我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&B）分析。
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本文内容
摘要
摘要
尽管受体寡聚化具有重要性和普遍性，但可用于检测聚集事件并测量聚集程度的方法却很少。本文介绍一种成像方法，用于测定活细胞膜中mEGFP标记的受体同源复合物的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合数目与亮度（N&B）分析。N&B方法类似于荧光相关光谱（FCS）和光子计数直方图（PCH），这些方法均基于对观察时间内荧光分子在照明体积内进出所引起的荧光强度波动的统计分析。具体而言，N&B是对PCH的简化，用于获取寡聚混合物中蛋白质平均数量的信息。强度波动幅度由荧光分子的分子亮度以及照明体积内荧光分子的平均数量决定。因此，N&B仅考虑振幅分布的一阶矩和二阶矩，即平均强度和方差。这既是该方法的优势，也是其局限性所在。由于仅考虑两个矩，N&B无法确定混合物中未知寡聚体的摩尔分数，而只能估计混合物的平均寡聚化状态。然而，该方法可应用于相对较小的时间序列（相较于其他矩方法），以像素为单位对活细胞图像进行分析，仅需监测荧光强度随时间的变化即可。该方法将每个像素的有效时间缩短至几微秒，使数据采集可在秒到毫秒的时间尺度内完成，这对于快速寡聚化动力学的研究至关重要。最后，该方法还可用于检测较大的细胞区域以及亚细胞区室。
引言
我们介绍一种全内反射荧光-计数与亮度（TIRF-N&B）成像方法，用于确定活细胞质膜上受体分子的平均寡聚状态，旨在将受体组装动力学与蛋白质的生物学功能联系起来（图1）。
当细胞外配体结合后，受体根据其构象、寡聚化状态、潜在的共受体以及膜组成，启动细胞内信号转导。尽管受体寡聚化在细胞信号传导中具有重要性和普遍性，并被公认为关键事件1,2,3,4,5,6,7，但目前能够检测聚簇事件并实验测定聚簇程度的方法仍十分有限8,9。共聚焦显微镜的检测体积（x,y ≈ 300 nm，z ≈ 900 nm）分辨率不足以证明分子间的相互作用和化学计量关系，即使通过图像重建算法优化后仍如此10。即使采用x,y分辨率达20–70 nm的超分辨率....
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方案
1. 样品制备
- 第1天。在玻璃底培养皿中，以每毫升100,000–200,000个细胞的浓度，将HeLa细胞接种于完全培养基中。接种6–8个重复培养皿。
注意：本示例中，培养基添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、100 U/100 µg青霉素/链霉素。需准备多个重复培养皿。 - 第2–3天。当细胞处于亚汇合状态时，在无血清培养基中将一半培养皿转染目标蛋白质粒，另一半转染参考质粒（单体和二聚体）。
注意：转染在补充有抗生素、0.1%牛血清白蛋白和25 mM HEPES缓冲液（不含酚红）的无血清培养基中进行。 - 第3–4天。检查转染后的细胞是否贴附于培养皿底部，且细胞膜呈现荧光。弃去细胞过度生长或荧光信号极弱的培养皿。
注意：避免细胞过度生长。细胞应分布均匀，并贴附于培养皿的玻璃区域（图1A）。可使用预先包被的玻璃底培养皿以促进细胞贴附。所有细胞培养在实验前均需检测支原体污染。本示例中，实验组细胞使用(A207K)mEGFP-FGFR1质粒转染，对照细胞则分别转染GPI-(A207K)mEGFP和GPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP质粒，转染操作按标准方案进行。进行活细胞显微成像时，建议使用无指示剂培养基；添加25....
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结果
在相同培养皿中接种的两个代表性 HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞的实验结果如图5和补充表1所示。这两个细胞分别在加入 FGF2 配体后 0 分钟（图5A，上图）和 7 分钟（图5A，下图）时被捕捉成像。
图5 还展示了两个代表性HeLa细胞的实验结果，其中一个表达纯单体GPI-mEGFP（图5B，上图），另一个表达共价连接的二聚体荧光蛋白GPI-mEGFP-mEGFP（图5
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讨论
在选择细胞模型和标记策略时，N&B 方法需要注意若干事项。该方法仅适用于在整个图像采集期间能够稳定贴壁的活细胞。由于细胞整体刚性位移引起的额外波动，可通过适当的图像重建方法进行处理38。然而，通常情况下，当细胞发生移动时，细胞膜也会随之变形，而结构形变所产生的较大额外方差会严重限制对膜蛋白的分析。本研究中，荧光标记的构建体在 HeLa 细胞系中表达，因为该细胞系中内源性 FGFR1 的表达可忽略不计。必须避免内源性蛋白的存在，否则可能会形成荧光与非荧光受体寡聚体的混合群体。因此，基于仅荧光标记蛋白群体亮度的 N&B 分析将无法可靠地估计平均寡聚状态。这一问题在应用 N&B 检测受体二聚化事件时尤为关键，例如在 FGF2 配体存在下 FGFR1 的二聚化，其亮度仅增加 2 倍。在此情况下，混合二聚体的存在可能完全掩盖 N&B 可检测到的二聚化事件。除非标记蛋白大量过表达，否则荧光寡聚体与非荧光内源性形式的共存是任何基于荧光检测方法的潜在缺陷之一。然而，在蛋白过表达条件下进行寡聚化研究，会引发对其功能相关性的担忧。瞬时转染的细胞通.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
国家心血管研究中心（CNIC）由科学、创新与大学部以及Pro CNIC基金会提供支持，并被授予塞韦罗·奥乔亚卓越中心（SEV-2015-0505）称号。 我们还得到了欧洲区域发展基金（FEDER）的支持 "一种构建欧洲的方式". UC 感谢意大利癌症研究协会、国际癌症研究协会（现名为全球癌症研究）以及意大利卫生部的支持。A.T. 感谢 "隆巴迪亚山地银行基金会" 部分支持其获得光伏奖学金期间的研究工作 "伊瓦诺·贝基职业能力项目" 2011-2012.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 配备 smi-自动 TIRF 校准功能的 3 色快速 TIRF Leica AM TIRF MC 倒置显微镜。该显微镜配有 488 nm 激光二极管、100 倍 1.46 数值孔径油浸 TIRF 物镜、490/20 和 525/50 的激发/发射带通滤光片、温控/CO2 培养箱，以及 Andor DU 8285 VP EMCCD 相机。显微镜由 Leica LIF 软件控制。 | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| 牛血清白蛋白，纯度 ≥98% | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| 不含酚红、含 25 mM HEPES 的 DMEM 培养基 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 21063029 | 用于显微镜观察的无血清培养基 |
| 高糖 DMEM GlutaMAX I 培养基 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10566-016 | 用于配制完全培养基 |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液 10 倍浓缩液 (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Photometrics DV2 发射光分光系统 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| 胎牛血清，经鉴定合格，来源巴西 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | 完全培养基中添加 10%，经灭活处理 |
| 35 mm 玻璃底无菌培养皿（1.5 级玻璃） | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | 未包被，玻璃厚度为 0.17 微米 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| 人宫颈癌 (HeLa) 细胞，无血清动物成分 (AC) 培养细胞 | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD（背照式）ANDOR 相机，由 ANDOR Solis 软件控制 | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | 该相机安装在显微镜的额外端口上，用于采集 N&B 时间序列数据 | |
| Matlab 可执行 N&B 程序 | 西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元 | 下载地址：https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 组织培养用青霉素-链霉素溶液（100 倍浓缩） | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | 培养基中终浓度为青霉素 100 U / 链霉素 100 µg |
| pN1-mEGFP-FGFR1 表达载体 | 意大利米兰欧洲肿瘤学研究所 IRCCS 妇科肿瘤研究组 | Zamai 等，2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI 表达载体 | 西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元 | Hellriegel 等，2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI 表达载体 | 西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元 | Hellriegel 等，2011 | |
| 重组 FGF2 蛋白 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | 配体溶液：在含 0.01% BSA 的 PBS 中配制 20 ng/mL 的 FGF2 溶液 | |
| 丙酮酸钠 GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 培养基中添加终浓度为 1 mM |
| TransIt-LT1 转染试剂 | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| 类型 F 浸油，10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA（50 mg/mL） | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 用于转染实验的无酚红培养基中添加 0.1% |
参考文献
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
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