用于生成多细胞三维球体的 CD 实验室平台

Summary

我们提出了一种运动动力离心微流体装置，可以培养细胞球体。使用该装置，单细胞或多种细胞类型的球体在高重力条件下可以很容易地共同培养。

Abstract

三维球体细胞培养法在细胞实验中可以获得更有用的结果，因为它比二维细胞培养更好的模拟活体细胞微环境。在这项研究中，我们制造了一个电机驱动的实验室在CD（光盘）平台，称为离心微流体基球体（CMS）培养系统，以创建三维（3D）细胞球体实现高离心力。此设备可改变旋转速度，生成从 1 x g到 521 x g的重力条件。CMS系统直径6厘米，微井100400μm，由计算机数控机在聚碳酸酯模具中用聚二甲基硅氧烷成型。CMS 系统通道入口的屏障墙使用离心力将细胞均匀地分布到芯片内。在通道的末端，有一个滑动区域，允许细胞进入微井。作为证明，球体是由人类脂肪衍生干细胞和人类肺成纤维细胞在高重力条件下使用该系统的单一培养和共同培养产生的。CMS系统使用一个简单的操作方案来生产同心、Janus 和三明治等不同结构的共栽球体。CMS系统将可用于细胞生物学和组织工程研究，需要单细胞或多种细胞类型的球体和有机体培养。

Introduction

与二维（2D）细胞培养（例如，常规培养皿细胞培养）相比，使用三维（3D）球形细胞培养法在体内微环境中模拟生物更容易，从而产生更生理上逼真的实验结果¹.目前可用的球形形成方法包括悬滴^技术2、液体覆盖^技术3、卡博基甲基纤维素^技术4、磁力微流体^技术5、使用生物反应^器6.尽管每种方法都有其自身的优点，但还需要进一步提高可重复性、生产率和生成共培养球体。例如，虽然基于磁力的微流体^技术5相对便宜，但必须仔细考虑强磁场对活细胞的影响。球体培养的好处，特别是在研究中细胞分化和增殖，已经报告在几项研究7，8，9。

离心微流体系统，也称为CD实验室（光盘），可用于轻松控制内部流体和利用基板的旋转，因此已用于生物医学应用，如免疫^测定10，用于检测生化标记物¹¹的色度测定、核酸扩增 （PCR....

Protocol

1. 离心微流体基球体 （CMS） 培养芯片制造

1. 通过数控加工为 CMS 培养芯片的顶层和底层制作 PC 模具。图1给出了芯片的详细尺寸。
2. 以 10:1 （w/w） 的比例将 PDMS 底座和 PDMS 固化剂混合 5 分钟，并在干燥器中放置 1 小时以去除气泡。
3. 将 PDMS 混合物倒入 CMS 培养芯片的模具后，再去除气泡 1 小时，并在 80°C 的热室中固化 2 小时。
4. 将它们放入真空等离子清洗器中，表面朝上粘结，并将其暴露在空气辅助等离子体中，功率为 18 W，为 30 s。
5. 将 CMS 培养芯片的两层粘结，并将其置于 80°C 的加热室中 30 分钟，以增加粘附强度。
6. 在 121 °C 和 15 psi 的高压灭菌器中对 CMS 培养芯片进行灭菌。

2. 细胞制备

1. 在水浴36.5°C下将含有5×10 5+1+1+1+16^hASCs或MRC-5s细胞的1 mL解冻2分钟。
2. 将 1 mL 的 Dulbeco 改性鹰介质 （DMEM） 添加到小瓶中，并与 1，000 μL 移液器轻轻混合。
3. 使用移液器将 15 mL 的预加热至 36.5 °C 的培养皿放入直径为 150 mm 的....

Results

直径为6厘米的CMS培养芯片（图2）按照上述方案成功制造。首先，芯片与顶层和底层分开，然后通过等离子体粘接粘合在一起。通过分离芯片，可以轻松收集生成的球体。CMS 培养芯片的通道包括入口端口和中央、滑动和微井区域（图 3）。细胞、介质和压孔溶液通过直径为 5 mm 的入口孔注入。注射的细胞通过在入口端口区域中重新悬浮3~5倍均匀分布。细胞在中部地区受到离心力的影响，然后向外扩散。由于中心区域高于微井，它可以包含更多的介质，使球体存活更长时间。微孔的高度为 0.4 mm，中心区域的高度为 1.5 mm。吸孔位于中心区域的中心，可轻松拆下内部溶液。滑动区域是连接中心区域和微井区域的倾斜区域。细胞沿着45°的斜坡移动，并定居在微井区域，在那里细胞沉降、生长和缠绕形成球形。微井位于距芯片中心 14 mm 处，为半圆柱形，高度为 400 μm，直径为 400 μm。在100个微井中可以同时生成100个球体。

使用制备的CMS芯片，可以按协议所示的顺序生成球体（

Discussion

CMS 是一个封闭的系统，所有注入的细胞进入微井时无浪费，使其比传统的基于微井的球形生成方法更高效、更经济。在 CMS 系统中，介质每 12~24 小时通过一个吸孔进行更换，该吸孔设计用于移除芯片中的介质（图 3A）。在介质吸入过程中，由于介质与微井壁之间的表面张力，几乎没有任何介质从微井内部逸出。用户可以通过用手指在芯片的微井区域附近按压，轻松移除被困介质，因为 PDMS 制成的芯片具有弹性和弹性。即使多次介质发生变化，微井中的细胞也能保持稳定，不会逃逸。为了在所有100个微井中实现相同的球体质量，器件的旋转不应偏心，芯片应该是不对称的。否则，可变数量的细胞可能会进入每个井，球形的大小和形状可能会有所不同。在传统的微井系统中，由于空气经常被困在微井中，因此有必要去除气泡。但是，CMS 系统不需要气泡去除过程，因为旋转产生的高离心力会导致介质将气泡推出微井。

与传统方法相比，CMS 系统也有其局限性。CMS 系统需要更大的培养空间（例如，大型培养箱空间），因为它包括电机、旋转平台和控制器，其总尺寸约为 100 mm x 1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D 打印机	Cubicon	3DP-210F
脂肪来源的间充质干细胞 （hASC）	ATCC	PCS-500-011
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240-062	含有 1% 的成品培养基和缓冲液
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo FisherScientific	C34552	10 mM
计算机数控 （CNC） 旋转雕刻机	Roland DGA	EGX-350
直流电机	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco 改良的 eaggle 培养基 （DMEM）	ATCC	30-2002
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS）	ATCC	30-2200
胎牛血清	ATCC	30-2020	含有 10% 的已完成人
肺成纤维细胞培养基（MRC-5）	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D 计算机辅助设计程序
皿 Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	表面处理
等离子清洁剂	Harrick 等离子清洗剂 Harrick 等离子	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	用磷酸盐缓冲盐水稀释至 4% （w/v） 溶液
聚碳酸酯 （PC）	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	Dowcorning	Sylgard 184
胰蛋白酶	Gibco	12604021