脑区三维结构中神经元纤维的长度是量化特定神经元结构完整性或退变的可靠参数。本文以小鼠梅内特基底核内胆碱能纤维长度的测量为例，详细介绍了一种体视学定量方法。
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摘要
摘要
不同脑区中胆碱能或其他神经元轴突的长度通常与该区域的特定功能相关。体视学是一种用于定量分析各种脑结构中神经元轮廓的有用方法。本文提供了一种基于软件的体视学方案，用于估算基底前脑Meynert基底核（NBM）中胆碱能纤维的总长度。该方法采用空间球探针进行长度估算。胆碱能纤维通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色，并利用辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺（HRP-DAB）检测系统显色进行可视化。该染色方案同样适用于使用体视学软件对多个脑区中的纤维和细胞数量进行定量分析。该体视学方案还可用于估算其他线性结构，如胆碱能受体纤维、多巴胺能/儿茶酚胺能纤维、5-羟色胺能纤维、星形胶质细胞突起，甚至血管结构。
引言
对脑内神经纤维长度和/或密度的定量估计是神经病理学研究中的重要参数。胆碱能、多巴胺能和5-羟色胺能轴突在不同脑区的长度通常与该区域的特定功能相关。由于这些轴突的分布通常具有异质性，因此采用基于设计的体视学方法以避免取样过程中的偏差。体视学中的“空间球”探针（space ball probe）被设计用于高效且可靠地测量感兴趣区域内类似线状结构的神经纤维1。该探针生成一个虚拟球体，并系统地叠加于组织上，用于测量纤维与探针表面的交点。由于无法在实际组织中放置真实的球形探针，商用软件提供了一个虚拟的三维（3D）球体，其本质上是一系列不同直径的同心圆，用以代表球形探针的表面。
选择性胆碱能神经变性是阿尔茨海默病（AD）的一致特征之一2,3,4。胆碱能传递功能障碍被认为是导致AD认知能力下降的致病因素。胆碱能功能障碍也在许多其他精神疾病中表现明显，例如帕金森病、成瘾和精神分裂症。在动物模型中，研究人员已从多个方面研究了胆碱能神经变性（例如乙酰胆碱水平降低5、ChAT蛋白减少6、淀粉样斑块附近胆碱能纤维的神经变性6，以及胆碱能纤维和突触膨体数量减少7,8）。由于并非所有研究中均观察到胆碱能神经元丢失，因此认为纤维变性可能早于神经元丢失发生。大多数胆碱能神经元位于基底前脑和脑干，其轴突投射至大脑多个区域，如大脑皮层和海马。基底前脑核（NBM）位于基底前脑，被发现是AD中最常受累的脑区之一。
体视学中的分切法基于对组织在多个层面进行系统性随机取样。切片取样分数（SSF）是指在分切法中不依赖计算机的系统性切片取样方法。面积取样分数（ASF）是指对切片中感兴趣区域的面积进行分切。厚度取样分数（TSF）是指对切片厚度进行分切。空间球探针使我们能够在分切位置上的三维球体内量化感兴趣的目标轮廓。本文以小鼠脑内核基底前脑（NBM）中胆碱能纤维总长度的估算为例，说明该方法的操作流程。本实验方案详细介绍了组织处理、体视学取样方法、使用ChAT抗体进行免疫组织化学染色，以及无偏体视学法用于估算小鼠脑NBM中胆碱能纤维长度和纤维密度的具体步骤。
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方案
使用这些动物的所有操作均已获得堪萨斯城退伍军人事务医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验使用了18月龄过表达瑞典突变型β-淀粉样前体蛋白（APPswe）的小鼠及其C57/BL6野生型同窝小鼠。有关繁育和基因分型的详细信息见He等人的研究8。
1. 灌注与组织处理
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行腹腔注射麻醉小鼠。在继续操作前，轻捏脚趾以确认无反应9。
- 经心脏灌注约 50 mL 冰冷的 0.1 M Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS），随后灌注 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中含 4% 多聚甲醛（PFA）的溶液10。
注意：PFA 具有毒性。操作时需佩戴个人防护装备（PPE）。 - 取出脑组织10，置于 4 °C 条件下，在 0.1 M PB 中含 4% PFA 的溶液中后固定 24 小时。用 DPBS 洗涤 3 次。
- 将组织转移至 0.1 M DPBS 中含 15% 蔗糖的溶液中过夜，随后转移至 0.1 M DPBS 中含 30% 蔗糖的溶液中，在 4 °C 下继续孵育 48 小时。
- 将组织从蔗糖溶液中取出，在预设温度为 -20 °C 的冷冻切片机腔室内速冻。冷冻样本可保存于密封管中，置于 -80 °C 冰箱中，直至切片使用。
- 将组织包埋于最佳切割温度 包埋介质（见材料表）中，并固定于样本托盘上。使用冷冻切片机在冠状面上连续切片，厚度为 30 µm，将所有切片依次收集于含有冷冻保护液（30% 甘油、30% 乙二醇、40% DPBS；图 1A–C）的 24 孔细胞培养板中。储存于 -20 °C 冰箱中。
备注：在条件允许时，较厚的切片（例如 50 µm）更为理想。确保切片保持切割顺序，且所有切片完全浸没于冷冻保护液中。可选用 96 孔板替代 24 孔板用于收集切片。 - 用封板膜覆盖孔板以防止蒸发和干燥。将孔板储存在 -20 °C 冰箱中，直至后续使用。在 -20 °C 下储存的切片用于 ChAT 免疫组织化学染色时可稳定保存数月。
2. 免疫组化系统性切片选择
注意：应先进行预实验，以确定达到可接受的抽样误差系数（CE）所需的总切片数量。CE值用于表示抽样过程中总误差量，数值越低代表误差越小，此处所用软件认为CE值低于0.1即为可接受（参见材料表）11。
- 通过将每个脑组织的形态学特征与标准小鼠脑图谱（如 Franklin 和 Paxinos 图谱）进行比较，确定脑组织的起始和终止节段。基底前脑核（NBM）起始于前囟（bregma）-0.0 mm，终止于-1.6 mm，因此约包含50个节段。总节段数是体视学分析过程中所需的一个参数。每8个节段中选取一个th 1/8 节段（SSF = 1/8）共提供 6–7 个节段用于分析，在我们的预实验中，该方法在体积估算和纤维长度估算方面均获得了可接受的切割误差（CE）。
- 随机从前八个区段中的任意一个开始，然后系统性地每隔8个区段进行取样th 节段，直至包含NBM的最后后段图1C).
3. 免疫组织化学
- 将冷冻保存的切片转移至含有冷冻保护剂的六孔板中，置于室温下，随后转入0.1 M磷酸缓冲液（PB）中。
- 用 PB 洗涤 3 次。
- 在 0.3% H₂O₂ 中孵育2O2 在甲醇中放置15分钟。
- 用 TBS 洗涤 3 次。
- 在 TBS 中加入 0.25% Triton X-100，孵育 30 分钟。
- 用含10%正常牛血清（NBS）和0.1% Triton X-100的TBS溶液封闭30分钟。
- 用1:1,000稀释的山羊抗人ChAT一抗孵育（参见 材料表在含0.1% Triton X-100和1% NBS的TBS中，4 °C下孵育48 h。
- 室温下用TBS洗涤3次。后续所有孵育和洗涤步骤均在室温下进行。
- 孵育生物素标记的牛抗山羊二抗（参见 材料表1小时。
- 用TBS洗涤3次。
- 与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育（参见 材料表).
- 用TBS洗涤3次。
- 使用增强型DAB过氧化物酶底物溶液显色（参见 材料表按照制造商的建议进行。
警告：DAB 为疑似致癌物，通过接触和吸入具有毒性。操作 DAB 时须使用个人防护装备（PPE）。 - 用蒸馏水洗涤切片数次，然后置于 Tris（pH = 7.6）中保存。
- 将切片贴附于明胶包被的载玻片上。同一组织的所有切片可置于同一张载玻片上。室温晾干切片，依次用70%、90%、95%和100%乙醇各脱水两次，每次5分钟，然后用二甲苯洗涤两次，每次10分钟以透明切片。使用封片介质封片（参见 材料表).
注意：脱水和透明处理的时间会影响切片的厚度。因此，所有切片应采用相同的处理条件。在本研究中，最终切片厚度的平均值为21.11 ± 0.45 µm。 - 将切片置于通风橱中干燥。干燥后的切片即可用于体视学分析。
4. 体视学
注意：参见材料表中所使用的显微镜和软件。若有必要，应使用数值孔径（NA）> 1.2 的浸油物镜。载玻片应根据基因型或处理组进行分组并编码。同一项研究的完整体视学分析应由同一个人完成，且执行体视学分析的人员应对所检测的单个载玻片或分组的身份保持盲态1,12,13。
- 在软件中新建一个研究项目。文件 > 新研究）。一个“研究初始化“对话框将打开。填写研究信息，使用” 多水平 (基于组分) (图2A).
- 双击“体积在……之下 参数，这将打开 体积 对话框。命名感兴趣特征并选择“区域点计数探针。点击 下一步.
- 双击下一个参数“长度'.
- 提供该功能的名称（例如，'L选择“）”球体探针并点击 下一步.
- 接下来，单击“研究初始化“对话框，该对话框将打开”病例初始化盒中填写病例信息。研究开始前必须对各组进行编码。总切片数是指从包含目标区域的第一张切片到最后一张包含目标区域的切片之间的切片总数（参见步骤2.1）。切片采样间隔为8，因为每8张切片th 选择该切片进行免疫组化染色。
- 点击 下一步 打开“探针初始化“对话框，该对话框将自动为区域选择和体积估算设置最低放大倍数。确认设置，并检查在所选的较低放大倍数下是否能够识别目标区域。双击”体积 并填充 50,000 µm3 每个点对应区域体积分数。点击 完成.
- 下方 高倍放大，设置 长度 在63倍或100倍下。双击“长度以打开 长度-球体 对话框中将球体直径设置为 10 µm。点击 完成.
注意：保护区域的设定应基于切片的实际厚度。操作者必须在多个位点检查切片厚度，以避免造成任何损伤。如有必要，应根据切片厚度调整保护区域的厚度。 - 设置适当的帧面积、帧高度、保护区域和帧间距值。
注意：这些数值取决于研究区域内物体轮廓（纤维）的异质性。一个400 µm的帧面积2，10 µm 的帧高、2 µm 的保护区和 300 µm 的帧间距可为 NBM 中的纤维长度估计提供可接受的 CE 值。在进入下一个案例之前，必须使用这些参数进行预实验研究。 - 按照每一步操作后软件提供的说明进行操作。这些说明会以对话框和/或屏幕底部的文字形式显示。
- 插入第1节
- 在低倍镜（5x）下，通过在 NBM 周围绘制任意边界来定义感兴趣区域。点击 下一步 视频窗口左下角的按钮。按照说明操作，并确认所有绿色标记点均位于NBM内。可通过单击标记点来包含或排除这些点。
注意：基底前脑核（NBM）没有明确固定的边界，其范围主要由研究者自行界定。NBM 中的 ChAT+ 胆碱能神经元可见于内囊（ic）和苍白球（GP）。在本方案中，包含内囊中带有 ChAT+ 胆碱能神经元及其投射纤维的区域，以及整个苍白球，均被划入 NBM 范围图1D). - 按照说明操作，将当前分馏样品的纤维测量倍数调整为63倍。切片厚度屏幕上出现“对话框”。设置该切片的上表面和下表面以测量切片的实际厚度。应使用手动Z轴移动。单击 完成.
注意：如果该区域无纤维存在，可跳过此步骤，直接进入下一个组分位置。 - 缓慢地沿该截面的高度方向从上至下移动Z轴，并标记虚拟球形探针表面上所有相交的纤维图3）。完成后，单击 下一步 前往下一个位置。
- 完成所有切片后，软件将提示插入下一个切片。对组织的全部六个或七个切片重复步骤 4.9–4.12。
- 最后，软件将生成该案例的结果，显示CE值（图4）。如果CE可接受，则继续下一个案例。 文件 > 新案例。如果CE不符合要求（图4A），软件会建议调整某些参数。在多数情况下，减小帧间距可将CE值降至可接受范围内（图4B).
- 完成所有病例后，生成每个病例及每组的结果文件 > 结果).
5. 分析与统计
- 该软件为每个样本和每组提供数据。软件自身会计算 SSF、ASF 和 TSF 等分数，并提供参考区域（本例中为 NBM）内纤维的总体积（VREF）和总长度（L）（图 4B）。导出数据并保存或复制到所选的统计软件中进行组间分析。表 1展示了用于统计分析的典型结果数据。通过将纤维总长度除以参考体积来分析纤维密度（Lv）。
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结果
代表性结果见表1和图5。C组被解码为APPswe组（APP），其纤维长度（图5B）和纤维长度密度（图5C）均显著低于其野生型（WILD）同窝小鼠。结果显示，所分析的两组之间NBM体积无显著差异（图5A）。
图1：本研究中组织...
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讨论
在此，我们演示一种利用空间球（球体）探针估算基底前脑（NBM）内胆碱能纤维密度的方法。该探针可用于估算目标区域内的纤维总长度，将总长度除以该区域的体积即可得到纤维密度。为估算区域体积，采用卡瓦列里（Cavalieri）点计数法。卡瓦列里点计数法是一种对任意三维参考体积进行无偏且高效估计的方法。该方法通过计算切片截面上的点数（代表面积分数），再乘以所分析切片之间的距离，从而估算出截面面积的近似值。11该方法无需耗时费力地精确勾画目标区域的边界，可与光学分馏器结合使用，以估算细胞和纤维的密度。
体视学分析需要精确的取样方法。感兴趣脑区应通过染色准确界定。根据 Franklin 和 Paxinos 小鼠脑图谱，基底前脑核（NBM）位于前囟（bregma）AP -0.0 mm 至 -1.6 mm 之间。进行免疫组织化学染色时，切片应系统性随机选取，即首先随机选择第一张切片，随后按固定间隔系统性地选取其他切片。对于成年小鼠脑组织，NBM 在前后方向上约有 1,600 µm，相当于约 53 张厚度为 30 µm 的冠状切片。若每第 8t...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国退伍军人事务部医学研究与发展服务局（杰出研究奖 1I01 BX001067-01A2）、阿尔茨海默病协会（NPSPAD-11-202149）向 W.Z.S. 提供的资助，以及中西部生物医学研究基金会提供的资源支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ABC试剂盒 | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 抗ChAT抗体 | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| 牛抗山羊IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| 成年牛血清 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| 冷冻切片机 | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB试剂盒 | Vector Laboratories | SK4105 | 增强型DAB过氧化物酶底物溶液 |
| 氯胺酮 | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| 显微镜 | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | 配备电动载物台和IMI-tech彩色数字相机 |
| 最佳切割温度（O.C.T.）包埋介质 | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount封片介质 | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| 体视学分析软件（Stereologer Software） | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | 安装在戴尔台式计算机上 |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma碱基 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris碱 |
| Trizma盐酸盐 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris盐酸盐 |
| 赛拉嗪 | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| 二甲苯，组织学级 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
参考文献
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