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方法文章

建立用于干细胞治疗的猪心肌梗死后心力衰竭模型

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DOI：

10.3791/60392

⸱

2020年5月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiology Division, Department of Medicine, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong, 2Shenzhen Institutes of Research and Innovation, University of Hong Kong

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们旨在建立一种通过左回旋支动脉阻塞和快速起搏诱导心力衰竭的猪模型，以评估干细胞心肌内移植在细胞治疗中的效果和安全性。

摘要

尽管在心肌梗死（MI）后心力衰竭（HF）的治疗方面已取得进展，但MI后的HF仍是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因之一。基于细胞的疗法在MI后心脏修复及改善左心室功能方面已引起广泛关注。因此，这些细胞移植疗法在临床应用前，应在HF的临床前大型动物模型中对其安全性和有效性进行测试。由于猪的心脏大小和冠状动脉解剖结构与人类相似，因此被广泛用于心血管疾病研究。为此，我们旨在提出一种有效的方案，通过闭胸状态下对左回旋支动脉（LCX）进行冠状动脉球囊阻塞，随后植入起搏器并实施快速心室起搏，建立猪慢性HF模型。八周后，通过心肌内注射将干细胞注入梗死周边区域。随后评估梗死面积、细胞存活情况以及左心室功能（包括超声心动图、血流动力学参数和电生理学指标）。本研究有助于建立一种稳定的用于干细胞治疗的临床前大型动物HF模型。

引言

心血管疾病，尤其是冠状动脉疾病（CAD），仍然是香港及全球发病率和死亡率的主要原因1。据预测，2012年至2017年间，香港医院管理局治疗的CAD患者人数增加了26%2。在所有CAD中，急性心肌梗死（MI）是导致死亡和后续并发症（如心力衰竭（HF））的主要原因，给医疗、社会和经济带来沉重负担。对于MI患者，溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是挽救生命的有效疗法，但这些治疗仅能减少MI期间的心肌细胞（CM）丢失。现有疗法无法弥补CM的永久性丢失，从而导致心肌纤维化、心肌重构、心律失常，并最终发展为心力衰竭。MI发生后1年的死亡率约为7%，其中超过20%的患者会发展为HF3。对于终末期HF患者，心脏移植是目前唯一有效的治疗方法，但受限于可供移植器官的短缺。因此，亟需开发新型疗法以逆转MI后HF的进展。基于此，细胞治疗被视为修复受损CM、改善MI后心力衰竭患者左心室（LV）功能的一种有前景的策略。我们先前的研究发现，在MI小型动物模型中直接心肌内移植干细胞可改善心脏功能4,5。因此，在临床应用前，亟需建立标准化的临床前大型动物HF模型，以进一步评估干细胞移植的有效性和安全性。

近几十年来，猪在用于干细胞治疗的心血管研究中得到了广泛应用。由于猪在心脏大小、重量、节律、功能以及冠状动脉解剖结构方面与人类高度相似，因此心力衰竭（HF）猪模型成为转化研究中极具前景的动物模型。此外，在缺血条件下，猪的HF模型能够在心肌代谢、电生理特性以及神经内分泌改变等方面模拟心肌梗死（MI）后HF患者的病理特征6。本方案采用一种标准化的猪HF模型，通过闭胸状态下对左回旋支冠状动脉（LCX）进行球囊阻塞，随后经起搏器植入实现快速起搏以诱导心力衰竭。本研究还优化了干细胞治疗MI后HF的心肌内给药途径。其目的在于建立一种慢性心肌梗死的猪动物模型，用于开发针对严重冠状动脉疾病（CAD）患者的具有临床相关性的治疗方法。

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方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》以及香港大学的相关规定，并经香港大学教学与科研活体动物使用委员会（CULTAR）批准。

注意：本研究使用体重为35-40 kg（9-12月龄）的雌性农场猪。本实验的流程图见图1。

1. 手术操作

  1. 麻醉与动物准备
    1. 实验前将动物禁食12小时，并禁水4小时。
    2. 通过肌肉注射将替来他明+唑拉西泮（2–7 mg/kg）和赛拉嗪（0.5–1 mg/kg）溶于20 mL生理盐水中对猪进行麻醉。持续监测动物的眨眼反射，直至其消失。
    3. 去除猪的毛发，并对颈部和腹股沟部位的皮肤进行消毒，用于1.3–1.5节操作。用70%乙醇和碘伏对手术区域消毒3次。
    4. 将一根7 mm的气管插管插入猪的气管，并将一根22 G静脉留置针插入耳静脉。
    5. 将猪移至手术台，置于仰卧位。将气管插管连接至呼吸机，使用异氟烷（1.5%–2.0% 吸入浓度）和氧气（0.5–1.5 L/min 吸入流量）对动物进行机械通气，吸气/呼气时间比为1:2。
    6. 监测体表心电图和血压，并通过电生理记录系统持续监测心率、心律及动脉血压。
  2. 超声心动图
    1. 将猪置于左侧卧位，并固定于手术台上。
    2. 将探头置于心包区域，使用高分辨率超声心动成像系统和3-9 MHz探头，在基线期、细胞移植前以及细胞移植后8周，进行系列超声心动图检查，包括二维和M型成像。补充图1).
    3. 使用商业软件分析所有获得的图像。在获取标准的胸骨旁长轴切面超声心动图图像后，计算左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室射血分数（LVEF）以及室壁厚度。
      注意：所有离线分析均由另一位独立操作员使用计算机工作站完成。基于20次重复的随机图像，不同观察者之间测量结果的变异率为4%。所有超声心动图测量均按照美国超声心动图学会的建议进行。
  3. 起搏器植入术
    1. 将猪置于仰卧位，并用绑带将其四肢固定在手术台上。
    2. 在颈动脉三角内（位于胸锁乳突肌后方，由茎突舌骨肌、二腹肌和肩胛舌骨肌围成）定位右侧颈总动脉和颈静脉，在无菌条件下使用止血钳分离右侧颈总动脉和颈静脉补充图2结扎右侧颈动脉和颈外静脉的远端。 用2-0 Vicryl缝线缝合两块肌肉。
    3. 在X射线引导下，用套管针穿刺右侧颈静脉，并将起搏电极导线插入右心室图2).
    4. 用镊子分离胸锁乳突肌和前斜角肌。将起搏器植入两肌肉之间，并用2-0丝线缝合两块肌肉。将起搏器与导线连接。
    5. 移植后通过起搏器程控仪将起搏器重置为备用VVI模式（35 bpm）。
    6. 在心肌梗死（MI）诱导4周后，使用起搏器发生器进行快速心室起搏（150次/分钟），以诱导心力衰竭（HF）。然后在第8周将起搏器恢复至备用VVI模式。
  4. 侵入性压力-容积环分析
    注意：在基线期、细胞移植前以及细胞移植后8周进行有创血流动力学评估，以检测左心室功能的变化。
    1. 在股三角区（由腹股沟韧带、缝匠肌和长收肌围成）分离右侧股动脉和股静脉补充图2).
    2. 用套管针穿刺右侧股动脉，并通过套管针将导丝置入动脉。移除套管针，在导丝引导下将9F鞘管插入动脉。取出导丝。
    3. 按照步骤1.4.2所述，用12F鞘管穿刺右侧股静脉。在X射线引导下，从已置入的12F鞘管插入球囊导管至下腔静脉（IVC）。
    4. 使用压力-容积（PV）信号处理器，在等渗盐水中校准7 Fr压力-容积（PV）导管。
    5. 在X射线引导下，经已置入的9F鞘管将压力-容积（PV）导管插入左心室心尖部。暂停通气，利用PV信号处理器测量左心室最大压力上升速率（+dP/dt）、收缩末期压力（ESP）和舒张末期压力（EDP）。
    6. 通过下腔静脉（IVC）阻断期间使用压力-容积（PV）信号处理器测量收缩末期压力-容积关系（ESPVR）。
    7. 操作结束后重新启动通气。
  5. 心肌梗死的诱导
    1. 在诱导心肌梗死前，通过静脉给予动物胺碘酮（5 mg/kg，静脉输注1小时）和利多卡因（1.5 mg/kg，静脉推注），以预防室性心律失常。
    2. 按照步骤1.4.3所述，用8F鞘管插管右侧颈动脉。
    3. 通过已置入的鞘管，在标准C臂X线透视设备引导下，使用6F JR4导丝引导导管进行冠状动脉造影。
    4. 在X射线引导下，使用经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）扩张球囊导管，阻断第一钝缘支远端的左回旋冠状动脉（LCX）图2).
    5. 注射1 mL 700 µm海绵微球与3混合 通过球囊导管注入用10 mL注射器配制的生理盐水，阻断左回旋支（LCX），然后使球囊 deflated，并进行血管造影以确认闭塞。
    6. 重复注射操作以实现成功且完全的阻滞。
    7. 监测动物的心率和心律，以检测心律失常。若发生心室颤动，使用外部双相除颤器，以150-300 J电击恢复窦性心律。
  6. 干细胞注射
    1. 随机分配所有心功能明显受损（LVEF）的动物 < 40%（诱导心肌梗死8周后）分为两组：一组接受心肌内注射2 x 108 人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞（hiPSC-MSCs）组，以及不接受hiPSC-MSCs的对照组。
    2. 用2 mL生理盐水制备hiPSC-MSCs用于心肌内移植。在进行hiPSC-MSCs心肌内移植前，重复第1.1节所述的麻醉和动物准备步骤，此次需对心尖搏动区周围10 cm范围进行消毒。在第4-5肋间行左胸廓切开术，并使用牵开器暴露术野。行心包切开术以暴露梗死的侧壁。
      注意：切口长度为10-12 cm。
    3. 在梗死区域周围进行5-8次心肌内注射（每次约0.3 mL），注入培养基材料表) 向一组动物给予或向另一组动物给予 2 x 108 hiPSC-MSCs（图3. 小心避免 任何 冠状动脉损伤以降低出血风险。
    4. 用铁丝缝合肋间间隙，用2-0丝线缝合肌层。用2-0薇乔线缝合皮下组织和皮肤。
  7. 心内程序性电刺激
    1. 使用可编程刺激器进行程序性电刺激，以评估细胞移植治疗后室性心动过速（VT）的可诱导性。
    2. 在处死所有动物之前，经股静脉将6F电生理导管插入右心室心尖部。
    3. 在电生理记录系统上以200 mm/s的速度显示心内电图记录及体表心电图I、II、III导联。使用刺激器以舒张期阈值的2倍强度，发放2 ms脉宽的刺激脉冲。
    4. 以两种起搏周长（200 ms 和 300 ms）递送八次刺激（S1）的起搏序列，随后给予一次（S2）或两次（S2 和 S3）早搏额外刺激。
    5. 逐步缩短配对间期，直至诱发心室有效不应期或心律失常。记录是否可诱发持续性室性心动过速（VT）>10 秒。

2. 术后方案

  1. 术后药物治疗
    1. 对心力衰竭实施常规药物治疗。简言之，每日口服琥珀酸美托洛尔（25 mg）和雷米普利（2.5 mg）给所有动物。
    2. 术后1周内，每日肌内注射恩诺沙星（5 mg/kg）和布托啡诺（0.01 mg/kg），以预防感染并缓解疼痛。
    3. 为减少免疫排斥反应，从细胞移植前3天开始至移植后8周，每日口服类固醇（40 mg/天）和环孢素（200 mg/天）给所有动物。
  2. 梗死面积评估
    1. 实验结束时，通过静脉注射过量戊巴比妥钠（商品名：Dorminal，100 mg/kg）处死动物。
    2. 打开胸腔并取出心脏，用0.9%生理盐水冲洗心脏。
    3. 使用手术刀沿左心室横向将左心室组织样本连续切成厚度为1 cm的切片。
    4. 选取包含梗死心肌的部分切片，用于测量室壁厚度和梗死区域面积。
    5. 拍摄这些切片的图像，并使用商用图像分析软件对室壁厚度和梗死面积进行定量分析。
    6. 将组织在4 °C条件下用10%福尔马林固定一个月。取梗死部位及其邻近和远端区域的组织（约1 cm2大小），包埋于石蜡中，使用切片机切成5 µm厚的切片，用于组织学检查。
  3. 细胞存活情况
    1. 根据制造商提供的方案，采用抗人核抗原（HNA）抗体进行免疫组织化学染色，检测移植细胞的植入情况。
    2. 在每只动物的不同三个部位中，各随机选取五个视野拍摄图像，并对梗死周围区域的阳性细胞进行定量分析。
      注：使用图像采集系统和图像分析软件对心脏切片图像进行采集与分析。

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结果

死亡率
本研究共使用了24头猪。其中3头在心肌梗死诱导期间因持续性室性心动过速而死亡。1头在开胸细胞注射手术中因伤口出血死亡。2头因严重感染死亡。另有2头因左心室射血分数（LVEF）下降程度较轻（较基线下降>40%）被排除。最终，共有16头动物完成了全部研究方案。

心脏功能与心室重构
连续超声心动图检查显示，左心室射血分数（LVEF）从基线时的 68.23 ± 3.52% 显著下降至心肌梗死（MI）诱导后 8 周时的 39.37 ± 3.22%。左心室舒张末期内径（LVEDD）从 3.6 ± 0.5 显著增加至 4.8 ± 0.4，左心室收缩末期内径（LVESD）从 2.5 ± 0.3 显著增加至 3.9 ± 0.4（图 4A）。与 MI 状态相比，在移植后 8 周，hi...

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讨论

标准动物模型对于理解疾病的病理生理学机制、探索疾病发生机制以及测试新型治疗方法至关重要。本方案建立了一种通过左回旋支动脉阻塞联合快速起搏诱导的猪心力衰竭模型。在心肌梗死诱导八周后，动物的左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室压力上升最大速率（+dP/dt）以及收缩末期压力-容积关系（ESPVR）均出现显著异常。本方案同时通过心肌内注射途径验证了干细胞疗法在心肌再生中的给药方式，并对梗死面积以及心脏的收缩和舒张功能进行了评估。本研究有助于建立一种稳定且可重复的、适用于干细胞治疗的临床前大型动物心力衰竭模型，该模型与临床病例具有高度相似性。

在我们之前的研究中，左回旋支（LCX）阻塞联合快速起搏已被广泛用于建立心力衰竭（HF）的动物模型7,8。在第一钝缘支远端结扎LCX后，进行为期4周的右心室快速起搏。心肌缺血导致心肌梗死（MI）期间心肌细胞丢失，进而引发心肌纤维化、心肌重构和心律失常。心室起搏可引起显著的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Alfreda和Kung Tak Chung在动物实验期间提供的出色技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胺碘酮Mylan--
麻醉机和呼吸机DragerFabius plus XL-
套管针Becton Dickinson381147-
抗人核抗原抗体abcamab19118-
Axio Plus 图像采集系统ZeissAxioskop 2 PLUSAxioskop 2 plus
AxioVision Rel. 4.5 软件Zeiss--
拜耳动保Bayer-恩诺沙星
贝迪碘Mundipharma--
CardioLab 电生理记录系统GE HealthcareG220f-
培养基MesenCult05420-
环孢素Novartis--
除颤器GE HealthcareCardioServ-
多拉明TEVA--
超声心动图系统GE VingmedVivid i-
EchoPac 软件GE Vingmed--
电生理导管Cordis Corp--
Embozene 微球Boston Scientific17020-S1700 μm
气管插管Vet CareVCPET70PCW7号
乙醇VWR chemicals20821.33-
福尔马林SigmaHT50132010%
下腔静脉球囊扩张导管Boston Scientific3917112041Mustang
JR4 指引导管Cordis Corp672082006F
利多卡因Quala--
丝线缝合线EthiconW5842-0
琥珀酸美托洛尔Wockhardt--
切片机LeicaRM2125RT-
移动C型臂X光透视设备GE HealthcareOEC 9900 Elite-
起搏器St Jude MedicalPM1272Assurity MRI 起搏器
起搏器脉冲发生器St Jude MedicalMerlln model 3330-
压力-容积导管CD LeycomCA-71103-PL7F
压力–容积信号处理器CD LeycomSIGMA-M-
可编程刺激器Medtronic Inc5328-
PTCA球囊扩张导管Boston ScientificH7493919120250MAVERICK over the wire
雷米普利TEVA--
鞘管导入器Cordis Corp504608X8F, 9F, 12F
类固醇Versus Arthritis--
特耐Nindivior-丁丙诺啡
静脉留置针TERUMOSR+OX2225C22G
薇乔缝线EthiconVCP320H2-0
赛拉嗪Alfasan International B.V.--
速眠新Virbac New Zealand Limited-替来他明+唑拉西泮

参考文献

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