小鼠脑基底前脑Meynert核内胆碱能纤维长度的体视学估算

摘要

脑区三维结构中神经元纤维的长度是量化特定神经元结构完整性或退变的可靠参数。本文以小鼠梅内特基底核内胆碱能纤维长度的测量为例，详细介绍了一种体视学定量方法。

摘要

不同脑区中胆碱能或其他神经元轴突的长度通常与该区域的特定功能相关。体视学是一种用于定量分析各种脑结构中神经元轮廓的有用方法。本文提供了一种基于软件的体视学方案，用于估算基底前脑Meynert基底核（NBM）中胆碱能纤维的总长度。该方法采用空间球探针进行长度估算。胆碱能纤维通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色，并利用辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺（HRP-DAB）检测系统显色进行可视化。该染色方案同样适用于使用体视学软件对多个脑区中的纤维和细胞数量进行定量分析。该体视学方案还可用于估算其他线性结构，如胆碱能受体纤维、多巴胺能/儿茶酚胺能纤维、5-羟色胺能纤维、星形胶质细胞突起，甚至血管结构。

引言

对脑内神经纤维长度和/或密度的定量估计是神经病理学研究中的重要参数。胆碱能、多巴胺能和5-羟色胺能轴突在不同脑区的长度通常与该区域的特定功能相关。由于这些轴突的分布通常具有异质性，因此采用基于设计的体视学方法以避免取样过程中的偏差。体视学中的“空间球”探针（space ball probe）被设计用于高效且可靠地测量感兴趣区域内类似线状结构的神经纤维¹。该探针生成一个虚拟球体，并系统地叠加于组织上，用于测量纤维与探针表面的交点。由于无法在实际组织中放置真实的球形探针，商用软件提供了一个虚拟的三维（3D）球体，其本质上是一系列不同直径的同心圆，用以代表球形探针的表面。

选择性胆碱能神经变性是阿尔茨海默病（AD）的一致特征之一^2,3,4。胆碱能传递功能障碍被认为是导致AD认知能力下降的致病因素。胆碱能功能障碍也在许多其他精神疾病中表现明显，例如帕金森病、成瘾和精神分裂症。在动物模型中，研究人员已从多个方面研究了胆碱能神经变性（例如乙酰胆碱水平降低⁵、ChAT蛋白减少⁶、淀粉样斑块附近胆碱能纤维的神经变性⁶，....

方案

使用这些动物的所有操作均已获得堪萨斯城退伍军人事务医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验使用了18月龄过表达瑞典突变型β-淀粉样前体蛋白（APPswe）的小鼠及其C57/BL6野生型同窝小鼠。有关繁育和基因分型的详细信息见He等人的研究⁸。

1. 灌注与组织处理

1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行腹腔注射麻醉小鼠。在继续操作前，轻捏脚趾以确认无反应⁹。
2. 经心脏灌注约 50 mL 冰冷的 0.1 M Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS），随后灌注 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中含 4% 多聚甲醛（PFA）的溶液¹⁰。
   注意：PFA 具有毒性。操作时需佩戴个人防护装备（PPE）。
3. 取出脑组织¹⁰，置于 4 °C 条件下，在 0.1 M PB 中含 4% PFA 的溶液中后固定 24 小时。用 DPBS 洗涤 3 次。
4. 将组织转移至 0.1 M DPBS 中含 15% 蔗糖的溶液中过夜，随后转移至 0.1 M DPBS 中含 30% 蔗糖的溶液中，在 4 °C 下继续孵育 48 小时。
5. 将组织从蔗糖溶液中取出，在预设温度为 -20 ....

结果

代表性结果见表1和图5。被解码为APPswe组（APP）的C组与野生型（WILD）同窝小鼠相比，纤维长度（图5B）和纤维长度密度（图5C）显著降低。结果显示，所分析的两组之间NBM体积无显著差异（图5A）。

讨论

在此，我们演示一种利用空间球（球体）探针估算基底前脑（NBM）内胆碱能纤维密度的方法。该探针可用于估算目标区域内的纤维总长度，将总长度除以该区域的体积即可得到纤维密度。为估算区域体积，采用卡瓦列里（Cavalieri）点计数法。卡瓦列里点计数法是一种对任意三维参考体积进行无偏且高效估计的方法。该方法通过计算切片截面上的点数（代表面积分数），再乘以所分析切片之间的距离，从而估算出截面面积的近似值。¹¹该方法无需耗时费力地精确勾画目标区域的边界，可与光学分馏器结合使用，以估算细胞和纤维的密度。

体视学分析需要精确的取样方法。感兴趣脑区应通过染色准确界定。根据 Franklin 和 Paxinos 小鼠脑图谱，基底前脑核（NBM）位于前囟（bregma）AP -0.0 mm 至 -1.6 mm 之间。进行免疫组织化学染色时，切片应系统性随机选取，即首先随机选择第一张切片，随后按固定间隔系统性地选取其他切片。对于成年小鼠脑组织，NBM 在前后方向上约有 1,600 µm，相当于约 53 张厚度为 30 µm 的冠状切片。若每第 8^t.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABC试剂盒	Vector Laboratories	PK6100
抗ChAT抗体	Millipore, MA, USA	AB144P
牛抗山羊IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
成年牛血清	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
冷冻切片机	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
乙二醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
甘油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
过氧化氢	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB试剂盒	Vector Laboratories	SK4105	增强型DAB过氧化物酶底物溶液
氯胺酮	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
显微镜	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	配备电动载物台和IMI-tech彩色数字相机
最佳切割温度（O.C.T.）包埋介质	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
多聚甲醛	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount封片介质	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
体视学分析软件（Stereologer Software）	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	安装在戴尔台式计算机上
吐温X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma碱基	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris碱
Trizma盐酸盐	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris盐酸盐
赛拉嗪	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
二甲苯，组织学级	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056