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方法文章

基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

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DOI：

10.3791/60399

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2019年11月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

本文内容

摘要

我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。

摘要

三维球状细胞培养在细胞实验中能够获得更有价值的结果，因为它比二维细胞培养更能模拟生物体内的细胞微环境。在本研究中，我们构建了一种由电动机驱动的“芯片实验室-光盘”（即基于光盘的离心微流控球状体，compact disc，简称CD）平台，称为基于离心微流控的球状体（CMS）培养系统，用于在高离心力条件下生成三维（3D）细胞球状体。该装置可通过调节转速产生相当于1 × g 至521 × g 的重力条件。CMS系统直径为6 cm，由聚二甲基硅氧烷（PDMS）在经计算机数控机床预先制备的聚碳酸酯模具中模压而成，包含一百个400 μm的微孔。CMS系统通道入口处设有屏障壁，利用离心力使细胞在芯片内均匀分布。在通道末端设有一个滑动区域，允许细胞进入微孔。作为示例，利用该系统在高重力条件下实现了人脂肪源性干细胞与人肺成纤维细胞的单培养及共培养，生成了球状体。CMS系统采用简单的操作方案，即可制备出具有同心、Janus及三明治等多种结构的共培养球状体。该CMS系统将在需要单种或多种细胞类型进行球状体及类器官培养的细胞生物学与组织工程研究中发挥重要作用。

引言

与二维（2D）细胞培养（例如传统的培养皿细胞培养）相比，三维（3D）球状体细胞培养更易于模拟生物体内的微环境，从而获得更接近生理状态的实验结果1。目前可用的球状体形成方法包括悬滴法2、液体覆盖法3、羧甲基纤维素法4、基于磁力的微流控技术5以及生物反应器的使用6。尽管每种方法都有其优势，但在可重复性、生产效率以及共培养球状体的生成方面仍需进一步改进。例如，虽然基于磁力的微流控技术5相对成本较低，但必须仔细考虑强磁场对活细胞的影响。已有多个研究报道了球状体培养的优势，特别是在间充质干细胞分化与增殖研究中的应用7,8,9。

离心式微流控系统，也被称为芯片实验室-光盘（lab-on-a-CD，简称光盘），因其能够通过基底旋转轻松控制流体，在生物医学领域得到了广泛应用，例如免疫分析10、用于检测生物化学标志物的比色分析11、核酸扩增（PCR）分析、自动化血液分析系统12以及集成式离心微流控装置13。驱动流体运动的主要作用力是旋转所产生的向心力。此外，该单一光盘平台还可简便地实现混合、阀控和样品分流等多种功能。然而，与上述生化分析方法相比，将光盘平台应用于细胞培养，特别是类球体（spheroids）培养的研究仍较为有限14。

本研究展示了基于离心微流控的球体（CMS）系统在人脂肪源性干细胞（hASC）与人肺成纤维细胞（MRC-5）单培养或共培养条件下的性能表现。本文详细描述了我们课题组的研究方法15，因此该基于光盘的球体培养实验平台可被轻松复现。所介绍的CMS生成系统包括CMS培养芯片、芯片支架、直流电机、电机支架和旋转平台。电机支架采用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）材料通过3D打印制成，芯片支架和旋转平台则采用聚碳酸酯（PC）材料通过数控（CNC）加工制成。电机转速通过基于脉宽调制的PID（比例-积分-微分）算法进行控制，范围为200至4,500 rpm。系统尺寸为100 mm × 100 mm × 150 mm，重量为860 g，便于操作。利用该CMS系统，可在1 × g 至521 × g 的不同重力条件下生成球体，从而将高重力促进细胞分化的研究从二维细胞16,17拓展至三维球体。多种细胞类型的共培养也是有效模拟体内环境的关键技术之一18。该CMS系统不仅可轻松生成单培养球体，还可生成多种结构类型的共培养球体（如同心结构、Janus结构和夹心结构）。该CMS系统不仅适用于简单的球体研究，还可用于三维类器官研究，以更贴近人体器官结构进行探索。

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方案

1. 基于离心式微流控的类球体（CMS）培养芯片制备

  1. 通过数控加工制作CMS培养芯片顶部和底部层的聚碳酸酯（PC）模具。芯片的详细尺寸见图1。
  2. 按10:1（w/w）的比例将聚二甲基硅氧烷（PDMS）基液与PDMS固化剂混合5分钟，然后放入真空干燥器中脱气1小时，以去除气泡。
  3. 将PDMS混合物倒入CMS培养芯片的模具中后，继续抽真空脱气1小时，随后在80 °C的加热箱中固化2小时。
  4. 将芯片置于真空等离子清洗机中，使待键合表面朝上，以18 W功率进行空气辅助等离子体处理30秒。
  5. 将CMS培养芯片的两层键合后，放入80 °C加热箱中加热30分钟，以增强粘附强度。
  6. 将CMS培养芯片在121 °C、15 psi条件下进行高压灭菌处理。

2. 细胞制备

  1. 将含有 5 × 105–1 × 106 个 hASCs 或 MRC-5s 细胞的 1 mL 冻存管置于 36.5 °C 水浴中解冻 2 分钟。
  2. 向冻存管中加入 1 mL 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并用 1,000 μL 移液器轻轻混匀。
  3. 用移液器将预热至 36.5 °C 的 15 mL DMEM 加入直径为 150 mm 的培养皿中，并将冻存管中的细胞加入培养皿内。
  4. 1 天后，吸除 DMEM，更换为 15 mL 新鲜 DMEM。此后每 2 至 3 天更换一次培养基。
  5. 为使细胞从培养皿中脱离，向培养皿中加入 4 mL 胰蛋白酶，置于 36.5 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 4 分钟。

3. 单一培养类球体的形成

  1. 将 2.5 mL 的 4% (w/v) Pluronic F-127 溶液加入 CMS 培养芯片的进样孔中（图 2A），同时以 500–1,000 rpm 的速度旋转芯片，然后使用 CMS 系统以 4,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟（图 2B）。
    注意： 在芯片旋转过程中，Pluronic 涂层可防止细胞附着于进样口。确保微孔中无气泡滞留。
  2. 将充满 Pluronic 溶液的 CMS 培养芯片置于 5% CO2 条件下，在 36.5 °C 恒温培养箱中孵育过夜。
  3. 移除 Pluronic 溶液，用 DMEM 洗去残留的 Pluronic 溶液，并在洁净台中干燥芯片 12 小时。
  4. 向 CMS 培养芯片中加入 2.5 mL DMEM，以约 4,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟，以预润湿芯片内部。
  5. 停止旋转，抽出 100 μL DMEM，为加入细胞悬液预留空间。
  6. 用移液器加入 100 μL 细胞悬液，其中含有 5 × 105 个 hASCs 或 8 × 105 个 MRC-5 细胞，并通过移液吹打 3–5 次使细胞均匀重悬。
  7. 以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟，利用离心力将细胞捕获至各个微孔中。
    注意： 过高的转速可能导致细胞通过溶液排出孔逸出。
  8. 将细胞在 36.5 °C、>95% 湿度、5% CO2 的培养箱中培养 3 天，期间以 1,000–2,000 rpm 的速度持续旋转，每天更换培养基。

4. 共培养球体形成

  1. 同心球体形成
    1. 加入第一种细胞，即 2.5 × 105 个 hASCs，并以 3,000 rpm 的速度旋转芯片。3 分钟后，加入第二种细胞，即 4 × 105 个 MRC-5s，并以 3,000 rpm 的速度继续旋转芯片 3 分钟。通过移液方式共注入 100 μL 细胞悬液。细胞注入后，将旋转速度调整至 500–1,000 rpm。
    2. 在培养箱中以 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2 的条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养细胞。同心球体将在 24 小时内形成。如需长期培养，应每天更换培养基。
  2. Janus 球体形成
    1. 在芯片以 500–1,000 rpm 旋转的同时，通过移液加入含第一种细胞（2.5 × 105 个 hASCs）的 100 μL 细胞悬液。随后，以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟。
    2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2 条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养芯片 3 小时。
    3. 在芯片以 500–1,000 rpm 旋转的同时，通过移液加入含第二种细胞（4 × 105 个 MRC-5s）的 100 μL 细胞悬液。随后，以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟。
    4. 在培养箱中以 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2 的条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养细胞。Janus 球体将在 24 小时内形成。如需长期培养，应每天更换培养基。
  3. 三明治球体形成
    1. 在芯片以 500–1,000 rpm 旋转的同时，通过移液加入含第一种细胞（1.5 × 105 个 hASCs）的 100 μL 细胞悬液。随后，以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟。
    2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2 条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养芯片 3 小时。
    3. 在芯片以 500–1,000 rpm 旋转的同时，通过移液加入含第二种细胞（3 × 105 个 MRC-5s）的 100 μL 细胞悬液。随后，以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟。
    4. 在 36.5 °C、>95% 湿度% 和 5% CO2 条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养芯片 3 小时。
    5. 在芯片以 500–1,000 rpm 旋转的同时，通过移液加入含第三种细胞（1.5 × 105 个 hASCs）的 100 μL 细胞悬液。随后，以 3,000 rpm 的速度旋转芯片 3 分钟。
    6. 在培养箱中以 36.5 °C、>95% 湿度% 和 5% CO2 的条件下，以 1,000–2,000 rpm 的速度旋转培养细胞。三明治球体将在 12 小时内形成。如需长期培养，应每天更换培养基。

5. 细胞染色

  1. 将细胞荧光染料 warming 至室温（20 °C）。
  2. 每瓶加入 20 μL 无水二甲基亚砜（DMSO），配制成 1 mM 溶液。
  3. 用 DMEM 稀释荧光染料，使其终工作浓度为 1 μM。
  4. 将荧光染料加入细胞悬液中，并用移液器轻轻重悬。
  5. 在 36.5 °C、湿度 >95%、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。

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结果

6 cm 直径的 CMS 培养芯片（图 2）已根据上述方案成功制备。首先，芯片由顶层和底层分别制作，再通过等离子体键合技术将其结合。所形成的类球体可通过拆卸芯片轻松收集。CMS 培养芯片的通道包括进样口、中心区、滑坡区和微孔区（图 3）。细胞、培养基和泊洛沙姆溶液通过直径为 5 mm 的进样孔注入。注入的细胞在进样口区域通过重悬 3–5 次实现均匀分布。细胞在中心区受到离心力作用并向外扩散。由于中心区高于微孔区，可容纳更多培养基，从而延长类球体的存活时间。微孔的高度为 0.4 mm，中心区高度为 1.5 mm。中心区中央设有吸液孔，便于移除内部溶液。滑坡区为连接中心区与微孔区的倾斜区域。细胞沿 45° 斜坡移动并进入微孔区，在微孔区中细胞沉降、生长并相互缠结形成类球体。位于芯片中心 14 mm 处的微孔为半圆柱形，高度为 400 μm，直径为 400 μm。100 个微孔可同时生成 100 个类球体。

使用制备好的 CMS 芯片，可按照本方案所示顺序生成球状体（<...

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讨论

CMS 是一个封闭系统，所有注入的细胞均会进入微孔，无损耗，因此比传统的基于微孔的类球体生成方法更高效、更经济。在 CMS 系统中，通过芯片上设计的吸液孔每 12–24 小时更换一次培养基（图 3A）。在吸液过程中，由于培养基与微孔壁之间的表面张力，几乎不会有培养基从微孔中逸出。由于 PDMS 材质的芯片具有弹性和柔韧性，用户只需用手指按压芯片的微孔区域附近，即可轻松去除滞留的培养基。即使进行多次换液，微孔中的细胞仍能保持稳定，不会逸出。为了在全部 100 个微孔中获得质量一致的类球体，设备的旋转必须保证无偏心，且芯片应具有轴对称性。否则，每个孔中进入的细胞数量可能不一致，导致类球体的大小和形状存在差异。在传统的微孔系统中，由于微孔内常会困住空气，因此需要去除气泡。然而，CMS 系统无需进行除泡操作，因为旋转产生的高离心力会使培养基推动气泡并将其从微孔中挤出。

与传统方法相比，CMS 系统也存在一定的局限性。由于 CMS 系统包含电机、旋转平台和控制器，因此需要较大的培养空间（例如大型培养箱空间），其总体尺寸约为 100 ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由基础科学研究中心项目（2016R1D1A1B03934418）和生物 & 国家研究基金会（NRF）的医疗技术开发项目（2018M3A9H1023141），并由韩国政府科学技术信息通信部（MSIT）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印机Cubicon3DP-210F
脂肪来源的间充质干细胞（hASC）ATCCPCS-500-011
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062含于完全培养基和缓冲液中，终浓度为 1%
CellTracker Green CMFDAThermo Fisher ScientificC292510 mM
CellTracker Red CMTPXThermo Fisher ScientificC3455210 mM
计算机数控（CNC）旋转雕刻机Roland DGAEGX-350
直流电机Nurielectricity Inc.MB-4385E
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）ATCC30-2002
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）ATCC30-2200
胎牛血清ATCC30-2020含于完全培养基中，终浓度为 10%
人肺成纤维细胞（MRC-5）ATCCCCL-171
Inventor 2019Autodesk三维计算机辅助设计软件
培养皿 Φ 150 mmJetBiofillCAD010150表面处理型
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-32G
Pluronic F-127Sigma Aldrich11/6/9003用磷酸盐缓冲液稀释配制成 4% (w/v) 溶液
聚碳酸酯（PC）AcrylmallAC15PC200 x 200 x 15 mm
聚二甲基硅氧烷（PDMS）DowcorningSylgard 184
胰蛋白酶Gibco12604021

参考文献

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