建立用于干细胞治疗的猪心肌梗死后心力衰竭模型

摘要

我们旨在建立一种通过左回旋支动脉阻塞和快速起搏诱导心力衰竭的猪模型，以评估干细胞心肌内移植在细胞治疗中的效果和安全性。

摘要

尽管在心肌梗死（MI）后心力衰竭（HF）的治疗方面已取得进展，但MI后的HF仍是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因之一。基于细胞的疗法在MI后心脏修复及改善左心室功能方面已引起广泛关注。因此，这些细胞移植疗法在临床应用前，应在HF的临床前大型动物模型中对其安全性和有效性进行测试。由于猪的心脏大小和冠状动脉解剖结构与人类相似，因此被广泛用于心血管疾病研究。为此，我们旨在提出一种有效的方案，通过闭胸状态下对左回旋支动脉（LCX）进行冠状动脉球囊阻塞，随后植入起搏器并实施快速心室起搏，建立猪慢性HF模型。八周后，通过心肌内注射将干细胞注入梗死周边区域。随后评估梗死面积、细胞存活情况以及左心室功能（包括超声心动图、血流动力学参数和电生理学指标）。本研究有助于建立一种稳定的用于干细胞治疗的临床前大型动物HF模型。

引言

心血管疾病，尤其是冠状动脉疾病（CAD），仍然是香港及全球发病率和死亡率的主要原因¹。据预测，2012年至2017年间，香港医院管理局治疗的CAD患者人数增加了26%²。在所有CAD中，急性心肌梗死（MI）是导致死亡和后续并发症（如心力衰竭（HF））的主要原因，给医疗、社会和经济带来沉重负担。对于MI患者，溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是挽救生命的有效疗法，但这些治疗仅能减少MI期间的心肌细胞（CM）丢失。现有疗法无法弥补CM的永久性丢失，从而导致心肌纤维化、心肌重构、心律失常，并最终发展为心力衰竭。MI发生后1年的死亡率约为7%，其中超过20%的患者会发展为HF³。对于终末期HF患者，心脏移植是目前唯一有效的治疗方法，但受限于可供移植器官的短缺。因此，亟需开发新型疗法以逆转MI后HF的进展。基于此，细胞治疗被视为修复受损CM、改善MI后心力衰竭患者左心室（LV）功能的一种有前景的策略。我们先前的研究发现，在MI小型动物模型中直接心肌内移植干细胞可改善心脏功能^4,5。因此，在临床应用前，亟需建立标准化的临床前大型动物HF模型，以进一步评估干细胞移植的有效性和安全性。

近几十年来，猪在用于干细胞治疗的心血管....

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》以及香港大学的相关规定，并经香港大学教学与科研活体动物使用委员会（CULTAR）批准。

注意：本研究使用体重为35-40 kg（9-12月龄）的雌性农场猪。本实验的流程图见图1。

1. 手术操作

1. 麻醉与动物准备
   1. 实验前将动物禁食12小时，并禁水4小时。
   2. 通过肌肉注射将替来他明+唑拉西泮（2–7 mg/kg）和赛拉嗪（0.5–1 mg/kg）溶于20 mL生理盐水中对猪进行麻醉。持续监测动物的眨眼反射，直至其消失。
   3. 去除猪的毛发，并对颈部和腹股沟部位的皮肤进行消毒，用于1.3–1.5节操作。用70%乙醇和碘伏对手术区域消毒3次。
   4. 将一根7 mm的气管插管插入猪的气管，并将一根22 G静脉留置针插入耳静脉。
   5. 将猪移至手术台，置于仰卧位。将气管插管连接至呼吸机，使用异氟烷（1.5%–2.0% 吸入浓度）和氧气（0.5–1.5 L/min 吸入流量）对动物进行机械通气，吸气/呼气时间比为1:2。
   6. 监测体表心电图和血压，并通过电生理记录系统持续监测心率、心律及动脉血压。
2. 超声心动图

结果

死亡率
本研究共使用了24头猪。其中3头在心肌梗死诱导期间因持续性室性心动过速而死亡。1头在开胸细胞注射手术中因伤口出血死亡。2头因严重感染死亡。另有2头因左心室射血分数（LVEF）下降程度较轻（较基线下降>40%）被排除。最终，共有16头动物完成了全部研究方案。

心脏功能与心室重构
连续超声心动图检查显示，左心室射血分数（LVEF）从基线时的 68.23 ± 3.52% 显著下降至心肌梗死（MI）诱导后 8 周时的 39.37 ± 3.22%。左心室舒张末期内径（LVEDD）从 3.6 ± 0.5 显著增加至 4.8 ± 0.4，左心室收缩末期内径（LVESD）从 2.5 ± 0.3 显著增加至 3.9 ± 0.4（图 4A）。与 MI 状态相比，在移植后 8 周，hi.......

讨论

标准动物模型对于理解疾病的病理生理学机制、探索疾病发生机制以及测试新型治疗方法至关重要。本方案建立了一种通过左回旋支动脉阻塞联合快速起搏诱导的猪心力衰竭模型。在心肌梗死诱导八周后，动物的左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室压力上升最大速率（+dP/dt）以及收缩末期压力-容积关系（ESPVR）均出现显著异常。本方案同时通过心肌内注射途径验证了干细胞疗法在心肌再生中的给药方式，并对梗死面积以及心脏的收缩和舒张功能进行了评估。本研究有助于建立一种稳定且可重复的、适用于干细胞治疗的临床前大型动物心力衰竭模型，该模型与临床病例具有高度相似性。

在我们之前的研究中，左回旋支（LCX）阻塞联合快速起搏已被广泛用于建立心力衰竭（HF）的动物模型^7,8。在第一钝缘支远端结扎LCX后，进行为期4周的右心室快速起搏。心肌缺血导致心肌梗死（MI）期间心肌细胞丢失，进而引发心肌纤维化、心肌重构和心律失常。心室起搏可引起显著的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胺碘酮	Mylan	-	-
麻醉机和呼吸机	Drager	Fabius plus XL	-
套管针	Becton Dickinson	381147	-
抗人核抗原抗体	abcam	ab19118	-
Axio Plus 图像采集系统	Zeiss	Axioskop 2 PLUS	Axioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 软件	Zeiss	-	-
拜耳动保	Bayer	-	恩诺沙星
贝迪碘	Mundipharma	-	-
CardioLab 电生理记录系统	GE Healthcare	G220f	-
培养基	MesenCult	05420	-
环孢素	Novartis	-	-
除颤器	GE Healthcare	CardioServ	-
多拉明	TEVA	-	-
超声心动图系统	GE Vingmed	Vivid i	-
EchoPac 软件	GE Vingmed	-	-
电生理导管	Cordis Corp	-	-
Embozene 微球	Boston Scientific	17020-S1	700 μm
气管插管	Vet Care	VCPET70PCW	7号
乙醇	VWR chemicals	20821.33	-
福尔马林	Sigma	HT501320	10%
下腔静脉球囊扩张导管	Boston Scientific	3917112041	Mustang
JR4 指引导管	Cordis Corp	67208200	6F
利多卡因	Quala	-	-
丝线缝合线	Ethicon	W584	2-0
琥珀酸美托洛尔	Wockhardt	-	-
切片机	Leica	RM2125RT	-
移动C型臂X光透视设备	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	-
起搏器	St Jude Medical	PM1272	Assurity MRI 起搏器
起搏器脉冲发生器	St Jude Medical	Merlln model 3330	-
压力-容积导管	CD Leycom	CA-71103-PL	7F
压力–容积信号处理器	CD Leycom	SIGMA-M	-
可编程刺激器	Medtronic Inc	5328	-
PTCA球囊扩张导管	Boston Scientific	H7493919120250	MAVERICK over the wire
雷米普利	TEVA	-	-
鞘管导入器	Cordis Corp	504608X	8F, 9F, 12F
类固醇	Versus Arthritis	-	-
特耐	Nindivior	-	丁丙诺啡
静脉留置针	TERUMO	SR+OX2225C	22G
薇乔缝线	Ethicon	VCP320H	2-0
赛拉嗪	Alfasan International B.V.	-	-
速眠新	Virbac New Zealand Limited	-	替来他明+唑拉西泮