通过尾静脉葡萄糖注射检测联体小鼠间共享血液供应的建立

摘要

本文介绍了一种通过尾静脉注射葡萄糖来检测两个连体共生小鼠成功建立共享血液循环的新方法，该方法造成的损伤极小，且不会导致连体共生小鼠死亡。

摘要

异种共生是一种通过手术将两只动物沿身体纵轴并列连接的实验方法。本文介绍了一种通过尾静脉注射葡萄糖来检测异种共生体血液嵌合成功建立的方案。构建了异种共生小鼠模型，通过尾静脉向供体小鼠注射葡萄糖，并在不同时间点使用血糖仪测量两只小鼠的血糖水平变化。结果显示，注射葡萄糖后，供体小鼠的血糖水平在1分钟后迅速升高，随后缓慢下降；而受体小鼠的血糖水平在注射后15分钟达到峰值。使用伊文思蓝作为葡萄糖的阳性对照，也获得了类似结果。血糖水平的同步波动表明，两只小鼠之间的血液循环已成功建立。

引言

异种共生是一种将两个生物体通过手术连接在一起的建模方法，二者共同发育形成一个具有共享循环系统的单一生理系统¹。由于个体产生的物质可通过共用的循环系统同时作用于两个生物体，这类模型已被广泛用于生理学研究。自19世纪中期Paul Bert首次开展异种共生实验以来²，构建异种共生模型的方法已逐步标准化。然而，长期以来一直缺乏一种直接且便捷的方法来验证血液嵌合状态是否成功建立。已有研究报道，可通过向其中一个共生体腹腔注射0.5%伊文思蓝染料，随后使用酶标仪测定两个共生体血液中伊文思蓝的吸光度，从而评估交叉循环情况³。另一种方法则需要使用特定品系的小鼠，使每只共生体分别携带CD45.1⁺和CD45.2⁺标记的单核细胞，再通过流式细胞术检测脾脏或血液中单核细胞上两种标记物的频率，以确定血液嵌合状态⁴。然而，这些方法往往对动物具有致死性或操作繁琐，因此迫切需要一种安全、简便且能快速可靠验证异种共生模型的方法。在本研究中，我们建立了一种新的验证方法，并在小鼠异种共生模型中进行了验证。该方法通过血糖仪检测从小鼠尾静脉采集的血液样本中的葡萄糖浓度，通过观察供体与受体小鼠血糖水平变化的模式来判断循环系统的嵌合情况。我们将此方法命名为"葡萄糖波动法"。该验证方法的应用不仅限于小鼠，还可推广至除严重葡萄糖代谢紊乱以外的多种病理模型。该操作流程简单、省时且安全。

方案

所有涉及动物及其护理的操作均经哈尔滨医科大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：本方法所需的工具和设备列在材料表中。

1. 材料与动物的准备

1. 从标准实验动物供应商处订购体重在 20 g–25 g 之间的 C57BL/6 雄性小鼠。
2. 将小鼠饲养在 12 小时光照：12 小时黑暗循环、24−26 °C 的环境中，并可自由获取水和食物。

2. 连体共生

1. 通过腹腔注射20 g/L的2,2,2-三溴乙醇进行小鼠麻醉，剂量为0.1 mL/10 g。通过肌肉松弛、呼吸缓慢而平稳、皮肤刺激反射消失以及角膜反射消失等指标确认麻醉效果良好。
2. 使用棉签涂抹眼膏，防止眼睛干燥。
3. 按照先前所述方法进行联体共生手术⁵。
   1. 将小鼠置于仰卧位。使用电动剃毛器，分别从一只小鼠左侧和另一只小鼠右侧的肘关节上方约1 cm处至膝关节下方1 cm处进行剃毛。再使用脱毛膏彻底清除剃毛区域的残余毛发。
   2. 用碘伏擦拭剃毛区域。将小鼠置于覆盖无菌垫的加热垫上。
   3. 使用锐利剪刀，在每只小鼠剃毛侧的皮肤上，从肘关节上方0.5 cm处至膝关节下方0.5 cm处，沿纵轴方向剪开皮肤。
   4. 沿切口方向轻柔地将皮肤与皮下筋膜分离。
   5. 使用3-0缝线将联体小鼠的鹰嘴突与膝关节固定连接。
   6. 使用连续缝合技术，以5-0缝线缝合剃毛区域的皮肤。
4. 每只小鼠皮下注射0.5 mL的0.9% NaCl，以防止脱水。
5. 每只小鼠肌肉注射曲马多（10 mg/25 g/天），以缓解疼痛。

3. 循环嵌合体的验证

1. 葡萄糖波动法
   注意：在连体手术后的第10天，使用葡萄糖波动法（无需禁食）验证连体动物之间血液循环嵌合构建成功。
   1. 通过腹腔注射20 g/L 2,2,2-三溴乙醇，按每10 g体重0.1 mL的剂量对连体动物进行麻醉。
   2. 将供体小鼠固定在静脉可视化小鼠尾部固定器中。
   3. 用浸有70−75%酒精的棉球擦拭其中一只连体动物尾部侧面的尾静脉，以清洁尾部并扩张血管。
   4. 右手持含有葡萄糖的1.0 mL注射器，使针头与静脉平行（角度小于15°）。
   5. 在距离尾尖约2−4 cm的位置插入针头。
   6. 在10秒内向供体尾静脉注射100 µL葡萄糖（1.2 g/kg）。
      注意：“供体”指通过尾静脉接受葡萄糖注射的连体动物；“受体”指另一只未直接接受葡萄糖的连体动物。
   7. 用碘伏清洁脚趾，使用剪刀剪去供体和受体小鼠的脚趾，并在葡萄糖注射后的不同时间点（1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟）采集血滴。每次采血时清除血凝块，以避免造成更多损伤。
      注意：每次检测所需血量为10–25 µL，总采血量为90–225 µL。
   8. 将血液滴加至血糖仪试纸的中心区域，用于检测血糖水平。
2. 使用伊文思蓝复染剂作为阳性对照³。
   1. 向供体小鼠腹腔注射200 µL 0.5%伊文思蓝复染剂。
   2. 2小时后，通过腹腔注射20 g/L 2,2,2-三溴乙醇（每只小鼠按0.2 mL/10 g体重）处死连体动物，并通过心脏穿刺采集两只连体动物的血液。
   3. 将血液样本在916 × g 条件下离心15分钟。
   4. 从上清液中收集血清。
   5. 用0.9% NaCl将血清按1:50比例稀释。
   6. 使用分光光度计在620 nm波长下测定稀释后血清样本的吸光度。

结果

在六只供体小鼠中，血糖水平急剧升高至 26.5 µmol/L （增加173%）在注射后平均1分钟时 100 µL 通过尾静脉注射葡萄糖（1.2 g/kg）后，逐渐降低至 13.3 µmol/L 60分钟时。在接受注射的小鼠中，血糖在注射后缓慢上升，在15分钟时达到第一个峰值水平（升高47%） 12.2 µmol/L）。根据上述结果，循环嵌合体的标准设定如下：1）血糖水平急剧升高（至少升高100%或以上）； >20 µmol/L供体小鼠在注射葡萄糖后1分钟内出现，以及受体小鼠在注射后15分钟内血糖水平显著升高（至少升高37%）（图1).

伊文思蓝染料在连体动物血清中的浓度也表明血液循环嵌合体构建成功（图2）。我们在测量血糖后，使用5 mL 2,2,2-三溴乙醇（20 g/L）对连体动物实施安乐死。连体动物之间的皮下血管连接清晰可见...

讨论

异种共生（parabiosis）是指通过实验手段将两只活体动物进行外科手术连接，以建立共同的血液循环系统^6,7,8。该模型的优势在于，单个个体产生的物质可同时作用于两只动物。因此，异种共生模型可用于探究某种物质或因子在相关疾病中的作用，从而得出许多有意义且具创新性的结论。鉴于其重要的应用价值，该模型已显著促进了人们对心血管系统疾病^{8,9,10,11,12,13}、神经系统疾病^14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弯头镊	JZ surgical Instruments, China	J31340
精细剪刀	JZ surgical Instruments, China	WA1030
持针器	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL 注射器	Agilent, USA	5182-9642
三溴乙醇	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
青霉素	Solarbio, China	IP0150
曲马多	Yijishiye, China	YJT712520
血糖仪	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
伊文思蓝复染剂	Solarbio, China	G1810
脱毛膏	Nair, USA	LL9161
加热垫（保温毯）	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
电动剃须刀	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 外科缝合线	上海医用缝合针厂, 中国	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#