本文介绍了一种通过向小鼠眼内前房注射硅油以诱导眼压升高及青光眼性神经变性的实验方案，以及从前房中清除硅油从而使升高的眼内压恢复至正常水平的操作步骤。
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本文内容
摘要
摘要
眼内压（IOP）升高是青光眼明确的危险因素。本文介绍一种新颖且有效的方法，可稳定地在小鼠中诱导眼内压升高，模拟在人类玻璃体视网膜手术中使用硅油（SO）作为填充剂后所发生的术后并发症。在本方案中，将硅油注入小鼠眼的前房，以阻塞瞳孔并阻止房水流入。后房因此积聚房水，进而导致后段眼内压升高。单次注射硅油即可产生可靠、充分且稳定的IOP升高，从而诱发显著的青光眼性神经退行性变。该模型真实再现了眼科临床中的继发性青光眼。为进一步模拟临床情况，可从前房中清除硅油，重新开放引流通路，使房水得以流入并经前房角的小梁网（TM）排出。由于眼内压可迅速恢复正常，该模型可用于评估降低眼内压对青光眼性视网膜神经节细胞的影响。该方法操作简便，无需特殊设备或重复操作，能高度模拟临床实际，且可能适用于多种动物物种，但可能需要进行细微调整。
引言
视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突进行性丢失是青光眼的典型特征，青光眼是一种常见的视网膜神经退行性疾病1。到2040年，该病将影响超过1亿名40至80岁的个体2。眼内压（IOP）仍是青光眼发生和进展过程中唯一可调节的危险因素。为了研究青光眼的发病机制、疾病进展及潜在治疗方法，建立一种可靠、可重复且可诱导的实验性高眼压/青光眼模型，以模拟人类患者的关键特征，显得至关重要。
眼内压（IOP）取决于房水从后房的睫状体流入前房，以及通过前房角的小梁网（TM）流出。当达到稳态时，眼内压得以维持。当房水流入量超过或低于流出量时，眼内压相应升高或降低。通过阻塞前房角或损伤小梁网以减少房水流出，已建立了多种青光眼模型3,4,5,6,7,8,9,10。这些模型通常伴随不可逆的眼部组织损伤，且前房内高眼压还会引起角膜水肿和眼内炎症等不良并发症，使得视网膜成像和视觉功能检测难以实施和解读。
为了建立一个克服上述缺陷的模型，我们聚焦于硅油（SO）引起的眼科继发性青光眼，该病症是人类玻璃体视网膜手术后已充分记录的术后并发症11,12。由于硅油具有高表面张力，因此在视网膜手术中被用作填充剂。然而，硅油的密度低于房水和玻璃体液，会漂浮并物理性阻塞瞳孔，从而阻碍房水流入前房。这种阻塞导致后房房水积聚，引起眼内压（IOP）升高。基于此机制，我们致力于开发并表征一种新型的眼高压小鼠模型，该模型基于前房内注射硅油并造成瞳孔阻滞13，具备继发性青光眼的关键特征：有效的瞳孔阻滞、显著且可在硅油清除后恢复至正常水平的眼内压升高，以及青光眼性神经变性。
本文介绍了一种在小鼠眼中诱导硅油所致眼压升高的详细实验方案，包括硅油注射与清除以及眼内压测量。
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方案
所有实验程序均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 通过玻璃体内注射SO诱导眼内高压
- 使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成玻璃微毛细管，以制备用于前房内硅油注射的玻璃微移液管。在微移液管尖端切开一个开口，并使用微型研磨斜面仪进一步修整尖端，制成35°−40°的斜面。
- 用清水清洗以抛光斜面边缘并去除所有碎屑。使用前对微移液管进行高压灭菌。
- 准备用于角膜穿刺进入的穿刺针。将32 G针头连接至带有鲁尔锁的5 mL注射器上，并用胶带进一步固定。将针头斜面朝上弯曲成30°角。
- 首先将钝头18 G针头连接并固定在10 mL注射器上，以制备硅油注射装置；然后将塑料管一端连接至18 G针头，从另一端根据需要填充硅油。
- 将已灭菌的微移液管连接至塑料管，推动注射器活塞，使硅油完全充满整个微移液管。
2. 单眼前房内SO注射
- 将一只9至10周龄的雄性C57B6/J小鼠放入诱导室，使用3%异氟烷与氧气混合气体（流速为2 L/min）麻醉3分钟。
- 按0.3 mg/g体重剂量经腹腔注射2,2,2-三溴乙醇。
注意：与氯胺酮/赛拉嗪不同，2,2,2-三溴乙醇不会引起明显的瞳孔扩张。 - 通过夹捏脚趾无反应以及胡须或尾巴无运动来判断麻醉深度。
- 将小鼠侧卧置于手术平台上。在注射前，向角膜表面滴加一滴0.5%盐酸丙帕卡因，以降低手术过程中的敏感性。
- 使用32 G穿刺针在角膜缘上方颞侧象限约0.5 mm处做一穿刺切口。
- 在刺入前房之前，使针头在角膜各层中穿行约0.3 mm。操作时注意避免接触晶状体或虹膜。
- 缓慢退出针头，使少量房水（约1−2 µL）经隧道切口（前房穿刺）流出。
- 等待约8分钟以进一步降低眼内压。可通过测量对侧未处理眼的眼压进行判断。
- 将预先装有硅油（SO）的玻璃微移液管经角膜隧道插入前房，针尖斜面朝下对准虹膜表面。
- 缓慢推动注射器活塞，将硅油注入前房，直至油滴覆盖大部分虹膜表面，直径约为2.3−2.4 mm。
- 注射后将微移液管在前房内保留10秒，再缓慢拔出。
- 轻压上眼睑，使角膜切口闭合，以尽量减少硅油渗漏。
- 在眼球表面涂抹抗生素眼膏（杆菌肽-新霉素-多黏菌素）。
- 在整个操作过程中，需频繁使用人工泪液湿润角膜。
- 将小鼠置于加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。
3. 二氧化硫去除
- 准备灌注系统。
- 根据制造商说明配制灌注液，并将其放入灌注瓶中。将灌注液瓶抬高至手术台上方110−120 cm（81−88 mmHg）处。
- 将一套静脉输液管连接至灌注液瓶，排出输液管中的气泡。将一根弯成20°朝上的33 G针头连接至输液管末端。
- 准备引流系统：从1 mL注射器中取出活塞，将一根33 G针头连接至注射器，并将针头弯成20°。
- 清除前房中的硅油（SO）。
- 腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（0.3 mg/g体重）。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度，并观察胡须或尾巴无活动。
- 将小鼠置于手术台上，用胶带固定于侧卧位。在角膜表面滴加一滴0.5%盐酸丙帕卡因，以降低其敏感性。
- 使用预先制备的32 G穿刺针，在硅油滴边缘的角膜颞侧象限（约2至5点钟位置）做两个切口。
- 将连接灌注液的33 G灌注针通过一个角膜切口插入，调至最大流速。
- 将另一根连接无活塞注射器的33 G引流针通过另一个角膜切口插入，使硅油滴在灌注液冲洗的同时从前房排出。
- 先撤出引流针，再撤出灌注针。
- 向眼前房注入一个空气泡以维持其正常深度，并轻压以闭合角膜切口。
- 在双眼涂抹抗生素眼膏。
- 将小鼠置于加热恢复垫上，直至完全从麻醉中恢复。
每周一次眼压测量
- 将小鼠放入诱导室中，以3%异氟烷与氧气混合气体（流速2 L/min）麻醉3分钟。
- 腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮（赛拉嗪0.01 mg/g，氯胺酮0.08 mg/g）。
- 在整个操作过程中，通过滴加人工泪液保持角膜湿润。
- 等待约15分钟，使瞳孔充分散大。
- 根据眼压计产品说明书测量双眼的眼内压（IOP）。将眼压计靠近小鼠眼睛，保持探头尖端与小鼠角膜之间的距离约为3−4 mm。按测量按钮6次以获得一个读数，每眼获取3个仪器自动生成的读数，用于计算平均眼内压。
- 在玻璃体腔注射SO后8周处死动物，并进行视网膜全层铺片免疫组织化学染色、视网膜神经节细胞计数、视神经（ON）半薄切片以及存活轴突数量的定量分析，相关方法已有先前报道13。
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结果
注射后不久，我们即可轻松识别出因硅油（SO）液滴过小（≤1.5 mm）而未能形成稳定高眼压的小鼠13。这些动物将被排除在后续实验之外。在注射操作后，超过80%的注射SO小鼠其液滴尺寸大于1.6 mm。单次注射SO后，我们每周测量一次这些小鼠眼压，持续8周。接受SO注射的眼压持续升高，通常为对侧对照眼眼压的两倍，表明瞳孔阻滞效果良好（图1）。角膜水肿可在前房注射后通过光学解剖显微镜进行检查，通常需要2−3天恢复。瞳孔扩张需要一定时间，因此必须在瞳孔充分扩张后才能进行眼压测量。因此，我们尽量避免在注射后过早测量眼压。基于相同原因，也不建议频繁测量眼压。在另一组小鼠中，我们在SO注射2周后将前房内的SO冲洗清除，并再等待1周以使角膜充分恢复，随后测量眼压，结果显示眼压稳定恢复至正常水平（图1）。
为了确定由硅油（SO）注射诱导的眼内高压对视网膜神经节细胞（RGCs）的影响，我们在SO注射后8周，通过RBPMS染色对视网膜铺...
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讨论
本文展示了一种通过前房注射硅油（SO）在小鼠眼中诱导持续性眼内压（IOP）升高的简单而有效的方法。任何具备显微镜下显微解剖经验的研究人员均可快速掌握该操作。该方法主要的潜在失败风险是硅油从角膜切口处泄漏。然而，使用硅油的一个优势在于，由于油滴可见且可测量，我们能够在注射后很快识别出那些因油滴过小而无法诱导稳定高眼压的小鼠，并将其排除在后续实验之外。我们通常能达到80%的成功率，约20%的小鼠因硅油滴过小（≤1.5 mm）而被排除13。然而，经验丰富的手术操作者可在穿透角膜进入前房之前，在角膜各层之间制作相对较长的隧道（0.3 mm），并通过使角膜隧道的内口明显小于外口，几乎完全防止硅油泄漏。因此，几乎所有小鼠注射的硅油滴直径均大于1.8 mm。除了隧道长度外，还有一些关键操作要点值得强调。首先，注射过程中应保持眼内压较低，以避免硅油被推出前房。一个常见的错误是注入过多硅油，这会增加泄漏风险。我们控制前房内硅油的体积，使其几乎完全覆盖虹膜表面，但并非完全充满。该硅油滴的直径约为2.3−2.4 mm。其次，角膜隧道切口应尽可能靠近角膜缘，以便切口接近虹膜但不损伤虹膜，从而使虹膜易于覆盖切口。第...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 EY024932、EY023295 和 EY028106，资助对象为 YH。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 盐酸丙帕卡因 | Akorn, Somerset | ||
| 10 mL 注射器 | BD | Luer-Lok 接头 | |
| 18G 针头 | BD | 常规斜面，针头长度：25.4 mm | |
| 2,2,2-三溴乙醇（Avertin） | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50 g |
| 32G 纳米针头 | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine 笔式针头-32G 4 mm |
| 33G 眼科针头 | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5 mL 注射器 | BD | Luer-Lok 接头 | |
| 镇静注射液（赛拉嗪，AnaSed） | Butler Schein | 100 mg/mL，50 mL | |
| 人工泪液 | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra 润滑型滴眼液 |
| BSS PLUS 灌注液 | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| 双级玻璃微电极拉制仪 | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic 系统 | EZ system | ||
| 异氟烷 | VetOne | 502017 | 异氟烷，USP，250 mL/瓶 |
| 静脉输液套件 | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| 盐酸氯胺酮注射液 | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100 mg/mL * 10 mL |
| 微型研磨斜面仪 | NARISHIGE | EG-401 | |
| 微型 EVA 软管 | McMaster-Carr | 1883T4 | 内径 0.05"，外径 0.09"，长度 10 英尺 |
| 硅油（SILIKON） | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa·s |
| 标准玻璃毛细管 | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 英寸（100 mm），外径 1.5 mm，内径 0.84 mm |
| TonoLab 眼压计 | Colonial Medical Supply, 芬兰 | ||
| 兽用抗生素眼膏 | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP 眼科眼膏，Vetropolycin |
参考文献
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