成年大鼠心脏解剖结构与功能的超声心动图评估

Sónia Ribeiro; Ana Rita  S. Pereira; Ana Teresa Pinto; Filipe Rocha; Augusto Ministro; Manuela Fiuza; Fausto Pinto; Susana Constantino Rosa Santos

doi:10.3791/60404

方法文章

成年大鼠心脏解剖结构与功能的超声心动图评估

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DOI：

10.3791/60404

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2019年12月13日

Sónia Ribeiro^*¹^,² , Ana Rita S. Pereira^*¹ , Ana Teresa Pinto¹ , Filipe Rocha¹ , Augusto Ministro¹^,² , Manuela Fiuza¹^,² , Fausto Pinto¹^,² , Susana Constantino Rosa Santos¹

¹Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, ²Departamento Coração e Vasos, Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种用于成年大鼠心脏解剖结构和功能经胸超声心动图评估的非侵入性方案。该方案对心脏瓣膜、全部四个心腔以及升主动脉、主动脉弓和降主动脉进行了详细研究。

摘要

实验动物模型在心血管科学研究中已变得至关重要。大多数使用啮齿类动物模型的研究主要依赖二维成像来观察左心室的心脏解剖结构，并采用M型超声心动图评估其尺寸。然而，这种方法可能限制了对心脏功能的全面研究。本文介绍了一种可评估心腔大小、左心室功能（收缩期和舒张期）以及瓣膜功能的实验方案。本方案采用常规医用超声设备，通过左侧胸骨旁、心尖和胸骨上窝三个声窗获取不同的超声心动图切面。在左侧胸骨旁声窗，获取长轴和短轴切面，用于分析左心腔尺寸、右心室和肺动脉的尺寸，以及二尖瓣、肺动脉瓣和主动脉瓣的功能。心尖声窗可用于测量心腔尺寸，并评估收缩期和舒张期参数，同时可进行多普勒检查，检测并量化心脏瓣膜异常（如反流或狭窄）。在所有切面中均可观察左心室的不同节段和室壁。最后，通过胸骨上窝声窗可成像升主动脉、主动脉弓和降主动脉。本方案结合了超声成像、多普勒血流及组织多普勒评估，以研究心脏的形态与功能。该方法为改进成年大鼠心脏功能的评估提供了重要手段，对使用此类动物模型的研究具有重要意义。

引言

心血管疾病是欧洲的主要死因，尽管近年来在治疗、诊断和监测方面取得了进展，改善了患者的预后，但每年仍导致超过400万人死亡。快速的技术进步推动了心血管疾病患者诊疗的发展。在这些诊断工具中，生物医学成像尤其受到关注，因其能够以无创的方式实现解剖结构和功能的评估¹^,²^,³。同样，医学也受益于生物医学研究的成果。实验动物模型对于验证临床实践中提出的假设以及开发创新疗法具有重要价值⁴^,⁵。

随着纵向研究中能够在单个实验动物身上获取多种测量数据，超声心动图作为实验动物模型研究工具的应用正受到越来越多的关注。值得注意的是，使用小鼠或啮齿类动物模型具有一些优势。其妊娠周期短、繁育和饲养成本低、基因组信息明确，且能够构建转基因动物，这些主要优势使这类动物成为研究心血管疾病机制的理想选择⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹。尽管大鼠和小鼠模型具有相似的优势，但由于大鼠体型较大、心率较低，可在超声心动图检查中获得更清晰的图像，因此在心血管研究中一直是经典的选择⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰。

我们介绍一种使用常规医用超声设备对Wistar大鼠心脏腔室和心脏瓣膜（解剖结构与功能）进行评估的超声心动图方案。该方案简明完整，适用于短时间内获取图像和动态影像序列，可用于离线测量，并可后续复查以随时间整合新的变量或测量指标。

方案

所有动物实验均按照欧盟指令 2010/63/EU 进行。实验程序经机构动物福利委员会批准，并由葡萄牙动物保护主管机构 DGAV 授予许可（许可证号 0421/000/000/2018）。
注意：使用雌性 Wistar Han IGS 大鼠（Crl:WI(Han)，购自 Charles River Laboratories，12–16 周龄）。本方案适用于大鼠，与品系、年龄或性别无关。

1. 大鼠超声心动图检查前准备：麻醉与逆转方案

称重大鼠。
根据大鼠体重配制由咪达唑仑（4.76 mg/kg）、美托咪定（0.356 mg/kg）和芬太尼（0.012 mg/kg）组成的三组分麻醉剂。
经腹腔注射麻醉剂。通过检查足底回缩反射是否消失来评估麻醉深度。
剃除躯干区域的毛发。
在双眼上涂抹保护性凝胶，防止巩膜干燥。
将麻醉后的大鼠仰卧置于加热垫上，以维持体温（37.0 °C ± 0.5 °C）。
在胸部涂抹一层预热至接近体温的超声耦合剂，主要覆盖心脏区域。避免耦合剂中产生气泡，以免干扰超声成像。
在超声心动图检查结束后，立即皮下注射阿替美唑（0.94 mg/kg）和氟马西尼（0.2532 mg/kg）以逆转麻醉作用。
注意：该麻醉组合可提供长达45分钟的成像时间。下述超声心动图检查方案可与其他任何麻醉方案兼容。

2. 超声心动图

注意：超声心动图使用常规临床超声心动图设备进行，配备12 MHz心脏探头，包括获取的静态图像和动态图像序列，体位包括胸骨旁（长轴和短轴切面）、心尖部（四腔、五腔、两腔和三腔切面）以及胸骨上窝切面。同步记录心电图以识别收缩末期和舒张末期，用于测量操作和动态图像采集（心电图触发）¹¹^,¹²。为保持大鼠间图像分辨率的一致性，采用预设参数：频率5–10 MHz，深度2.5 cm，帧率125 fps，多普勒取样容积1.0 mm，彩色多普勒混叠速度40 cm/s。动态图像序列至少包含3个心动周期。

胸骨旁左心长轴切面
注意：将探头置于胸骨左侧，探头标记朝向右肩。
1. 在主动脉瓣、二尖瓣瓣叶及左心室中腔水平（光标位于二尖瓣瓣尖或腱索水平）记录M型图像¹^,²^,³^,⁴。M型光标应垂直于目标结构¹^,³^,¹⁰。
2. 记录所有切面的二维动态图像。
3. 记录左心室流出道局部放大后的二维动态图像。
4. 同时在主动脉瓣和二尖瓣处记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
胸骨旁左心短轴切面
注意：将探头置于胸骨左侧，探头标记朝向左肩。
1. 通过轻微向头侧倾斜探头，获取主动脉瓣水平的图像。
2. 记录所有切面的二维动态图像。
3. 在主动脉瓣和肺动脉瓣处同时记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
4. 在肺动脉处获取脉冲波频谱多普勒图像。光标应与血流方向平行¹^,³。
5. 通过轻微向下倾斜探头，获取乳头肌水平的左心室图像。
6. 记录所有切面的二维动态图像。
心尖四腔切面
注意：将探头置于前腋线的心尖区域，探头标记朝向左肩。
1. 记录所有切面的二维动态图像。
2. 记录包含全部四个心腔的二维及组织多普勒成像动态图像。
3. 聚焦于左心腔。
  1. 记录左心房局部放大的二维动态图像。
  2. 在二尖瓣和左心房处记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
  3. 记录左心室传播血流的M型与彩色多普勒同步图像。
  4. 在二尖瓣处获取左心室充盈血流的脉冲波（PW）频谱多普勒图像。取样容积应置于二尖瓣瓣尖完全开放的舒张期位置¹^,²^,³^,¹¹^,¹²。
  5. 若存在二尖瓣反流，增加在二尖瓣处的连续波（CW）多普勒图像。
  6. 在二尖瓣环（左心室侧壁和室间隔壁）获取脉冲波组织多普勒频谱图像。应将PW多普勒光标与心脏长轴对齐，以获得最大多普勒信号¹^,²^,³^,¹³。
  7. 记录二尖瓣环的M型图像，用于测量二尖瓣环平面收缩期位移（光标置于左心室侧壁）。
4. 聚焦于右心腔。
  1. 记录右心房局部放大的二维动态图像。
  2. 在三尖瓣和右心房处记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
  3. 在三尖瓣环（右心室壁）获取脉冲波组织多普勒频谱图像。
  4. 将二维光标置于三尖瓣侧环，记录三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE）的M型图像。
心尖五腔切面
注意：从四腔切面开始，将探头轻微向前胸方向倾斜。
1. 记录所有切面的二维动态图像。
2. 在主动脉瓣和左心室流出道处记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
3. 在左心室流出道获取脉冲波频谱多普勒图像。光标应与血流方向平行，取样位置置于左心室流出道⁴^,¹⁴。
4. 在左心室中腔获取脉冲波频谱多普勒图像，以同时观察左心室流入和流出波形。
5. 在主动脉瓣处获取连续波频谱多普勒图像。跨瓣血流记录于基线以下，反流信号（若存在）则位于基线以上。
心尖两腔切面
注意：返回四腔切面，将探头逆时针旋转90°。
1. 记录所有切面的二维动态图像。
2. 在二尖瓣处记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
心尖三腔切面
注意：将探头轻微向头侧倾斜。
1. 记录所有切面的二维动态图像。
2. 在主动脉瓣和二尖瓣处同时记录彩色多普勒成像的二维动态图像。
胸骨上窝切面
注意：探头置于锁骨上窝左侧，探头方向朝下
1. 记录主动脉弓的二维动态图像。
2. 在升主动脉处获取脉冲波频谱多普勒图像。
3. 在降主动脉处获取脉冲波频谱多普勒图像。

3. 测量

进行测量，包括整体纵向应变。为减少麻醉时间，应在离线状态下完成这些测量。

结果

图1展示了胸壁探头位置，用于显示胸骨旁长轴切面（图2）。该切面可准确测量左心室腔径和室壁厚度、收缩功能（图3）、左心室流出道直径（可用于其他公式计算，如心输出量）、升主动脉直径以及左心房直径。所有心腔尺寸均按体重进行校正。胸骨旁长轴切面可对主动脉瓣和二尖瓣进行解剖学评估（采用二维超声心动图）和功能评估（采用彩色多普勒成像）。该切面还可识别并测量心包积液（如存在）。M型超声可用于左心室测量（图3）：包括室间隔和左心室后壁厚度、左心室腔径、左心室收缩功能以及左心室质量¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹⁴。

左心室收缩功能通过射血缩短率进行评估，也可通过观察心脏周期中心室壁的运动和增厚情况来评估（通过心电图测定）。左心室质量通过以下公式计算：
LV mass = 0.8 x 1.04 x [(IVS + LVID + PWT)³ - LVID³]
（IVS：室间隔厚度；LVID：左心室内径；PWT：后壁厚度，测量均在舒张末期进行）¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹⁴。

图4 显示了用于获取胸骨旁短轴切面的探头在胸部的位置。该切面可用于观察右心室流出道、主动脉瓣、肺动脉瓣、肺动脉（图5），以及左心室中段腔室大小（图6）和功能（通过二维图像评估节段性收缩能力）¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹¹。

图7 显示了用于获取心尖切面的胸壁探头位置。在心尖四腔心切面（图8）中，可评估所有四个心腔的容积（包括四个心腔的面积及左心室容积）及其功能。还可对二尖瓣和三尖瓣的解剖结构与功能进行评价。通过心尖五腔心切面可获取左心室流出道、主动脉瓣血流及升主动脉的图像。心尖两腔心切面（图9）则侧重于左心房和左心室的大小及功能评估。心尖三腔心和五腔心切面可用于评价主动脉瓣及左心室流出道。综合上述所有切面，可对左心室不同室壁和节段进行评估，并研究多种收缩期和舒张期功能参数¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹¹。

左心室舒张功能可通过二尖瓣处的脉冲多普勒成像（图10）、左心室的等容舒张时间以及二尖瓣环处的组织多普勒成像进行评估¹^,³^,¹²。正常的二尖瓣流入血流呈双相，由左心房流向左心室。在正常情况下，与E波同步的早期血流速度高于随后在心房收缩时出现的血流速度（A波）。

左心室舒张功能也可通过组织多普勒成像进行研究，该技术可分析心肌运动速度（图11）。频谱组织多普勒成像可在一个心动周期内评估收缩和舒张功能，其频谱包含三个波峰：一个代表心肌收缩的正向收缩波（s'波），以及两个负向舒张波——早期舒张期心肌松弛波（e'波）和晚期舒张期心房主动收缩波（a'波），上述参数通常在二尖瓣环水平的室间隔或侧壁瓣环处进行测量¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹⁴。

通过脉冲多普勒在二尖瓣处和组织多普勒在二尖瓣环处对左心室舒张功能进行表征时，应包括以下参数：E波速度、A波速度、E/A比值、e'速度、a'速度、E/e'比值以及E波减速时间¹^,³^,⁴^,¹⁰^,¹⁴。

左心室收缩功能可通过二尖瓣环平面收缩期位移测量、缩短分数（图3）、射血分数、每搏输出量、心输出量、收缩期心肌组织s'波速度（图11）以及通过应变和应变率分析评估心肌形变所得的全局纵向应变（图12）进行研究¹^,³^,⁴^,¹⁰。

射血分数通过改良的辛普森法（Simpson 法）基于心尖四腔和两腔切面的血与组织界面的视觉描记，利用容积进行计算。在基底部或二尖瓣水平，通过一条直线连接二尖瓣环的两个对侧部分来闭合轮廓¹^,³^,⁴^,¹⁰。构成射血分数的血容量即为每搏输出量。若二尖瓣功能正常，则可将每搏输出量乘以心率以计算心输出量¹^,³^,⁴。每搏输出量基于心动周期中左心室流出道内的血流速度测量，计算公式如下：
SV = π × (LVOT 直径 / 2)² × VTI _(LVOT)
（LVOT：左心室流出道；LVOT 直径在胸骨旁长轴切面测量。VTI_(LVOT)：在心尖五腔切面通过脉冲波多普勒在 LVOT 处描记的速度时间积分）¹^,³。

评估左心室整体收缩功能最常用的基于应变的指标是通过心肌形变及应变和应变率分析获得的全局纵向应变（global longitudinal strain, GLS）¹^,³^,⁴^,¹⁰。该指标通常通过斑点追踪超声心动图进行评估，其中全局纵向应变的峰值表示左心室心肌从舒张末期到收缩末期的相对长度变化：
GLS(%) = (MLs − MLd)/MLd
（MLs：收缩末期心肌长度；MLd：舒张末期心肌长度）。

应首先采用心尖三腔心切面，利用频谱多普勒成像中主动脉瓣的开启和关闭“咔嗒”声，或M型成像中主动脉瓣的开启与关闭，以观察主动脉瓣关闭情况¹^,³^,⁴^,¹⁰。同时评估心尖四腔心和两腔心切面，并对这三个切面的测量结果取平均值。右心室收缩功能通过三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE）及三尖瓣环处的组织多普勒成像进行评估。所有瓣膜均采用彩色多普勒成像进行检查，可直接观察狭窄或反流情况（图13）。若存在主动脉瓣反流，可通过连续波多普勒成像测量缩窄颈（vena contracta）和压力减半时间进行研究与定量分析（图14）¹⁵。图15显示了在胸骨上窝切面所观察到的升主动脉、主动脉弓及降主动脉近段。

对麻醉大鼠进行超声成像操作，心脏研究的实验装置。
图1：胸骨旁长轴切面的探头放置位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

心脏超声示意图；标注了左心房（LA）、左心室（LV）、主动脉（Ao）和二尖瓣（MV）；超声心动图技术。
图2：左心房（LA）、左心室（LV）、主动脉瓣、升主动脉（Ao）和二尖瓣（MV）的二维胸骨旁长轴切面图像。 请点击此处查看此图的放大版本。

M型超声心动图评估心脏功能及心室测量分析。
图3：左心室M型超声心动图及其测量参数，包括舒张期室间隔厚度（IVSd）、舒张期与收缩期左心室内径（LVIDd 和 LVIDs）、舒张期左心室后壁厚度（LVIPWd）、缩短分数（%FS）、采用Teichholz法计算的射血分数[EF(Teich)]、左心室质量（LVdMass）、壁厚度（EPR）以及适用于啮齿类动物计算方法的左心室质量（LVM Mouse）。请点击此处查看该图的放大版本。

动物超声检查操作；对活体受试对象的科学实验；医学成像技术。
图4：胸骨旁短轴切面的探头放置位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

心脏超声，标注：RV、PA、Ao、RA、LA；超声心动图评估方法。
图 5：主动脉瓣（Ao）、左心房（LA）、右心房（RA）、右心室（RV）和肺动脉（PA）水平的二维胸骨旁短轴切面。 请点击此处查看该图的放大版本。

超声成像、横断面视图、超声心动图、心脏功能评估、医学诊断
图6：左心室乳头肌水平的胸骨旁短轴切面。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于实验过程中生理监测的小动物麻醉装置及心电图电极。
图 7：心尖四腔心切面探头位置示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示右心房（RA）、左心房（LA）及右心室（RV）、左心室（LV）的心脏腔室超声图像。
图8：包含左心房（LA）、左心室（LV）、右心房（RA）和右心室（RV）的四腔切面二维图像。 请点击此处查看此图的放大版本。

心脏超声；左心房（LA）、左心室（LV）、二尖瓣（MV）标注；超声心动图；心脏功能分析；医学影像。
图9：包含左心房（LA）、左心室（LV）和二尖瓣（MV）的心尖两腔切面二维超声心动图。 请点击此处查看该图的放大版本。

心脏超声多普勒超声心动图；二尖瓣血流速度；心脏功能分析。
图10：二尖瓣处脉冲波多普勒，显示E波速度 = 0.49 m/s，A波速度 = 0.33 m/s，E波减速时间 = 35 ms，E/A比值 = 1.48。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于心脏运动分析的多普勒超声心动图示意图，显示速度波形。
图11：二尖瓣环室间隔侧组织多普勒频谱，显示舒张期（e' 和 a'）与收缩期（s'）的心肌组织波形。 请点击此处查看该图的放大版本。

心脏超声分析，显示纵向应变百分比图和应变波形。
图12：通过四腔心切面评估纵向应变的心肌形变分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

彩色多普勒心脏超声，显示血流速度，超声心动图分析。
图13：彩色多普勒显示主动脉瓣反流。 请点击此处查看该图的放大版本。

心脏超声多普勒血流；超声心动图数据图表；心脏功能分析；脉搏波。
图14：心尖五腔切面主动脉瓣连续多普勒超声，显示基线上方存在反流，压力减半时间测得为95 ms。 请点击此处查看该图的放大版本。

主动脉弓超声；标注图；心血管成像；升主动脉、主动脉弓、降主动脉。
图15：升主动脉（Asc）、主动脉弓（Arch）和降主动脉（Desc）的胸骨上窝切面超声图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案允许使用常规医用超声设备和高频探头对成年大鼠进行完整的超声心动图研究。这是本方案的一个重要方面，因为专用于小动物的超声设备价格昂贵，且此类投资并不总是合理可行。

由于纵向成像研究需要反复麻醉，本方案提出在Wistar大鼠中使用美托咪定-咪达唑仑-芬太尼联合麻醉，因为与异氟烷或氯胺酮-赛拉嗪混合麻醉相比，该组合更适用于多次重复使用。然而，所提出的超声心动图方案可与任何其他麻醉方案兼容¹⁶。如文中所述，我们的超声心动图方案包含多个参数的评估，能够识别心脏的解剖和功能变化。

在解剖学特征方面，可以评估所有心腔的大小及其扩张情况、左心室肥厚、瓣膜纤维化或钙化。在心脏功能方面，可分析左心室的收缩与舒张功能以及右心室的收缩功能¹^,³^,⁴。此外，还可通过二维超声心动图（2D-echo）研究心脏瓣膜的解剖结构（识别纤维化、钙化或异常开放），并通过多普勒成像评估其功能，检测狭窄或反流。彩色多普勒成像可用于观察血流方向和湍流，而频谱多普勒波形则可测量血流速度和压力阶差¹^,³。

几乎所有大鼠（最轻体重为200 g）均获得了足够的图像质量，但由于个体间解剖结构的差异，超声心动图切面在不同大鼠之间可能无法获得完全相同的清晰度，这可能会影响心腔尺寸的测量。左心室M型测量的观察者内变异率为5%¹⁷。特别是，使用M型进行左心室测量时可能存在以下局限性：难以获得垂直角度；仅包含基底节段（在存在不对称肥厚或区域性收缩功能障碍时导致测量不准确）；以及几何学假设（假定左心室为长/短轴比为2:1的长椭球体，且肥厚呈对称分布）。此外，使用立方计算可能影响准确性，因为即使尺寸测量存在微小误差，也可能导致心肌质量被高估¹^,³^,¹⁰。即使采用Simpson法计算容积和射血分数，也存在缺点：心尖部常被缩短；心内膜信号脱落可能使测量产生偏差，且无法识别在心尖四腔和两腔切面中未显示的形态畸变¹^,³^,¹⁰。

重要的是，本方案强调使用先进的测量与评估方法，例如通过斑点追踪技术评估左心室应变及应变率，以获得关于心肌纤维行为的更全面信息¹^,³。为了更准确地评估应变和应变率，需要优化图像质量，最大化帧率，并尽量减少心尖缩短伪影。采用中层心肌整体纵向应变，因其与更多已发表的数据一致，并且已在多项临床研究中被证实具有良好的稳健性和可重复性¹⁰。设备集成的心电图监测极易受到伪影干扰，这是其局限性之一。此外，必须强调的是，大鼠心脏的功能或血流动力学状态可能受温度、血压和心率等变量的影响⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹³^,¹⁴^,¹⁷。

由于分辨率与探头频率相关，未来的发展预计将开发出更高频率的探头，从而利用此类设备在小型动物无创心血管成像中实现更高的分辨率和图像清晰度。在该研究领域，方法和测量的标准化被认为至关重要，有助于对实验大鼠模型进行更精确的超声心动图诊断，并进一步加深对人类心血管疾病分子生物学机制的理解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

ARSP 和 ATP 分别获得了科学技术基金会提供的博士研究生奖学金 SFRH/BD/121684/2016 和博士后奖学金 SFRH/BPD/123181/2016 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
12S-RS 探针	GE Medical Systems	H44901AB
Antisedan（5 mg/mL）	Esteve	P01B9003
心电图监测仪	GE Medical Systems	N/A
电极片	FIAB	F9089/100
芬太尼（0.05 mg/mL）	B.Braun	BB3644960
氟马西尼（0.1 mg/mL）	Generis	MUEH5933080
胰岛素注射器 1 mL	SOL M	1612912
Lubrithal 凝胶（10 mg）	Dechra	NC519
Medetor（1 mg/mL）	Vibarc	P01B0308
咪达唑仑（5 mg/mL）	Labesfal	MUEH5506191
AESCULAP Isis GT608 型小动物剃毛刀	Braun	90200714
小动物加热垫 120 V	K&H Manufacturing inc.	655199010608
超声耦合凝胶	Parker Laboratories	REF 01-08
超声设备	GE Medical Systems	VIVID T8
护理垫	Henry Schein	900-8132

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成年大鼠心脏解剖结构与功能的超声心动图评估

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