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方法文章

酿酒酵母SNX-BAR异源二聚体的表达、纯化及脂质体结合

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DOI：

10.3791/60413

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2019年12月6日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

本文内容

摘要

本文介绍了一种在酵母中表达、纯化SNX-BAR异源二聚体并进行脂质体结合的实验流程。

摘要

SNX-BAR 蛋白是一类在进化上保守的膜重塑蛋白，其在内吞作用过程中蛋白质和脂质的分选与运输、内体系统内的分选以及自噬过程中发挥关键作用。SNX-BAR 蛋白功能的核心在于其能够形成同源二聚体或异源二聚体，并利用高度保守的 Phox 同源（PX）结构域和 BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域与膜结合。此外，SNX-BAR 二聚体在膜上的寡聚化可诱导膜管和囊泡的形成，该活性被认为反映了其作为内体来源运输载体包被蛋白的功能。长期以来，研究人员利用体外结合实验，将重组 SNX-BAR 蛋白作用于合成脂质体或巨型单层囊泡（GUVs），以揭示驱动膜重塑所需的精确脂质组成，从而阐明其作用机制。然而，由于双表达系统的技术难题、SNX-BAR 蛋白在细菌中表达时的毒性，以及单个 SNX-BAR 蛋白溶解度差等问题，迄今为止大多数研究集中于 SNX-BAR 同源二聚体，包括在细菌表达过程中形成的非生理状态二聚体。最近，我们优化了一种实验方案，以克服典型细菌表达系统的主要缺陷。通过该工作流程，我们展示了如何成功表达并纯化大量 SNX-BAR 异源二聚体，以及如何将其重组到合成脂质体上，用于结合和成管实验。

引言

质膜、内质网、高尔基体、溶酶体（酵母液泡）和内体等膜结合细胞器构成了真核细胞的内膜系统。大多数细胞器能够通过囊泡运输载体与其他细胞器进行通信并交换物质。然而，细胞如何在内膜系统中协调囊泡运输载体的包装和形成尚不明确。不过，构成内膜系统的大部分蛋白质和脂质已知来源于从质膜（PM）内吞形成的内吞囊泡。内体是这些囊泡的主要接受细胞器，由多组相互连接的管状细胞器组成。内体的主要功能包括促进营养物质的摄取、调控蛋白质和脂质的转换、抵御病原体感染，并作为质膜脂质的主要补充来源。由于内体接收来自质膜的大部分货物蛋白和脂质，因此它作为分选区室，将货物隔离到管状内体运输载体（ETCs）中。未被分选进入ETCs的蛋白质则通过内体-溶酶体系统被降解。货物向ETCs分选的失调可能导致营养摄取、蛋白质转换或脂质稳态的丧失，从而引发多种代谢性、发育性和神经性疾病1，2。然而，尽管ETCs在内体中具有核心作用，但内体如何选择性地协调将多种异质性货物包装到管状载体中的潜在机制仍不清楚。

分选衔接蛋白（sorting nexin，SNX）家族是一类在进化上保守的蛋白质，已被发现对细胞内多种囊泡运输反应至关重要3,4,5。分选衔接蛋白通过其特有的phox同源（PX）结构域被招募至早期内体膜上，该结构域可结合富含于内体膜上的脂质——磷脂酰肌醇-3-单磷酸（PtdIns(3)P），从而协助货物蛋白的捕获。哺乳动物基因组编码33种SNX蛋白，根据其所含其他结构域的不同，可进一步划分为多个亚家族1。其中最显著的是SNX-BAR亚家族，在人类中包含12种成员，而在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中则仅含有7种SNX-BAR蛋白。SNX-BAR蛋白同时具有PX结构域和Bin-Amphiphysin-Rvs（BAR）结构域，后者可促使脂质库结合正曲率膜。因此，SNX-BAR家族天然趋向于内体膜，并可通过其膜重塑能力介导内体管状囊泡（ETC）的形成。在体外实验中，通过将纯化的SNX-BAR蛋白加入合成脂质体中，可诱导其发生膜重塑，随后可通过电子显微镜观察到狭窄的包被膜管结构的形成。利用这些方法，研究人员发现SNX-BAR家族成员在寡聚化浓度和收缩强度方面存在差异，提示它们可能在ETC的形成与断裂过程中均发挥辅助作用。

SNX-BAR 蛋白可根据其特有的二聚化特性进一步分类。体外结合实验和结构研究表明，SNX-BAR 蛋白只能形成特定的同源二聚体或异源二聚体。因此，原则上，每种可能的 SNX-BAR 二聚体-寡聚体都可能为特定货物的运输通路提供管状结构包被；同样，其他 SNX-BAR 原体受限的寡聚化特性也可定义不同的外运通路。然而，由于 SNX-BAR 家族成员数量众多且 SNX 家族本身具有高度多样性，单一分选连接蛋白对应单一货物的假说极不可能成立。相反，更可能的情况是多种因素协同作用，包括 SNX-BAR 蛋白、货物分子、脂质特异性及其他依赖因素共同参与调控。同样，近期对酵母 SNX4 家族的研究揭示了除磷脂酰肌醇-3-磷酸 [PtdIns(3)P] 之外还存在额外的脂质特异性，可增强内体运输载体的功能6。在本研究中，SNX-BAR 同源二聚体 Mvp1-Mvp1 从细菌中纯化获得，而天然异源二聚体 Snx4-Atg20 和 Vps5-Vps17 则在酵母中高效表达并纯化；脂质体结合实验显示，只有 Snx4-Atg20 能优先结合磷脂酰丝氨酸（PS），并在脂质体结合实验中形成狭窄的管状结构6。尽管领域内其他研究人员已利用从细菌中重组纯化的 SNX-BAR 同源二聚体揭示了该蛋白家族的重要特性，但在类似系统中表达 SNX-BAR 异源二聚体时伴随的毒性问题阻碍了对其天然状态的表征7,8,9,10。因此，在缺乏可靠系统以获得高纯度重组表达的天然异源二聚体的情况下，研究人员不得不放弃相关研究方向。在 图1 中，我们提出一个四部分工作流程：1）构建过表达 SNX-BAR 异源二聚体的酵母菌株，用于串联亲和纯化；2）表达并纯化天然 SNX-BAR 异源二聚体；3）制备单层合成脂质体；4）建立脂质体管状化或沉降实验，为研究人员探究自然界中日益增多的分选连接蛋白提供关键工具。

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方案

1. 酵母菌株构建

  1. 以 TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 作为亲本菌株。该菌株缺乏液泡蛋白酶，而液泡蛋白酶在细胞裂解后介导了大部分蛋白质降解，因此使用该菌株可实现更纯净且高效的蛋白纯化。
  2. 设计引物12，并通过同源重组在 Atg20（SNX-BAR ORF 1）的 C 末端整合串联亲和纯化（TAP）标签。使用聚合酶链式反应（PCR）确认整合结果（图 2）。
  3. 对细胞裂解液进行针对 TAP 标签的蛋白质印迹（western blot），以确认正确整合13。
    注意：我们建议收获 3 OD（1 OD ≈ 1 × 107 个细胞）的细胞用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹验证。请注意，应在将内源启动子替换为 GAL1 启动子之前完成 TAP 标签的整合，以便通过蛋白质印迹更方便地验证 TAP 标签的整合情况。
  4. 通过连续的同源重组和分别对各个开放阅读框（ORF）进行转化，将内源 Snx4（SNX-BAR ORF1）和 Atg20（SNX-BAR ORF 2）的启动子替换为无标签的 GAL1 启动子14。
  5. 使用整合位点外侧的侧翼引物进行 PCR，以确认整合成功（图 2）。这将导致在培养基中不含半乳糖的情况下，目标 SNX-BAR 蛋白呈现缺失表型。

2. 酵母诱导及SNX-BAR二聚体纯化

注意：酵母细胞可在标准 YPD（酵母提取物、蛋白胨和 2% 葡萄糖）琼脂平板上培养，因为这些修饰已整合到染色体中。

  1. 将大量细胞接种物接种至50 mL标准YP（酵母提取物和蛋白胨）培养基中，培养基含2%棉子糖和0.1%葡萄糖作为碳源，使用体积至少为培养液体积4倍的三角瓶，在30 °C摇床中过夜培养，以保证充分通气。预期在此培养基中的生长速度将比标准YPD培养基慢。
  2. 次日早晨，用50 mL预培养物接种至1 L含2%棉子糖和0.1%葡萄糖的标准YP培养基中，在30 °C摇床中培养4–5小时。
    注意：用于接种1 L培养物的预培养物体积可根据预培养物的OD600进行调整。接种后1 L培养物的OD600应约为0.2，以确保在4–5小时的培养期间至少发生两次倍增。
    1. 使用带挡板的Fernbach三角瓶进行培养，以保证充分通气，2.8 L体积的三角瓶已足够。通气不足可能导致生长缓慢，并在收获时细胞沉淀体积较小。
  3. 培养4–5小时后检测OD600，确保培养物处于对数生长期（0.5–1）。根据菌株的生长情况，可适当调整培养时间，以确保至少发生两次倍增。加入2%半乳糖，并在30 °C摇床中过夜培养。
    注意：过夜培养后的OD600可能有所变化，但培养物应达到饱和状态。请注意，在此培养方案中，无需在添加2%半乳糖前将细胞从0.1%葡萄糖中去除。我们建议在此步骤收获3 OD的未诱导和诱导细胞，用于SDS-PAGE和Western blot验证（图3A,B，泳道1–2）。
  4. 在4500 × g条件下离心15分钟收集细胞。可使用可容纳1 L培养液体积的水平转子离心机。
  5. 将酵母沉淀转移至50 mL锥形管中；如有需要，可进行第二次离心。沉淀体积通常为10–15 mL（根据刻度标记测量），可立即使用或储存于-80 °C。
    1. 用15 mL纯化缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，1 mM二硫苏糖醇（DTT），蛋白酶抑制剂混合物）重悬沉淀，使最终体积约为30 mL。
  6. 使用前将匀浆器预冷至4 °C，并用纯化缓冲液平衡。使用机械细胞破碎仪或匀浆器裂解细胞。将样品加入匀浆器中，在20,000–25,000 psi条件下进行2–3轮裂解；注意随着细胞逐渐裂解，需增加进样压力以维持20,000–25,000 psi的压力。将细胞裂解液收集至置于冰上的50 mL锥形管中。
    注意：若需裂解更多样品，应在加载下一个样品前彻底清洗并重新平衡匀浆器。所有细胞裂解液均需保持在冰上。
  7. 立即在4 °C、35,000 × g条件下离心1小时以澄清裂解液。小心将上清液转移至新管中。注意细胞裂解产生的脂质在离心过程中会浮至顶部，不会影响纯化过程。
    注意：我们建议保留裂解液和沉淀的0.5–1%用于SDS-PAGE分析。通常未观察到显著差异，也可进行额外的Western blot以确认TAP蛋白的可溶性（图4，分别为泳道1和2）。
  8. 用纯化缓冲液平衡300 µL IgG Sepharose微珠。将其加入澄清后的细胞裂解液中，在4 °C旋转孵育2小时。
  9. 将微珠收集至10 mL层析柱中，使未结合的裂解液流穿。
  10. 使用10 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，1 mM DTT）洗涤微珠，每次加入1 mL，待其完全流穿。
    注意：我们建议保留2%结合IgG的微珠用于SDS-PAGE分析。通常可观察到四条主要条带：两条SNX-BAR蛋白以及IgG重链和轻链（图4，泳道3）。我们建议保留等量的“洗脱液”和“TEV酶切后的IgG微珠”以比较TEV切割效率。
  11. 收集微珠并转移至微量离心管中。用新鲜洗涤缓冲液补至总体积500 µL，并加入2 µL 10 mg/mL TEV蛋白酶，4 °C旋转过夜孵育。
  12. 次日早晨，使用27 G针头完全移除上清液，并通过10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE分析蛋白纯度（图4，泳道4）。
    注意：我们通常可获得500 µL、浓度为0.5–1 mg/mL、纯度达95%的异源二聚体（图4，泳道4）。也可进一步使用钙调蛋白树脂进行纯化，但我们通常观察到产量显著下降，因此若纯度已>90%，建议在此停止。TEV不影响脂质体结合实验，但可通过Ni-NTA琼脂糖微珠进一步去除TEV15。
  13. 为浓缩样品，将样品转移至截留分子量为10 KDa的0.5 mL离心浓缩管中，按制造商说明离心至50 µL或更少体积。使用Bradford蛋白定量法测定浓缩蛋白浓度。储存于4 °C，并在一周内使用。

3. 脂质体的制备

  1. 购买市售的脂质：磷脂酰丝氨酸（PS）、PI3P、麦角固醇和磷脂酰胆碱（PC）。如有需要，用推荐的溶剂重悬以制备脂质储备液。
    注意： 脂质应按照生产商建议，用甲醇/氯仿混合液重悬。使用前确保脂质储备液澄清，并已升温至室温。重悬后的脂质可在氩气保护下，用封口膜（或等效材料）密封，于 -20 °C 保存 6–12 个月，或直至观察到活性下降。
  2. 计算所需各脂质储备液的体积，以配制具有目标脂质组成的混合物（见表 1）。假设脂质混合物中脂质总量为 1 摩尔。
  3. 在化学通风橱中进行此步骤。用玻璃注射器吸取一整管体积的氯仿，并弃入废液容器中以清洗注射器，重复此操作两次。转移氯仿时，仅使用玻璃注射器或移液器。吸取氯仿时，缓慢拉动活塞，防止气体气泡进入注射器。
  4. 使用玻璃注射器将计算好的脂质储备液转移至洁净的玻璃培养管中，制备终浓度为 1% PI3P、20% 麦角固醇、30% PS、PC 的脂质混合物（表 1）。根据各脂质所用溶剂的不同，每加入一种脂质后混合物可能变浑浊。
    注意： 若要调整 PS 浓度（0–30%），应相应调整体积，并通过改变 PC 体积进行补偿（表 1）。
  5. 使用氮气以环形吹扫方式小心干燥脂质混合物，使脂质均匀干燥。使用低流量气体，确保干燥过程中脂质保持在玻璃管底部。用铝箔包裹玻璃培养管，管口保持敞开，再在真空条件下进一步脱水 1 小时。
  6. 加入 400 µL 结合缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1 mM MgCl2），使脂质完全水化，得到终浓度为 2.5 mM 的脂质体。
    注意： 可通过增减结合缓冲液的体积来调节终浓度的脂质体。例如，如需制备 5 mM 的脂质体，可加入 200 µL 结合缓冲液（见下文）。
    1. 在涡旋振荡器上以中等速度室温震荡 30 分钟，使脂质充分重悬。脂质重悬后，溶液应呈现浑浊状态。
  7. 将重悬后的脂质体转移至微量离心管中。此后可使用塑料移液器吸头，因为脂质已不再溶于氯仿。注意，脂质体溶液应呈浑浊状。
  8. 通过将微量离心管先浸入液氮，再放入 37 °C 水浴中，进行 7 至 8 次冻融循环。每次冻融前，应确保脂质体混合物肉眼观察已完全冻结并呈固态。
  9. 涉及氯仿的操作应在化学通风橱中进行。用两个 1 mL 玻璃注射器，分别吸取并弃去三整管体积的氯仿，以清洗注射器，去除任何残留脂质。随后，用超纯水平衡每个玻璃注射器：吸取两倍注射器体积的超纯水；再用结合缓冲液平衡：同样吸取两倍注射器体积的结合缓冲液。
  10. 按照制造商说明组装小型挤出器。将一张 200 nm 膜和两片滤膜支撑片（见材料表）分别浸入结合缓冲液中进行平衡。
  11. 将膜夹在两片滤膜支撑片之间，并放入小型挤出器中。为减少组装后小型挤出器的死体积并确保密封性，使用 1 mL 玻璃注射器将相当于脂质体混合物体积的结合缓冲液推过挤出器。
  12. 使用其中一个 1 mL 玻璃注射器吸取脂质体混合物。将微量离心管倒置，使管盖内聚集剩余脂质体混合物，以便用玻璃注射器完全吸取。
  13. 将脂质体通过 200 nm 膜挤出 19–21 次。将挤出后的脂质体收集至新的微量离心管中。
    注意： 挤出后的脂质体应比挤出前更透明。脂质体应在当天使用，并置于冰上保存。最后一次挤出应使脂质体位于与起始相反的注射器中。

4. SNX-BAR 脂质体结合与成管作用

  1. 在进行脂质体结合和沉降实验之前，将纯化的蛋白质在4 °C条件下于超速离心机中以100,000 × g离心20分钟。移除上清液并转移至新的微量离心管中；如有沉淀，请勿扰动沉淀物。
  2. 为进行脂质体结合和管状结构形成实验，将4 µM纯化的Snx4-Atg20与2.5 mM脂质体在总体积为20 µL的反应体系中孵育，根据需要调整加入的脂质体体积。
    注意：在同一实验中，每个反应应使用相同体积的脂质体。
  3. 在30 °C下孵育反应体系30分钟。
    注意：建议尽可能增加每个反应中加入的2.5 mM脂质体体积，至少使用10 µL脂质体，以便在沉降过程中便于观察。若在20 µL反应体系中使用10 µL的2.5 mM脂质体，则脂质体的终浓度为1.25 mM。如果纯化的蛋白质浓度较低，需要更多体积才能达到4 µM蛋白浓度，则可在水化步骤中将脂质重悬于200 µL溶液中，使脂质体浓度加倍（见步骤3.6）；但此操作要求在制备脂质体前已知蛋白浓度。
  4. 观察并定量分析脂质体管状结构形成。
    1. 立即处理脂质体结合反应样品用于透射电子显微镜分析。将样品滴加至碳支持的铜网载网上，并用1%醋酸铀进行负染色（图5B）16。
    2. 在透射电子显微镜（200 kV）下观察样品。
    3. 使用图像分析软件测量并定量管状结构的直径。为准确量化单个管状结构的直径，沿其长度方向选取三个位置测量直径并取平均值（图5B）。
      注意：采用双因素方差分析确定统计学显著性（图5E）。醋酸铀具有放射性和毒性，执行此步骤需具备相应的实验室安全资质。
  5. 脂质体结合与沉降实验。
    1. 将反应液（20 µL，来自步骤4.3）转移至聚碳酸酯离心管中，使用匹配的转子在4 °C条件下于超速离心机中以100,000 × g离心20分钟。小心移除上清液并转移至新的微量离心管中。注意保持沉淀物完整。
    2. 用40 µL SDS-PAGE上样缓冲液重悬沉淀物，并转移至新的微量离心管中。向上清液中加入20 µL上样缓冲液。将等量的沉淀物和上清液样品上样至10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶，进行考马斯亮蓝染色，以观察结合到脂质体上的SNX-BAR蛋白（图5A）。
    3. 为定量沉淀组分中SNX-BAR复合物的含量，使用密度测定法量化条带强度，并计算沉淀组分中SNX-BAR蛋白的比例。
      注意：采用双因素方差分析确定统计学显著性（图5C）。

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结果

本方案描述了一种可重复且稳健的方法，用于内源性酵母SNX-BAR复合物的制备，所得产物可用于后续的膜重塑实验（图1）。用于纯化的酵母菌株构建利用了芽殖酵母中同源重组的高效性，可在目标SNX-BAR基因的基因组位点进行修饰（图2）。该设计具有两个优势：（i）由于无需筛选压力来维持修饰，可使用标准YP培养基，从而支持更高的细胞密度生长，进而提高蛋白产量；（ii）目标SNX-BAR的表达水平将保持均一，有利于异源二聚体复合物的高效生成。在添加半乳糖之前，目标SNX-BAR将呈现缺失表型，可能导致生长缺陷或其他已知的、与特定SNX-BAR相关的缺陷。此外，在含2%棉子糖和0.1%葡萄糖的培养基中生长速度较在含2%葡萄糖的培养基中更慢。因此，半乳糖诱导前的生长阶段可能需要针对不同菌株进行优化。为检测SNX-BAR表达是否成功诱导，通常需要进行针对TAP标签的蛋白质印迹（Western blot）分析，因为通过考马斯亮蓝染色可能无法检测到SNX-BAR蛋白的表达水平...

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讨论

本文展示了一种优化的流程，用于在酵母中纯化SNX-BAR二聚体，并介绍了两种在合成脂质体上评估其生物物理特性的实验方法。与在大肠杆菌（Escherichia coli）或其他系统中进行常规重组蛋白表达相比，该方法的主要优势在于能够在天然宿主中均一表达SNX-BAR蛋白，从而避免在其他系统中纯化SNX-BAR蛋白时常遇到的毒性及不溶性问题。值得注意的是，我们的系统无需进行分子克隆，也无需携带多个表达载体17。我们构建的双SNX-BAR酵母菌株通过染色体上改造的半乳糖启动子驱动，从而确保诱导后实现均一表达。需要特别注意的是，在缺乏半乳糖的情况下，目标SNX-BAR蛋白几乎不会表达，从而产生空表型。此外，我们发现SNX-BAR蛋白通常对C端标签具有良好的耐受性，因此我们可在其C端添加TAP标签。然而，根据具体蛋白的不同，也可使用N端TAP标签12。另外，由于SNX-BAR蛋白仅形成1:1的二聚体，因此纯化时只需对其中一个蛋白进行标记即可。但需注意，某些在细胞内通常形成异源二聚体的SNX-BAR蛋白在非生理浓度下可能形成同源二聚体<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所资助，项目编号为 GM060221，部分研究得到了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所资助，项目编号为 T32GM007223。R.C. 部分得到了北卡罗来纳大学夏洛特分校教员研究资助计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 μm PC 膜Avanti610006
10 mL 聚合层析柱（Bio-Rad）Bio-Rad731-1550
27 G 针头BD Biosciences301629
Amicon Ultra 离心滤膜（截留分子量 10K）AmiconUFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 匀浆器AvestinEF-C3
BCA 蛋白定量试剂盒Pierce23225
Beckman Optima MAX-XP 超速离心机Beckman Coulter393315
完全蛋白酶抑制剂混合物Roche4693116001
DOPCAvanti850375
DOPSAvanti840035
麦角固醇（Sigma）Sigma47130-U
挤出器套装，含 0.2 μL/1 mL 块Avanti610000
FEI Tecnai F20 透射电子显微镜（200 kV）
玻璃培养管VWR47729-570
IgG Sepharose 微珠（GE Healthcare）GE Healthcare17-0969-01
Microlter 玻璃注射器Hamilton7637-01
New Brunswick Excella E25EppendorfM1353-0000或等效的 30 °C 摇床
Ni-NTA 磁性琼脂糖微珠Pierce78605
Optima XE-90 超速离心机Beckman CoulterA94516
Parafilm M 封口膜VWR52858-076
PI3PEchelonP-3016或 Echelon 等效产品
聚碳酸酯瓶组件Beckman Coulter355622
TLA-100 固定角转子Beckman Coulter343840
Type 45 Ti 转子Beckman Coulter
真空干燥器，带底座、盖子和插座阀VWR75871-436
Alcatel 真空泵（Pascal 2005 C1）A&J VacuumPN07050
带泡沫支架的涡旋振荡器VWR10153-838
VWR 微管套装VWR12620-880

参考文献

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  16. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
  17. Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).

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