方法文章

萌芽酵母 SNX-BAR 异体体的表达、纯化和脂质结合

DOI：

10.3791/60413

⸱

2019年12月6日

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1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

本文内容

摘要

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在这里，我们介绍了酵母中SNX-BAR异体物的表达、纯化和脂质结合的工作流程。

摘要

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SNX-BAR 蛋白是一种进化保存的膜重塑蛋白，在内分泌期间蛋白质和脂质的分拣和贩运、内皮系统内的分泌和自噬中起着关键作用。SNX-BAR 蛋白质功能的核心是能够形成同质体或异构体，使用高度保守的磷同源学 （PX） 和 BAR（宾/假体素/Rvs）域结合膜。此外，在膜上对SNX-BAR二聚体进行寡聚可以引起膜小管和囊泡的形成，这种活性被认为反映了其作为内生物源运输载体的涂层蛋白的功能。长期以来，研究人员利用重组SNX-BAR蛋白在合成脂质体或巨型单片菌囊泡（GUVs）上进行体外结合研究，揭示驱动膜重塑所需的脂质的精确组成，从而揭示其作用机制。然而，由于双表达系统的技术挑战、细菌中SNX-BAR蛋白表达的毒性以及单个SNX-BAR蛋白的溶解性差，迄今为止的大多数研究都检查了SNX-BAR同质体，包括细菌表达过程中形成的非生理二分体。最近，我们优化了一种方案，克服了典型细菌表达系统的主要缺陷。使用此工作流，我们演示如何成功表达和纯化大量 SNX-BAR 异体，以及如何在合成脂体上重新构成它们，以便进行结合和管状测定。

引言

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膜结合的细胞器，如血浆膜、内质视网膜、Golgi装置、溶血菌（酵母乳酸）和内膜体构成真核细胞的内膜系统。大多数细胞器能够通过囊泡运输载体与其他细胞器进行通信和交换材料。细胞如何协调内膜系统内囊泡运输载体的包装和形成，目前还没有得到很好的理解。然而，构成大部分内膜系统的蛋白质和脂质已知源自血浆膜（PM）内切内切内切囊泡。内体是这些囊泡的主要接受器，由多组相互关联的管状细胞器组成。内源体的主要功能是促进营养获取，调节蛋白质和脂质流动，防止病原体感染，并作为血浆膜脂质的主要补充来源。当内欧体从血浆膜中接收大量货物蛋白质和脂质时，通过将货物分离到管状内皮运输载体（ETCs）中，充当分拣室。任何未被隔离到ETCs的蛋白质都会通过内裂体系统降解。货物分类到ETC的调节不良可能导致营养摄入、蛋白质周转或脂质平衡的丧失，导致大量代谢、发育和神经系统疾病1、2。然而，尽管ETC在内源体中起着核心作用，但内源体如何有选择地协调大量异质货物包装成管状载波的基本机制尚不清楚。

分拣nexin（SNX）系列是一种进化保存的蛋白质类别，已发现对细胞3、4、5中的许多囊泡运输反应至关重要。分拣内膜，通过其....

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方案

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1. 酵母应变结构

  1. 以 TVY614（pep4_::LEU2 prb1_::hisG prc1_::HIS3）11作为父应变。这种菌株缺乏真空蛋白酶，导致细胞解压后大多数蛋白质降解，因此允许更清洁和更有效的纯化。
  2. 设计引物12，并使用同源重组在 Atg20 （SNX-BAR ORF 1） 的 C 总站集成串联亲和纯化 （TAP） 标记。使用聚合酶链反应 （PCR） 确认集成 （图 2）。
  3. 对TAP标记执行细胞分解液的西方印块，以确认适当的整合13。
    注:我们建议收获 3 个 OD （1 OD = 1 x 107细胞） 的细胞，用于 SDS-PAGE 和西方污点验证。请注意，在用 GAL1 提升剂替换内源启动器之前，应集成 TAP 标记，以便通过西方污点更轻松地验证 TAP 标记。
  4. 使用每个ORF14的顺序同源重组和转换步骤，将内源性Snx4（SNX-BAR ORF1）和Atg20（SNX-BAR ORF 2）启动器替换为未标记的GAL1启动子。
  5. 在集成站点外部使用侧翼引体....

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结果

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该协议描述了一种可重复和强健地生产内源酵母SNX-BAR复合物的方法，可用于下游膜重塑测定（图1）。用于纯化的酵母菌株的构建利用了萌芽酵母的同源重组效率，允许在目标 SNX-BARs 的基因组位点进行修改（图 2）。这种设计有两个优点，（i）由于选择不需要进行修改，可以使用标准的YP介质，从而允许生长到更高的细胞密度，从而更高的蛋白质生产，（ii）目标SNX-BARs的表达水平将均匀，优化异体复合物的生产。在添加半乳酸酯之前，目标 SNX-BARs 将表现出空表型，因此可能导致生长缺陷或特定于目标 SNX-BARs 的其他已知缺陷。此外，2%的拉菲诺和0.1%的葡萄糖的生长比2%葡萄糖的生长慢。因此，在锥酸诱导之前的生长期可能需要优化每个特定的菌株。为了检查 SNX-BAR 表达的正确诱导，可能需要对 TAP 标记进行西印，因为 SNX-BARs 的蛋白质水平可能无法通过 Coomassie 染色检测出来（图 3.......

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讨论

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在这里，我们演示了优化的工作流程，以纯化酵母中的SNX-BAR二聚体和两种检测，以评估其在合成脂质体上的生物物理特性。与大肠杆菌或其他系统中典型的重组蛋白表达相反，其主要优势是能够在原生宿主中均匀地表达 SNX-BAR 蛋白质，从而避免在其它系统中净化 SNX-BARs 时发现的毒性和溶解性问题。值得注意的是，我们的系统不需要分子克隆或窝藏多个表达载体17。我们的双 SNX-BAR 酵母菌株由染色体工程的锥形增子促进剂驱动，从而确保诱导时均匀表达。一个重要的考虑因素是，如果没有半食酶，目标 SNX-BAR 的表达将很少或根本没有，从而导致空表型。此外，我们发现 SNX-BARs 倾向于很好地容忍 C 终端标记，从而使我们能够在 C 终端添加 TAP 标记。然而，根据被标记的蛋白质，N端TAP标签也可以使用12。此外，由于 SNX-BARs 仅形成 1:1 的二分器，因此只需标记一种蛋白质即可进行纯化。然而，一些SNX-BARs，通常形成异构体在细胞已被证明形成同构体在非生理浓度7。

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，奖励号为GM060221，部分得到国家研究所国家普通医学研究所的支持。在奖励编号T32GM007223下的健康。R.C.部分得到了UNC-夏洛特学院研究资助计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 μm PC 膜Avanti610006
10 mL Poly-Prep 色谱柱 （Bio-Rad）Bio-Rad731-1550
27 G 针BD Biosciences301629
具有 10K 截止值的 Amicon Ultra 离心过滤器AmiconUFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 匀浆器AvestinEF-C3
BCA 测定Pierce23225
Beckman Optima MAX-XP 超速离心机Beckman Coulter393315
完整蛋白酶抑制剂混合物Roche4693116001
DOPCAvanti850375
DOPSAvanti840035
麦角甾醇 （Sigma）Sigma47130-U
挤出机套装区块 0.2 μL/1 mLAvanti610000
FEI Tecnai F20 透射电子显微镜 （200 kV）
玻璃培养管VWR47729-570
IgG 琼脂糖珠（GE Healthcare）GE Healthcare17-0969-01
Microlter 玻璃注射器Hamilton7637-01
New Brunswick Excella E25EppendorfM1353-0000或同等产品振荡 30 °C
Ni-NTA 磁性琼脂糖珠Pierce78605
Optima XE-90 超速离心机Beckman CoulterA94516
封口膜 MVWR52858-076
PI3P梯队P-3016或 E梯队等效
聚碳酸酯瓶组件贝克曼库尔特355622
TLA-100 固定角转子贝克曼库尔特343840
类型 45 Ti 转子贝克曼库尔特
真空干燥器，底部和盖子，带插座阀VWR75871-436
真空泵 阿尔卡特 （Pascal 2005 C1）A&J 真空PN07050
带泡沫支架的涡流VWR10153-838
VWR 套件VWR12620-880

参考文献

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  1. Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
  2. Zhang, H., et al.

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SNX BAR HeterodimersYeast ExpressionProtein PurificationLiposome BindingMembrane RemodelingTransmission Electron MicroscopyUltracentrifugationLipid SpecificityProtein QuantificationExtruder Assembly

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