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方法文章

诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

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DOI：

10.3791/60360

⸱

2020年2月10日

 , 
1Fralin Biomedical Research Institute at Virginia Tech Carilion, 2School of Neuroscience, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

本文内容

摘要

本系统性实验方案描述了一种新的重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的动物模型。第一部分详细介绍了使用改良的重物坠落模型诱导创伤性脑损伤的操作步骤。第二部分提供了用于单通道和多通道脑电图数据采集系统的外科手术方法指导。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）是获得性癫痫的主要病因之一。TBI 可导致局灶性或弥漫性脑损伤。局灶性损伤由直接的机械力引起，有时会穿透颅骨，直接在脑组织中形成病灶。在脑部影像学检查中，这些病灶表现为挫伤、裂伤和出血区域。局灶性病灶可诱导神经元死亡和胶质瘢痕形成，存在于所有遭受 TBI 人群的 20%−25% 中。然而，在大多数 TBI 病例中，损伤是由加速-减速力及其继发的组织剪切力所致，从而引起非局灶性的弥漫性损伤。一部分 TBI 患者在经历数月甚至数年的潜伏期后，会发展为创伤后癫痫（PTE）。目前尚无法预测哪些患者将发展为 PTE，且 PTE 患者的癫痫发作难以控制，因此亟需进一步研究。直到最近，该领域仅有两种经过验证可产生自发性创伤后癫痫发作的动物/啮齿类模型，这两种模型均表现为伴有大脑皮层甚至有时皮层下结构大面积组织丢失的显著局灶性病灶。与这些模型不同，研究发现，采用改良的落锤法诱导的弥漫性 TBI 足以引发自发性惊厥性和非惊厥性癫痫发作，即使在无局灶性病灶或组织丢失的情况下亦可发生。与人类获得性创伤后癫痫患者相似，该模型在损伤后存在一段潜伏期，随后才出现癫痫发作。在本实验方案中，将向科研界提供一种新的创伤后癫痫模型，详细阐述如何诱导无病灶的弥漫性 TBI，并在数月时间内进行持续的长期视频-脑电图动物监测。本方案将详细说明动物操作、落锤操作、两种信号采集系统的电极植入方法，以及在手术、术后监测和数据采集各步骤中常遇到的技术挑战。

引言

每年，全球约有6000万人受到创伤性脑损伤（TBI）的影响。受伤个体发展为癫痫的风险更高，且癫痫可能在初始损伤数年后才出现。尽管严重的TBI与更高的癫痫风险相关，但即使是轻度TBI也会增加个体罹患癫痫的可能性1,2,3,4。所有TBI均可分为局灶性、弥漫性，或两者的组合。许多（即使不是全部）TBI中均存在弥漫性脑损伤，这是由于加速-减速和旋转力导致不同密度的脑组织相互剪切所致。根据定义，弥漫性损伤仅在轻度/脑震荡性非穿透性脑损伤中孤立发生，此时在计算机断层扫描（CT）中无法观察到脑部病灶5。

目前，对已发生或有风险发展为创伤后癫痫（PTE）患者的管理存在两个关键问题。第一个问题是，一旦PTE发作，其癫痫发作对现有的抗癫痫药物（AEDs）具有耐药性6。第二个问题是，AEDs在阻止癫痫发生方面同样无效，且目前尚无有效的替代治疗策略。为弥补这一不足并寻找更优的治疗靶点和候选疗法，有必要深入探究PTE根本性的细胞与分子机制6。

创伤后癫痫的一个显著特征是初始创伤事件与自发性、无诱因、反复发作的癫痫发作之间存在一段潜伏期。这一时间窗口内发生的事件自然成为研究人员关注的焦点，因为该时间段可能为完全治疗和预防创伤后癫痫提供机会。此类研究最常使用动物模型，因为动物模型具有多种明显优势，其中最重要的一点是，对人类患者进行持续监测在如此可能漫长的期间内既不切实际又成本高昂。此外，癫痫发生根本性的细胞和分子机制只能通过动物模型进行探索。

与通过化学致痫剂或电刺激（急性、慢性或点燃法）等生理相关性较低的方法在创伤性脑损伤（TBI）后诱导癫痫发作的模型相比，具有自发性创伤后癫痫发作和癫痫的动物模型更受青睐。自发性创伤后癫痫发作模型可用于研究TBI如何改变健康的大脑网络，从而导致癫痫发生。而在TBI后施加额外刺激的研究则用于评估TBI暴露如何降低癫痫发作阈值并影响对癫痫发作的易感性。通过化学或电刺激诱导癫痫发作的动物模型的优势在于可用于检验对抗癫痫药物（AEDs）耐药的具体机制，以及现有和新型AEDs的疗效。然而，由于以下原因，这些数据在人类中的相关性和可转化性可能尚不明确7：1）癫痫发作机制可能与单纯TBI诱导的机制不同；2）并非所有这些模型都会产生自发性癫痫发作7；3）致痫剂本身、给药所需的套管，或刺激电极植入深部结构（如海马或杏仁核）所造成的损伤，本身就可能导致癫痫易感性升高，甚至出现海马癫痫样场电位7。此外，某些致痫剂（如红藻氨酸）会直接导致海马损伤和硬化，这在弥散性TBI后并不典型。

直到最近，仅有两种创伤后癫痫的动物模型：控制性皮层冲击（CCI，局灶性）或液体冲击损伤（FPI，局灶性和弥漫性）8。这两种模型均会在啮齿类动物中引起显著的局灶性损伤，伴随组织丢失、出血和胶质增生8。这些模型模拟了由显著局灶性损伤引发的创伤后癫痫。最近一项研究表明，重复（3次）弥漫性创伤性脑损伤足以诱导小鼠出现自发性癫痫发作和癫痫，即使不存在局灶性损伤9，从而增加了第三种经证实可产生自发性复发性癫痫发作的啮齿类PTE模型。这一新模型模拟了弥漫性创伤性脑损伤所引起的细胞和分子变化，更真实地代表了人类中轻度、震荡性脑损伤的人群。在此模型中，癫痫发作前存在三周或更长的潜伏期，并随后出现晚期的自发性复发性癫痫发作，这为研究创伤后癫痫发生的根本机制、在癫痫发作出现后测试预防策略和新型治疗候选药物的疗效提供了可能，同时也为开发创伤后癫痫发生的生物标志物提供了潜力，因为约有一半的动物会发展为创伤后癫痫。

选择用于创伤后癫痫研究的动物模型取决于科学问题、所研究的脑损伤类型，以及用于确定潜在细胞和分子机制的研究工具。最终，任何创伤后癫痫模型都必须证明在创伤性脑损伤（TBI）后出现自发性癫痫发作，并且在部分TBI动物中存在一个初始潜伏期，因为并非所有遭受TBI的患者都会发展为癫痫。为此，本实验方案采用同步视频采集的脑电图（EEG）技术。理解数据采集硬件及方法背后的技术细节对于准确解读数据至关重要。关键的硬件因素包括记录系统的类型、电极类型（螺钉或导线电极）及其材质、同步视频采集系统（作为EEG系统的一部分或第三方系统），以及计算机系统的性能参数。根据研究目标、感兴趣的EEG事件、后续分析方法以及数据存储的可持续性，在任何系统中设置适当的采集参数都是至关重要的。最后，必须考虑电极配置（导联方式）的方法，因为每种配置都有其优缺点，并会影响数据的解读。

本方案详细介绍了如何使用改良的Marmarou落锤模型10,11在小鼠中诱导弥漫性损伤，从而产生自发性、非诱发性、反复发作的癫痫发作，并描述了通过单极、双极或混合导联方式获取单通道和多通道连续同步视频脑电图（EEG）的手术方法。

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方案

本方案中描述的所有动物实验均按照弗吉尼亚理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求。

1. 动物操作方案

注意：本方案旨在使从供应商处订购的动物在到达设施后适应新环境，并使其习惯实验人员的接触操作。这有助于减少动物的压力与焦虑，提升动物福利，同时简化需要接触动物的若干操作步骤，包括诱导创伤性脑损伤（TBI）、术后监测以及将动物连接至数据采集系统。

  1. 从供应商处接收大量动物后，为其耳标编号，并随机分配至实验组（TBI）或对照组（假手术组），每笼合笼饲养 2−5 只动物。TBI 动物应与假手术动物分开饲养，因为假手术小鼠偶尔会对接受 TBI 的小鼠表现出攻击性行为。
  2. 操作日 1（耳标编号后 24−48 小时）：准备一张记录表，用于登记动物耳标号、出生日期、操作日期、操作日体重、操作持续时间，以及备注和观察记录栏。
  3. 用双手轻轻捧住动物。切勿抓握动物尾巴，以免引发其防御机制和应激反应。
  4. 检查并记录动物的耳标号。
  5. 将动物放入容器中置于电子天平上，记录体重。
  6. 再次用双手轻轻捧住动物，操作 1 分钟，允许其在手中移动和探索。操作应在操作室内的实验台面上进行，并注意防止动物掉落至地面。
  7. 操作 1 分钟后，将动物放回笼中。
  8. 对笼内其他动物重复步骤 1.3−1.7。
  9. 操作日 2（次日）：重复步骤 1.2−1.5。
  10. 再次用双手轻轻捧住动物，操作 2 分钟，允许其在手中移动和探索。操作应在操作室内的实验台面上进行，并注意防止动物掉落至地面。
  11. 操作 2 分钟后，将动物放回笼中。
  12. 对笼内其他动物重复步骤 1.10−1.11。
  13. 操作日 3（次日）：重复步骤 1.2−1.5。
  14. 再次用双手轻轻捧住动物，操作 4 分钟，允许其在手中移动和探索。操作应在操作室内的实验台面上进行，并注意防止动物掉落至地面。
  15. 操作 4 分钟后，将动物放回笼中。
  16. 对笼内其他动物重复步骤 1.14−1.15。
  17. 操作日 4（对照日，距操作日 1 一周时间）：重复步骤 1.2−1.5。
  18. 再次用双手轻轻捧住动物，操作 4 分钟，允许其在手中移动和探索。操作应在操作室内的实验台面上进行，并注意防止动物掉落至地面。
  19. 操作 4 分钟后，将动物放回笼中。
  20. 对笼内其他动物重复步骤 1.18−1.19。
    注：对照操作日用于检测经过三天操作程序后镇静行为的保持情况。

2. 重物坠落实验步骤

  1. 将小鼠放入诱导室中，调节氧气和真空流速均为 1 L/min，异氟烷气体浓度设为 3%−5%，麻醉小鼠 5 分钟。
  2. 将小鼠从诱导室中取出，置于泡沫垫上，通过脚趾或尾部夹捏测试其是否无反应。
  3. 皮下注射镇痛剂（0.1 mg/kg 布托啡诺）。若当天进行脑电图（EEG）手术，则皮下联合注射布托啡诺与非甾体类抗炎药卡洛芬（5 mg/kg）。
  4. 在最后一次撞击前或后，按每克体重 3 µL 的剂量皮下注射乳酸钠溶液。乳酸钠溶液可与镇痛剂混合，以便通过单次注射快速给药。
    注：乳酸钠溶液包含氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠的水溶液混合物。此步骤有助于补充液体和电解质，促进恢复。
  5. 将小鼠头部置于落锤管下方（图 1A），并在头部中央（眼线与耳线之间）放置一个平头不锈钢圆盘（直径 1.3 cm，厚度 1 mm，重量 880 mg）。
    注：该圆盘可将冲击力分散至颅骨表面（图 1B）。
  6. 拔出落锤管中的固定销，使 100 g 的重锤从 50 cm 高度自由下落。对于对照组小鼠的假损伤操作，需将重锤杆从管中取出，以防止固定销意外释放导致重锤下落。
    注：必须保持小鼠头部平放，以确保重锤自由下落时完全作用于圆盘整个表面。
  7. 将失去意识的动物仰卧于覆盖无菌聚乙烯衬垫吸水毛巾的加热垫上进行恢复。可通过测量翻正反射恢复时间（即小鼠从仰卧位自行翻转过来所需的时间）作为其无意识状态持续时间的指标。
  8. 当动物恢复意识后，将其放入已预热的清洁笼盒中，笼内提供恢复凝胶和少量湿润饲料，继续恢复 45 分钟。确保垫料充足，防止笼内过热。动物过热与过冷一样，均会严重阻碍恢复过程。
  9. 45 分钟后，重复步骤 2.1−2.8 两次，但省略步骤 2.3（即不再给予镇痛剂和抗炎药物）。
  10. 若当天进行脑电图电极植入手术，则让动物再恢复 1−2 小时。

3. 脑电图电极植入手术区域准备

注意：手术前对所有手术器械和螺钉进行高压灭菌。在接触动物、非无菌材料以及在处理不同动物之间，需用70%乙醇喷洒并揉搓外科手套以进行清洁。在动物之间使用玻璃珠灭菌器（见材料表）对手术器械灭菌2−3分钟。在将新动物放入立体定位仪前更换无菌手术单。确保手术区域包含手术所需的所有组件（图2）。本模型中诱导创伤性脑损伤（TBI）无需侵入性手术，具有多项优势：1）电极植入时间灵活，可在TBI当天或经过特定时间间隔后进行；2）动物恢复时间更短；3）颅骨保持完整，为电极植入提供了更大的表面积和更高的灵活性。

  1. 将小鼠置于诱导室中，使用3%−5%异氟烷气体麻醉5分钟。
  2. 将小鼠从诱导室转移至立体定位仪，放置在加热垫上的无菌铺巾上，并连接鼻罩的异氟烷气体管和真空管。
  3. 在整个手术过程中维持体温在37 °C。将温度传感器放置于小鼠胸壁或腹壁，确保接触良好。
  4. 使用耳杆固定动物头部。
  5. 以1.5%−3.5%异氟烷维持麻醉，或维持呼吸频率约60次/分钟，处于外科麻醉平面（对脚趾或尾部夹捏无反应）。
  6. 在动物眼睛上涂抹眼膏，以在整个手术过程中保持眼球润滑。
  7. 皮下注射镇痛药混合物（0.1 mg/kg布托啡诺）和非甾体抗炎药（5 mg/kg卡洛芬），单次注射；除非当天早些时候已进行TBI操作，此时动物已接受过镇痛和抗炎药物。
    注意：如果首次TBI与脑电图电极植入手术间隔超过8小时，或首次给药后8小时动物出现疼痛迹象，则应再次给予布托啡诺，但不应联合使用卡洛芬。
  8. 皮下注射乳酸钠溶液（每克动物体重3 µL），以补充动物体内的液体和电解质。
    注意：若手术在TBI后立即进行，此步骤需合理安排时间。动物在操作过程中应每2小时注射一次乳酸钠溶液，手术后再追加一次，距离上一次注射间隔2小时。
  9. 使用脱毛膏去除头皮上的毛发。
  10. 切口前，用聚维酮碘外科消毒液和70%乙醇交替擦拭头皮皮肤，每次使用无菌纱布以环形方式擦拭3次，每种溶液各20秒。
  11. 使用手术刀沿头顶部中线做前后方向切口，从眼睛上方延伸至头部后方。此头皮开放方式优于完全切除头皮，因为皮瓣可覆盖或环绕脑电帽密封，提供更稳定的固定。
    注意：当准备植入3-脑电头帽时，必须切除头皮，因为头帽尺寸较大，无法将皮瓣覆盖在其上方闭合。
  12. 用小型止血钳夹住切开的皮肤边缘，扩大切口区域。若切口后出现出血，用无菌棉纱或棉签清洁止血。
  13. 用手术刀片轻轻刮除骨膜（即颅骨表面的薄层膜）。此步骤中若发生出血，用无菌棉签按压出血部位直至止血。
  14. 使用无菌棉签蘸取过氧化氢清洁颅骨，避免接触暴露颅骨区域周围的软组织。重复此步骤，直至颅骨表面无任何软组织残留，呈现白色外观。
  15. 用无菌纱布或棉签将颅骨擦干。
    注意：步骤3.12−3.15对于电极和牙科水泥的正确固定至关重要。任何残留的软组织、未电凝的出血点或碎屑均可能导致感染、头帽固定不稳、信号失真或缺失，以及术后数天至数周内植入物脱落。

4. 电极放置

  1. 植入单通道脑电图（1EEG）头帽。
    注意：立体定位坐标中的缩写代表空间关系，表示在动物头部特定方向上目标位置与前囟之间的距离（单位为毫米）：前后方向（AP）和内外侧方向（ML）。由于本方案中所有电极均置于硬脑膜外间隙，而非脑内特定结构中，因此不适用背腹方向（dorsal-ventral）。图3）。Vin+ 是一个活性电极，Vin- 是其参考电极。
    1. 使用高速钻机配合钢制钻头（0.5 mm，圆形， ¼ 在约每分钟5,000至6,000转（rpm）的转速下钻出六个颅骨孔（三个用于固定螺钉，三个用于电极），使用所提供的立体定位坐标12对于前部两颗螺钉：AP = +1.5 mm，ML = ±1.5 毫米；后方螺钉：AP = -5.2 毫米，ML = -1.5 毫米；接地电极：AP = -5.2 毫米，ML = +1.5 毫米；记录电极：AP = -2.3 毫米，ML = ±2.7 mm，Vin+ 在右侧，Vin- 在左侧。
    2. 使用螺丝刀拧入三颗螺丝以增强头部固定装置的稳定性，每颗螺丝旋转1−1.5圈，使其牢固固定于颅骨中。
      注意：将螺钉置入过深会损伤脑组织。
    3. 将1EEG头帽插入立体定位仪的持握臂中，并调整头帽位置，使三个电极位于颅骨中线上。在此配置下，接地电极及其在头帽顶部对应的开口位于后方，Vin+ 电极位于中间，Vin- 电极位于前方。可使用永久性记号笔在头帽上做标记。
    4. 将每根电极弯曲90度° 使每根导线的末端向下弯曲，并置于相应的钻孔上方。然后，量取导线垂直于钻孔部分的1 mm长度，剪去多余部分（图3）。这将确保电极置于硬脑膜外。电极应轻微接触硬脑膜表面。
    5. 降低头帽并调整所有三个电极，使其与相应的颅骨钻孔对齐。对于硬膜外记录，电极必须放置在硬脑膜上方或刚好接触硬脑膜。
    6. 通过混合调配牙科水泥以备使用 ½ 用刮勺取适量粉末，加入数滴溶剂，使用搅拌铲混合，直至最终混合物呈腻子状，具有黏性但可塑，并且足够坚硬，以便放置在动物颅骨上时能够充分压实。
    7. 将牙科水泥混合物涂覆于所有螺丝和电极上，并等待约3−5分钟使其凝固。注意切勿将牙科水泥覆盖在塑料基座上，否则将无法通过尾线将动物连接至换向器。
    8. 松开夹住皮瓣的止血钳，通过将皮瓣围绕塑料基座缝合来关闭切口。滴加数滴组织粘合剂（参见 材料表)以缝合皮肤瓣。
    9. 用氯己定消毒剂涂抹植入部位周围区域，以避免感染。如果动物在诱导创伤性脑损伤期间注射乳酸钠溶液后，麻醉时间超过2小时，需皮下追加一次注射。为维持动物适当的水合状态，每2小时重复注射一次，即动物在麻醉状态下每持续2小时注射一次。
    10. 术后，于上次注射后2小时给予最后一次乳酸钠溶液注射。若手术时长不足2小时，则从首次注射起2小时后给予最后一次乳酸钠溶液恢复剂量。
    11. 将动物从立体定位装置中取出，并在脑电图手术后测量其体重，作为后续监测的参考。由于植入物的存在，动物的体重将比术前有所增加。
    12. 将动物置于干净的笼子中，并放在温暖的加热垫上以供恢复。
  2. 植入双通道脑电图和单通道肌电图（2EEG/1EMG）头帽。
    1. 以颅骨前囟作为头帽放置的定位标志。涂抹少量组织粘合剂（参见 材料表将2EEG/1EMG头帽的底面朝向颅骨表面放置，注意避开四个螺钉孔。
      注意：该头帽的放置没有特定的坐标。头帽长8 mm，宽5 mm，可覆盖大部分颅骨表面。将头帽的前缘定位 ῀位于前囟前3.0 mm处为最佳位置，可提供良好的信号质量。在组织粘合剂固化前需快速手动固定。组织胶完全固化约需5分钟。
    2. 使用无菌的23 G针头，通过颅骨固定装置上的四个开口为螺钉钻出导向孔。操作时，轻柔推进针头并缓慢旋转，直至针尖穿透颅骨，避免损伤脑组织。使用无菌棉签清除导向孔处的出血。
    3. 将0.10英寸的螺钉插入导孔并旋转，直至每个螺钉固定在颅骨中。螺钉旋入深度可达其长度的一半，但不可完全旋入，以免损伤硬脑膜和皮层。如果头帽的位置导致颅骨表面与头帽后端之间存在间隙，则在后部使用两个0.12英寸的螺钉。
    4. 在双组分环氧树脂（银-环氧）双包装袋的两侧剪开小口。取一把双面铲刀，用每一面分别从包装袋中 scoop 取少量且等量的两种组分，然后将其混合均匀。每次仅取足一次手术使用的量，因为混合物会在 20 分钟内固化。密封包装袋两侧，防止干燥。
      注意：银-环氧树脂可确保螺钉与头帽之间形成良好的电接触，并增强螺钉的稳定性。
    5. 在螺钉头与螺钉孔之间涂抹少量该混合物，然后拧紧每个螺钉，直至其头部紧贴植入基座。确保两枚螺钉之间无银-环氧树脂接触，因为每枚螺钉均作为独立电极使用；为保证信号准确，螺钉之间不得相互接触。
    6. 如果银-环氧树脂混合物位置不当，可在几秒钟内迅速小心地挖除多余部分，以分离连接。小心地将肌电图导线从头帽后缘沿着动物头部和颈部的轮廓弯曲，然后插入项部肌肉中。
    7. 通过混合调配牙科水泥以备使用 ½ 用刮勺取适量粉末，加入数滴溶剂，使用搅拌铲混合并搅拌，直至最终混合物呈腻子状，具有黏性但可塑，并且足够坚硬，以便放置在动物颅骨上时能够被充分压实。
    8. 涂抹牙科水泥混合物，覆盖整个头帽，但避免覆盖六个针孔，否则将无法连接前置放大器。等待约3−5分钟，使水泥固化。确保皮肤未被牙科水泥与头帽密封在一起。
    9. 松开夹住皮瓣的止血钳，通过将皮瓣围绕塑料基座缝合来关闭切口。滴加数滴组织粘合剂以封闭皮瓣。
      注意：如果皮肤切口被延长以方便肌电图导线拉直，则可用组织粘合剂封闭皮肤或进行缝合。通常使用组织粘合剂封闭皮肤已足够。然而，如果在术后监测过程中观察到切口裂开，则建议改用缝合。
    10. 用氯己定消毒剂涂抹植入部位周围，以避免感染。给予乳酸钠溶液（3 µ每克动物体重给予 L 单位，皮下注射，以补充液体和电解质，若动物在上次注射后麻醉时间超过 2 小时。
    11. 将动物从立体定位装置中取出，并在脑电图手术后测量其体重，作为后续监测的参考。由于植入物的存在，动物的体重将比术前有所增加。
    12. 将动物置于干净的笼子中，笼下放置加热垫以保持温暖，并提供恢复凝胶和少量湿润的饲料颗粒以助恢复。
  3. 植入三通道脑电图（3EEG）头帽。
    1. 使用高速钻机配合钢制钻头（0.5 mm，圆形， ¼以约 5,000−6,000 转/分钟的速度钻出六个颅骨孔（三个用于固定螺钉，三个用于电极），所用坐标依据提供的立体定位参数12. 对于 EEG1 和 EEG2 的接地与公共参考：AP = 5.2 mm，ML = ±1.5 毫米；EEG1 和 EEG2：AP = -3.0 毫米，ML = ±3.0 毫米；独立 EEG3：AP = -1.4 毫米，ML = ±1.5 mm
    2. 将六个螺钉电极置入钻孔中。
      注意：将螺钉置入过深会造成脑组织严重损伤。螺钉电极可提供更好的头帽固定稳定性。
    3. 准备牙科水泥，通过混合一种 ½ 用刮勺取适量粉末，加入数滴溶剂。使用搅拌铲搅拌，直至最终混合物呈腻子状，具有黏性但可塑，并且足够坚硬，以便放置在动物颅骨上时能够充分压实。
    4. 将牙科水泥混合物涂抹于颅骨所有暴露的表面及每个螺钉电极上，确保皮肤未被牙科水泥与头帽密封。等待约1−2分钟，使水泥轻微固化。无需等待水泥完全固化即可进行下一步操作。
    5. 打开电烙铁进行加热。将3EEG头帽固定在立体定位仪的夹持臂中。
      注意：将头帽放置到位，使六根导线的位置与每个螺钉电极的导线位置相对应。
    6. 将头帽降低，使其腹侧部分置于牙科水泥上方。
    7. 将每个螺钉电极的导线与头帽上对应的导线引线拧在一起。
      注意：接错导线会导致数据解读复杂化或无法进行。
    8. 用剪刀小心剪去多余的导线。将每对绞合的导线进行焊接，以确保良好的信号传导。
      注意：每对导线必须与其他导线对接触，否则信号质量和数据解读将受到影响。
    9. 将每对焊接好的导线绕在头帽周围，避免各对导线之间相互接触。
      注意：如果导线未剪至足够短，在绕过头部固定装置时可能难以避免触碰到其他导线。此时，应先弯曲其中一对导线，用牙科水泥混合物覆盖，等待约1−2分钟使其固化，然后以相同方式处理下一对导线。
    10. 用牙科水泥完全覆盖所有导线，仅暴露头帽的黑色部分。
      注意：切勿将牙科水泥粉末或混合物涂抹到暴露的颅骨固定头座顶部，任何孔洞内的碎屑或水泥都会阻断接触，导致信号缺失或产生噪声。
    11. 松开夹住皮瓣的止血钳。在植入物周围区域涂抹氯己定消毒剂，以防止感染。
    12. 注射乳酸钠溶液（3 µ每克动物体重皮下注射 L，以补充液体和电解质，适用于动物在上次注射后麻醉时间超过 2 小时的情况。
    13. 将动物从立体定位装置中取出，并在脑电图手术后测量其体重，作为后续监测的参考。由于植入物的存在，动物的体重将比术前有所增加。
    14. 将动物置于干净的笼子中，笼内放置温暖的加热垫，并提供恢复凝胶和少量湿润的饲料颗粒以助恢复。
      注意：过氧化氢有助于去除颅骨上残留的任何软组织。

5. 将动物连接至采集系统

  1. 用双手轻轻捧住动物，将其从饲养笼中取出，并转移到具有平坦表面的清洁区域，例如动物转移站（ATS）。
  2. 轻轻抓住小鼠背部的皮肤。切勿抓握动物的尾巴，以免引起应激反应。
  3. 识别脑电图头帽上对应于接地电极的开口，并将连接线的相应引针对准插入，以确保正确连接。
    注意：若将连接线从换向器连接至动物头帽时方向接反，将导致电极信号读数错误，并可能产生波形失真。
  4. 将动物放回饲养笼后，将连接线的另一端（脑电图系统1）或前置放大器（脑电图系统2）连接至换向器。
    注意：当将前置放大器（脑电图系统2）与来自换向器的连接线连接时，请对齐两端连接线上的白色标记。若接反，将导致放大器永久性损坏，需由制造商进行昂贵的维修。
  5. 轻轻旋转连接动物与换向器的连接线，以确保旋转机制正常工作，且动物能够自由活动。

6. 脑电图数据采集设置

  1. 设置脑电图系统1的采集参数。
    1. 将采样率设为500 Hz；增益设为5,000；模式设为Norm 35 Hz；LPN关闭。高通滤波器设为0.5 Hz。
      注：100 Hz（低通）为内置设置，无需手动输入。
  2. 设置脑电图系统2的采集参数。
    1. 将采样率设为600 Hz；前置放大器增益设为100；增益设为1（EEG1,2）。低通滤波器设为100 Hz。
      注：1 Hz（高通）为内置设置，无需手动输入。

7. 视频数据采集设置

  1. 设置 EEG 系统 1 的采集参数。
    注意：需要第三方视频采集系统以获取同步的视频数据。
    1. 为获得适当的视频质量，将帧率设置在 15（推荐最低值）至 30（最高可用值）之间。将分辨率设置为 640 × 640 像素。将压缩类型设置为 H.264H。
  2. 设置 EEG 系统 2 的采集参数。
    注意：该 EEG 系统提供视频系统和软件，可将视频与 EEG 数据同步整合为单个文件，最多支持四只动物（参见材料表）。
    1. 为获得适当的视频质量，将帧率设置在 15（推荐最低值）至 30（最高可用值）之间。将分辨率设置为 640 × 480 像素。将压缩类型设置为 WebM 文件格式。

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结果

此处所述方案介绍了一种使用小鼠重复性弥散性创伤性脑损伤（TBI）模型，单独诱导弥散性损伤（例如，在无局灶性病灶的情况下）的方法。图1). 图1A 展示了重量下落装置及其组件（图1A，a1−a5用于在此模型中诱导TBI的关键步骤及操作过程中的关键环节（图1B，b1−b5).

该模型的特点包括：由于创伤性脑损伤（TBI）所致的脑部无局灶性病灶、意识丧失、高存活率以及迟发性癫痫发作的出现（>创伤性脑损伤（TBI）后1周，部分TBI小鼠在经历至少三周的潜伏期后出现自发性、无诱因的反复发作性癫痫。

本方案详细演示了建立无菌手术区域的步骤（图2

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讨论

与诱导局灶性损伤或局灶性与弥漫性损伤结合的 CCI 和 FPI 模型不同，本方案中描述的重复性弥漫性创伤性脑损伤模型可在无局灶性脑损伤的情况下诱导弥漫性损伤，且无需进行头皮或颅骨开窗，从而避免了相关的炎症反应。该模型无需实施颅骨切除术的另一优势在于，不仅可植入电极用于慢性连续脑电图（EEG）记录，还可制备减薄颅骨的颅窗，以便在创伤性脑损伤（TBI）前、损伤后即刻以及损伤后数天、数周甚至数月内，对动物进行长期活体双光子成像，如 Shandra 和 Robel 201913 所述。

无论选择哪种动物模型，所采用的数据采集方法都是任何成功且全面研究的关键要素。在创伤后癫痫的啮齿类动物模型中，癫痫发作频率较低14，平均每天仅发生0.3−0.4次发作9,15，且首次发作前的潜伏期可能在初始创伤性脑损伤（TBI）手术后持续数天、数周甚至数月。最后，与非创伤性模型相比，后者通常在较短时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/美国）以及美国国防部（DoD）通过心理卫生与创伤性脑损伤研究计划（Award No. W81XWH-15-2-0069）向CURE提供的资助支持。特此感谢Ivan Zuidhoek对稿件的校对工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.10" 螺钉Pinnacle Technology Inc., KS, USA82090.10 英寸长，不锈钢材质
0.10" 螺钉Pinnacle Technology Inc., KS, USA84030.10 英寸长，带预焊导线引线
0.12" 螺钉Pinnacle Technology Inc., KS, USA82120.12 英寸长，不锈钢材质
1EEG 头部连接器Invitro1 (Plastics One 的子公司), VA, USAMS333/8-A/SPC3 根独立的聚四氟乙烯绝缘铂铱合金导线电极（可绞合或非绞合，直径 0.005 英寸），延伸至螺纹塑料基座下方
2EEG/1EMG 头部连接器Pinnacle Technology Inc., KS, USA82012 通道 EEG / 1 通道 EMG
3% 过氧化氢药房
3EEG 头部连接器Pinnacle Technology Inc., KS, USA8235-SM-C定制 6 针连接器，用于 3 通道 EEG
布托啡诺Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA060969
布托啡诺Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA060969
C57BL/6 小鼠Harlan/Envigo Laboratories Inc雄性，12–16 周龄
C57BL/6 小鼠The Jackson Laboratory雄性，12–16 周龄
卡洛芬Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA026357注：仅在同日进行立体定位电极植入时，在体重跌落过程中添加该药物
氯己定消毒剂药房
牙科水泥与溶剂套装Stoelting Co., USA51459
钻机ForedomHP4-917
钻头Meisinger USA, LLC, USAHM1-005-HP0.5 mm，圆形，1/4，钢制
干式灭菌器Cellpoint Scientific, USAGerminator 500
EEG 系统 1Biopac Systems, CA, USA
EEG 系统 2Pinnacle Technology Inc., KS, USA
乙醇 ≥70%VWR, USA71001-652KOPTEC USP，生物技术级（140 Proof）
眼膏Pro Labs Ltd, USA可在普通线上商店和药房购买的 Puralube Vet Ointment 无菌眼用润滑剂
吸入麻醉用氟利索液体MWI Veterinary Supply Co., USA502017
脱毛产品Church & Dwight Co., Inc., USANair 乳霜
异氟烷MWI Veterinary Supply Co., USA502017
聚维酮碘外科溶液Purdue Products, USA004677贝塔碘
Rimadyl/卡洛芬Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA026357
焊料五金店
电烙铁Weller, USAWP35ST7 型烙铁头，0.8 mm
不锈钢圆盘定制制作
无菌棉签
无菌纱布垫Fisher Scientific, USA22362178
无菌带衬垫吸水毛巾垫Cardinal Health, USA3520
组织粘合剂3M Animal Care Products, USA1469SB

参考文献

  1. Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
  2. Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
  3. Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
  4. Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342(2016).
  5. Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
  6. Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
  7. Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  8. Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
  9. Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
  10. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  11. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  12. Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
  13. Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
  14. Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
  15. Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
  16. Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
  17. Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).

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诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫
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