并弃去上清液。
- 将细胞重悬于500 µL预热的培养基中，并通过35 µm孔径的带扣式细胞滤筛过滤，收集至5 mL聚苯乙烯圆底管中。
- 使用单通道流式细胞仪分析经胰蛋白酶分散的CFSE标记的前列腺球细胞。
- 门控分选CFSE标记的细胞亚群你好CFSE医学，以及 CFSELo 细胞。使用阴性对照和阳性对照进行设门。
注意：存在经FACS分选的CFSE标记滞留前列腺干细胞（参见Hu等）13可通过绿色荧光显微镜观察确认，并且与非保留细胞相比，这些细胞具有更大的细胞体积。相较于祖细胞群体，较大的细胞体积是前列腺干细胞的特性之一。这一特征在其他组织类型中可能有所不同。
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结果
将原代正常人前列腺上皮细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，并在二维培养条件下维持细胞生长（图1a）。当转移至含有基底膜基质的三维培养环境后，分化型上皮细胞逐渐死亡，仅有前列腺干细胞能够在无贴壁依赖的培养条件下存活，并在5天内形成球状细胞集落（图1b）。
在二维培养中对前列腺上皮细胞进行双重标记，随后在三维培养中形成球状体，结果显示BrdU、CFSE和Far Red在同一标记保留细胞中存在共定位（图2a-i）。
第5天类球体中的标记保留细胞表现出干细胞特征。双重免疫染色显示，标记保留细胞中角蛋白KRT14的表达水平较低；细胞连接蛋白E-cadherin14减少；干细胞早期标志物蛋白Wnt10B
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讨论
尽管缺乏特异性和选择性，使用多种干细胞表面标志物进行流式细胞术仍是干细胞研究中常用的方法1,5,6。虽然在三维培养系统中形成球状体是富集原代上皮细胞（包括HPrEC）中稀有干细胞群体的另一种有效方法，但所获得的球状体仍然是干细胞与前体细胞的异质性混合物2,3,4。在前列腺球状体中，与快速增殖的前体细胞相比，干细胞相对处于静息状态，因此可通过长期示踪标记保留实验对其进行鉴定。
本文总结的方法描述了使用 BrdU、CFSE 和/或远红前体染料对 HPrEC 进行标记13。尽管在快速增殖的细胞中，BrdU、CFSE 和/或远红前体染料均会在每次细胞分裂时被迅速稀释，但还存...
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披露
作者没有需要披露的财务关系。
致谢
本研究由美国国家癌症研究所资助，项目编号为 R01-CA172220（GSP, WYH）和 R01-ES02207（GSP, WYH）。我们感谢伊利诺伊大学芝加哥分校流式细胞术核心设施在细胞分选方面的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL 结核菌素注射器 | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL 微量离心管，无菌 | |||
| 100 mm 培养皿 | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12 孔培养板 | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL 离心管 | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 × 22 mm 盖玻片，方形 | Corning | 284522 | 用于 MatTek 35 mm 培养皿 |
| 24 × 50 mm 盖玻片 | Corning | 2975245 | |
| 26G × 1.5 英寸皮下注射针头 | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 带玻璃底的 35 mm 培养皿 | MatTek Corp | P35G-0-10-C | 0 号玻璃底，未包被， 经辐照处理 |
| 40 µm 孔径尼龙细胞筛 | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 培养箱，37 °C | Forma | ||
| 50 mL 离心管 | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管，带滤网 snap cap | Corning | 352235 | 35 µm 尼龙网 |
| 6 孔培养板 | Corning | 353046 | |
| 8 孔腔室载玻片 | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| 含 DAPI 的水性封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | 一种核荧光染料 |
| 二级生物安全柜 | |||
| BrdU（5-溴-2’-脱氧尿苷） | Sigma-Aldrich | B5002 | DMSO 中 1 mM 储存液 |
| 适用于 1.5 mL 微量离心管的离心机 | Eppendorf | ||
| 适用于 15 mL 管的离心机 | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯） | Thermo Fisher Scientific | C34554 | DMSO 中 5 mM 储存液 |
| 细胞松弛素 D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS 细胞分选仪 MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| 远红前体染料 | Thermo Fisher | C34564 | DMSO 中 5 mM 储存液 |
| 胎牛血清（FBS） | |||
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | 用于包被 100 mm 培养皿 |
| 带彩色数字相机的荧光显微镜 | Carl Zeiss | Axioskop 20 荧光显微镜；彩色数字 Axiocamera | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC（原代正常人前列腺上皮细胞） | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | 来自 3 名年轻（19–21 岁）无疾病器官捐献者混合样本；1 × 105 个细胞/mL；保存于液氮中 |
| 冰桶和冰 | |||
| 带数字相机的倒置显微镜 | |||
| Matrigel，低生长因子，无酚红 | Corning | 356239 | |
| 甲醇 | Corning | A452-4 | |
| 小鼠抗 BrdU 抗体 | Cell Signaling | 5292S | |
| 小鼠 IgG 抗体（阴性对照） | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 移液器及吸头，多种规格 | |||
| PrEGM（ProstaLife 上皮细胞生长培养基） | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| 碘化丙啶（PI） | R & D Systems | 5135/10 | PBS 中 10 μg/mL PI，4 °C 避光保存 |
| 血清移液管，多种规格 | |||
| 用于类球体计数和尺寸测量的软件 | |||
| 软件：使用 Imaris 软件（具备自由绘图功能）生成 3D 图像 | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| 水浴锅，37 °C | |||
| 使用透射光倒置荧光共聚焦显微镜获取 z 轴层扫图像 |
参考文献
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758(2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012(2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
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