在重复性扩散创伤性脑损伤小鼠模型中诱导创伤后癫痫

Summary

此系统协议描述了重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的新动物模型。第一部分详细介绍了使用修改后的降重模型进行创伤性脑损伤诱导的步骤。第二部分对单通道和多通道脑电图数据采集系统的手术方法进行了说明。

Abstract

创伤性脑损伤（TBI）是后天性癫痫的主要原因。TBI 可导致焦点或扩散性脑损伤。焦点损伤是直接机械力的结果，有时穿透颅骨，在脑组织中产生直接病变。这些在脑成像过程中可见，作为有挫伤、撕裂和出血的区域。焦点病变导致神经元死亡和胶质疤痕的形成，并且存在于所有发生 TBI 的 20% -25% 的人的中。然而，在大多数TBI病例中，损伤是由加速减速力和随后的组织剪切引起的，导致非焦、漫反射损伤。TBI患者的亚群在几个月或几年的潜伏期后继续发展创伤后癫痫（PTE）。目前，无法预测哪些患者会患上PTE，PTE患者的癫痫发作难以控制，需要进一步研究。直到最近，该领域仅限于两个经过验证的自发创伤后发作的动物/啮齿动物模型，两者都出现大的焦点病变，皮层和有时皮下结构组织大量丧失。与这些方法相反，确定使用改良的降重模型诱导的漫射TBI足以启动自发性惊厥和非抽搐发作的发展，即使在没有焦点病变或组织损失的情况下也是如此。与获得性创伤后癫痫的人类患者类似，该模型在发作前呈现损伤后的潜伏期。在该协议中，将为社区提供创伤后癫痫的新模型，详细说明如何诱导扩散性非病变TBI，然后持续进行持续的长期视脑动物监测，持续几个月。该协议将详细说明动物处理、重量下降程序、两个采集系统的电极放置，以及手术、术后监控和数据采集过程中遇到的频繁挑战。

Introduction

每年，TBI 影响全世界大约 6000 万人。受影响的个人患癫痫的风险较高，癫痫发作后数年可能显现出来。虽然严重的TBI与较高的癫痫风险有关，即使是轻微的TBI也会增加个人患癫痫^{的几率1，2，3，4。}所有 TI 都可以分类为焦距、漫反射或两者的组合。扩散性脑损伤，存在于许多（如果不是全部）的TbIs中，是由于加速减速和旋转力导致不同密度的脑组织相互剪切的结果。根据定义，扩散损伤只发生在轻度/脑震荡非穿透性脑损伤中，其中在计算机断层扫描⁵中看不到脑损伤。

目前，在管理患有或有发生创伤后癫痫（PTE）风险的患者方面，存在两个关键问题。第一，一旦PTE出现，癫痫发作对现有的抗癫痫药物（AEDs）有抗药性^6。其次，AED在预防癫痫发作方面同样无效，没有有效的替代治疗方法。为了解决这个缺陷，并找到更好的治疗目标和治疗候选，有必要在^PTE6的根部探索新的细胞和分子机制。

创伤后癫痫的一个突出特征是初始创伤事件与自发、无端、复发性发作之间的....

Protocol

本议定书中描述的所有动物程序均按照弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）执行，并符合美国国家卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》。.

1. 动物处理协议

注:本协议旨在将从供应商订购的动物在抵达后安排到设施，并规定它们由实验者处理。这通过减少压力和焦虑来改善动物福祉，并简化某些需要处理动物的程序，包括诱导TBI、术后监测以及将动物连接到采集系统。

1. 当从供应商那里接收到许多动物时，耳标并随机将它们分配给实验组 （TBI） 或对照组（沙姆手术），同时将它们组合在 2-5 只动物的笼子里。房子TBI动物与假动物分开，因为假老鼠偶尔会对接受TBI的老鼠采取积极行动。
2. 处理第 1 天（耳挂后 24–48 小时）:准备记录动物耳标、出生日期、处理日期、处理日期的动物重量、处理时间以及评论和观察部分的图表。
3. 用双手轻轻杯住动物。不要抓住动物的尾巴，因为它诱导防御机制和压力反应。
4. 检查并记录动物的耳标。
5. 将动物放在容器中的重量秤上并记录重量。
6. 再次用双手轻轻将动物杯起，并处理1分钟，让它在手中移动和探索。在手术室的长凳上执行，小心不要把动物扔到地板上。
7. 处理1分钟后，将动物放回笼子里。
8. 对笼子里的其他动物重复步骤1.3×1.7。
9. 处理第 2....

Results

此处概述的协议描述了使用重复扩散 TBI 的小鼠模型（图 1）隔离诱导漫射损伤的方法（例如，在没有焦点病变的情况下）。图 1A描述了用于在此模型中诱导 TBI 的降重装置及其组件（图1A、a1_a5）以及过程中的关键步骤（图 1B，b1_b5）。

该模型的特点包括缺乏由于TBI对大脑的焦点病变，意识丧失，高存活率，出现晚期发作（>1周的TBI），以及自发的，无端的，复发性发作的子集TBI 小鼠在 TBI 之后的延迟期至少三周后。

该协议演示了设置干净外科场的详细程序（图2），提供了植入不同电极阵列的分步方法（

Discussion

与 CCI 和 FPI 模型诱导焦力或焦点和漫反射损伤的组合不同，本协议中描述的重复扩散 TBI 模型允许在没有焦点脑损伤的情况下诱导扩散损伤，并且不需要头皮或颅开口和相关炎症。该模型中没有颅切除术的一个附加好处是，它不仅允许植入用于慢性连续脑电图记录的电极，而且还可以创建一个薄颅骨窗口，用于在动物之前、紧接之后、之后、再重复几天、几周甚至几个月，如Sandra和Robel 2019¹³中所述的TBI之后进行慢性活体2光子成像。

无论选择哪种动物模型，采用的数据采集方法是任何成功和全面研究的关键要素。在创伤后癫痫的啮齿动物模型中，癫痫发作频率低^14，每天0.3-0.4次发作，第^9、15次发作之前，潜伏期可以在最初的TBI手术后几天或几周甚至几个月之间持续。最后，与非创伤模型相比，在较短的时间内发作的发生率普遍较高，平均只有9%-50%患有TBI的动物在长达6个月

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10 英寸螺丝	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国	8209	0.10 英寸长
0.10 英寸螺丝	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国	8403	0.10 英寸长，带预焊接导线
0.12 英寸螺丝	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国	8212	0.12 英寸长
1EEG 头戴式	Invitro1（Plastics One 的子公司），弗吉尼亚州，美国	MS333/8-A/SPC	3 个单独的特氟龙绝缘铂铱丝电极（双绞或未双绞，直径 0.005 英寸）延伸到螺纹塑料基座下方
2EEG/1EMG 头戴式	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国	8201	2EEG/1EMG 通道
3% 过氧化			药房
3EEG 头戴式	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国	8235-SM-C	用于 3EEG 通道的定制 6 针连接器
丁丙诺啡	Par Pharmaceuticals， Cos. Inc.，美国纽约州春谷	060969
丁丙诺啡	Par Pharmaceuticals， Cos. Inc.，美国纽约州春谷	060969
C57BL/6 小鼠	Harlan/Envigo Laboratories Inc		雄性，12-16 周龄
C57BL/6 小鼠	The Jackson Laboratory		雄性，12-16 周龄旧
卡普洛芬	Zoetis Services LLC，帕西帕尼，新泽西州，美国	026357	注意：只有在当天进行立体定向电极植入时，才会在体重下降期间添加这种药物
洗必泰消毒剂			药房
牙科水泥和溶剂套件	Stoelting Co.， USA	51459
钻头		Foredom HP4-917
钻头	Meisinger 美国有限责任	HM1-005-HP	0.5 毫米，圆形，1/4，钢
干式消毒器	Cellpoint Scientific，美国		Germinator 500
脑电图系统 1	Biopac Systems，加利福尼亚州，美国
脑电图系统 2	Pinnacle Technology Inc.，堪萨斯州，美国
乙醇和GE;70%	VWR，美国	71001-652	KOPTEC USP，生物技术级（140 度）
眼膏	Pro Labs Ltd，美国		Puralube Vet Ointment 无菌眼部润滑剂 一般网上商店和药店有售
用于吸入麻醉的 Fluriso 液体	MWI Veterinary Supply Co.，美国	502017
脱毛产品	Church &Dwight Co.， Inc.， USA		Nair 乳膏
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co.， USA	502017
聚维酮碘手术解决方案	Purdue Products， USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC， Parsippany， NJ， USA	026357
焊锡			Harware 商店
烙铁	Weller， USA	WP35	ST7 尖端，0.8mm
不锈钢盘			定制
无菌棉签
无菌纱布垫	Fisher Scientific， USA	22362178
无菌聚乙烯衬里吸水毛巾垫	Cardinal Health， USA	3520
组织胶粘剂	3M Animal Care Products， USA	1469SB