萌芽酵母 SNX-BAR 异体体的表达、纯化和脂质结合

摘要

在这里，我们介绍了酵母中SNX-BAR异体物的表达、纯化和脂质结合的工作流程。

摘要

SNX-BAR 蛋白是一种进化保存的膜重塑蛋白，在内分泌期间蛋白质和脂质的分拣和贩运、内皮系统内的分泌和自噬中起着关键作用。SNX-BAR 蛋白质功能的核心是能够形成同质体或异构体，使用高度保守的磷同源学 （PX） 和 BAR（宾/假体素/Rvs）域结合膜。此外，在膜上对SNX-BAR二聚体进行寡聚可以引起膜小管和囊泡的形成，这种活性被认为反映了其作为内生物源运输载体的涂层蛋白的功能。长期以来，研究人员利用重组SNX-BAR蛋白在合成脂质体或巨型单片菌囊泡（GUVs）上进行体外结合研究，揭示驱动膜重塑所需的脂质的精确组成，从而揭示其作用机制。然而，由于双表达系统的技术挑战、细菌中SNX-BAR蛋白表达的毒性以及单个SNX-BAR蛋白的溶解性差，迄今为止的大多数研究都检查了SNX-BAR同质体，包括细菌表达过程中形成的非生理二分体。最近，我们优化了一种方案，克服了典型细菌表达系统的主要缺陷。使用此工作流，我们演示如何成功表达和纯化大量 SNX-BAR 异体，以及如何在合成脂体上重新构成它们，以便进行结合和管状测定。

引言

膜结合的细胞器，如血浆膜、内质视网膜、Golgi装置、溶血菌（酵母乳酸）和内膜体构成真核细胞的内膜系统。大多数细胞器能够通过囊泡运输载体与其他细胞器进行通信和交换材料。细胞如何协调内膜系统内囊泡运输载体的包装和形成，目前还没有得到很好的理解。然而，构成大部分内膜系统的蛋白质和脂质已知源自血浆膜（PM）内切内切内切囊泡。内体是这些囊泡的主要接受器，由多组相互关联的管状细胞器组成。内源体的主要功能是促进营养获取，调节蛋白质和脂质流动，防止病原体感染，并作为血浆膜脂质的主要补充来源。当内欧体从血浆膜中接收大量货物蛋白质和脂质时，通过将货物分离到管状内皮运输载体（ETCs）中，充当分拣室。任何未被隔离到ETCs的蛋白质都会通过内裂体系统降解。货物分类到ETC的调节不良可能导致营养摄入、蛋白质周转或脂质平衡的丧失，导致大量代谢、发育和神经系统疾病^1、2。然而，尽管ETC在内源体中起着核心作用，但内源体如何有选择地协调大量异质货物包装成管状载波的基本机制尚不清楚。

分拣nexin（SNX）系列是一种进化保存的蛋白质类别，已发现对细胞^3、4、5中的许多囊泡运输反应至关重要。分拣内膜，通过其特有的磷异体（PX）域帮助货物捕获，该域结合磷脂酰胆醇-3-单磷酸（PtdIns（3）P，一种富含内膜的脂质。哺乳动物编码33个SNX蛋白质，根据其他域¹的存在，这些蛋白质可以进一步分为多个子家族。最值得注意的是，SNX-BAR亚家族是最大的亚家族，由12个人类组成，而在萌芽的酵母中，糖母糖，亚家族减少到只有7个SNX-BARs。SNX-BAR 蛋白同时具有 PX 域和 Bin-Amphisin-Rvs （BAR） 域，可触发脂质储液罐结合正曲率膜。因此，SNX-BAR系列对内膜体具有天然的亲和力，可以通过膜重塑能力来介导ETC的形成。在体外，通过在合成脂质体中加入纯化的SNX-BARs，可以诱导SNX-BARs的重塑特性，随后形成狭窄的涂层小管可以通过电子显微镜进行可视化。利用这些方法，研究人员已经确定，在SNX-BAR家族中，寡头集中和收缩强度似乎各不相同，这表明它们可以帮助ETC的形成和分裂。

SNX-BARs 可以按其独有的二聚特性进一步分类。体外结合测定和结构研究表明，SNX-BAR蛋白只能形成特定的同构体或异构体。因此，原则上，每个潜在的 SNX-BAR 二聚体可为特定货物的贩运途径提供小管涂层，同样，其他 SNX-BAR 原物体的受限寡头化也可以定义不同的出口途径。但是，由于 SNX 系列中 SNX-BARs 数量众多且多样性，因此不太可能出现一个排序的 nexin-one 货运假说。相反，使用 SNX-BARs、货物、脂质特异性和其他依赖关系等多种因素进行协调工作的可能性更大。同样，最近对酵母SNX4家族的研究表明，除了PtdIns（3）P，还有增效内质性运输载体⁶的脂质特异性。在这项研究中，SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1从细菌和原生异体物Snx4-Atg20和Vps5-Vpss17中表达和纯化，从酵母高产中表达和纯化，而只有Snx4-Atg20被发现优先结合磷脂酰丝氨酸（PS），并在脂质体结合研究中形成狭窄的管状结构^。虽然该领域的其他人已经揭示了SNX-BARs使用重组纯化的SNX-BAR同质体从细菌的重要属性，与表达SNX-BAR异构体在类似系统中的毒性阻碍了其原生特性^{7，8，9，10。}因此，如果没有一个可靠的系统来获得纯重组表达的本地异质体，研究人员必须放弃这些调查路线。在图 1中，我们提出了一个四部分工作流，以 1） 构建一个酵母菌株过度表达 SNX-BAR 异构体用于串联亲和纯化， 2） 表达和纯化原生 SNX-BAR 异构体， 3） 制备单层合成脂质体， 4） 建立脂质管或沉淀测定，为研究人员研究在自然界中发现的分拣内辛的不断增长的目录提供了重要工具。

方案

1. 酵母应变结构

1. 以 TVY614（pep4_::LEU2 prb1_::hisG prc1_::HIS3）¹¹作为父应变。这种菌株缺乏真空蛋白酶，导致细胞解压后大多数蛋白质降解，因此允许更清洁和更有效的纯化。
2. 设计引物^12，并使用同源重组在 Atg20 （SNX-BAR ORF 1） 的 C 总站集成串联亲和纯化 （TAP） 标记。使用聚合酶链反应 （PCR） 确认集成 （图 2）。
3. 对TAP标记执行细胞分解液的西方印块，以确认适当的整合^13。
   注:我们建议收获 3 个 OD （1 OD = 1 x 10⁷细胞） 的细胞，用于 SDS-PAGE 和西方污点验证。请注意，在用 GAL1 提升剂替换内源启动器之前，应集成 TAP 标记，以便通过西方污点更轻松地验证 TAP 标记。
4. 使用每个ORF¹⁴的顺序同源重组和转换步骤，将内源性Snx4（SNX-BAR ORF1）和Atg20（SNX-BAR ORF 2）启动器替换为未标记的GAL1启动子。
5. 在集成站点外部使用侧翼引体来确认成功集成（图 2）。这将导致目标 SNX-BARs 的空表型，在生长介质中不存在半乳酸。

2. 酵母感应和 SNX-BAR 丁二器纯化

注:酵母细胞可以在标准YPD（酵母提取物、肽和2%葡萄糖）琼脂板上繁殖，因为修饰是染色体整合的。

1. 将大量细胞拭子接种到50 mL的标准YP（酵母提取物和肽）培养基中，在烧瓶中以2%的拉菲诺和0.1%葡萄糖作为碳源，其体积至少是培养物体积的4倍，并在30°C摇床中过夜，以允许适当的曝气。预计与标准 YPD 相比，该介质的增长将放缓。
2. 第二天早上，使用50 mL预培养剂，用2%的拉菲诺和0.1%的葡萄糖接种到1L的标准YP培养基中，在30°C摇床中生长4-5小时。
   注:用于接种 1 L 培养的培养前体积可根据预栽培的 OD₆₀₀进行调整。接种后1 L培养法的OD₆₀₀应为0.2左右，以便在4-5小时生长期间至少增加两倍。
   1. 使用一个困惑的Fernbach烧瓶生长，允许适当的曝气，2.8L体积瓶就足够了。少曝气可能导致生长缓慢和收获时细胞颗粒变小。
3. 检查 OD₆₀₀以确保培养值在 4-5 小时增长后处于对数阶段 （0.5-1）。根据应变的生长情况，对生长时间进行调整，使生长时间至少翻倍两倍。加入2%的锥度酶，在30°C摇床中一夜生长。
   注:隔夜增长后的 OD₆₀₀可能会有所不同，但文化应该饱和。请注意，在加入此生长方案的 2% 加糖之前，无需从 0.1% 葡萄糖中去除细胞。我们建议在此步骤中收获3个未诱导和诱导细胞的OD，用于SDS-PAGE和西带的验证（图3A，B，通道1-2）。
4. 在4500 x g下通过离心收细胞15分钟。可在此处使用适合 1 L 体积培养的摆动铲斗转子。
5. 将酵母颗粒转移到50 mL锥形管中;可根据需要执行第二个离心步骤。细胞颗粒的体积一般在10-15 mL左右，通过分级标记测量，可以立即使用或储存在-80°C。
   1. 在15 mL净化缓冲液中重新悬浮颗粒（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl_2，1mM 二硫硫醇 （DTT），蛋白酶抑制剂鸡尾酒），使最终体积约为 30 mL。
6. 使用前先冷却均质器 4°C，并将其与纯化缓冲液平衡。使用机械细胞干扰器或均质器的酶细胞。将样品加载到均质器和酶中，以 20，000-25，000 psi 进行 2-3 轮;请注意，当细胞被分化时，需要更多的输入压力来维持20，000-25，000 psi。在冰上50 mL锥形管中收集细胞乳化。
   注:如果需要对其他样品进行分片处理，则应在装载下一个样品之前彻底清洁和平衡均质器。将所有细胞分物放在冰上。
7. 在4°C下，立即清除35，000 x g的细胞分麦1小时。小心地将上清液转移到新管中。请注意，细胞分流中的脂质在离心过程中会浮到顶部，不会影响纯化。
   注:我们建议为 SDS-PAGE 样品保存 0.5-1% 的利沙和颗粒。通常，没有观察到重大差异，并可能做额外的西印体来确认TAP蛋白溶解性（图4，车道1和2，分别）。
8. 用纯化缓冲液平衡300 μL IgG分离玫瑰珠子。加入清除的细胞解结，孵育2小时，在4°C下旋转。
9. 在 10 mL 色谱柱中收集珠子，并允许未结合的解糖流过。
10. 使用 10 mL 的洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂， 1 mM DTT）清洗珠子，一次添加 1 mL，使其完全流过。
    注:我们建议为 SDS-PAGE 样品保存 2% 的绑定 IgG 磁珠。通常，我们观察四个主要波段;两个SNX-BAR蛋白和IgG重链和轻链（图4，巷3）。我们建议节省同等数量的"eluate"和"TEV之后的IgG磁珠"，以比较TEV裂解效率。
11. 收集珠子并将其转移到微离心管中。加入500μL的总体积与新鲜的洗涤缓冲液和2μL的10毫克/mL TEV蛋白酶和孵育过夜，旋转在4°C。
12. 第二天早上，使用27G针头完全去除上清液，用10%的聚丙烯酰胺SDS-PAGE评估蛋白质纯度（图4，巷4）。
    注:我们通常获得500 μL的0.5-1毫克/mL的95%纯异体（图4，巷4）。也可以使用镇静剂树脂进行额外的纯化，但我们通常看到产量显著下降，如果纯度为 >90%，建议在此停止。TEV不干扰脂体结合测定，虽然TEV可以额外删除使用Ni-NTA抗胶珠^15。
13. 要进行浓缩，将样品转移到带 10 KDa 截止的 0.5 mL 离心过滤器中，并根据制造商的说明将离心机转移到 50 μL 或更少。使用布拉德福德蛋白测定定量浓缩蛋白。储存在4°C，并在一周内使用。

3. 脂体制备

1. 购买市售脂类:磷脂酰丝氨酸（PS）、PI3P、二甲醇和磷脂酰胆碱（PC）。如果需要，在推荐的溶剂中重新悬浮以制造血脂。
   注:根据制造商的建议，脂质被重新悬浮在甲醇/氯仿混合物中。在使用前，确保脂质储存清晰并加热至室温。再悬浮的脂质可储存在气下，并使用蜡膜（或等效物）在-20°C密封6-12个月，或直到观察到活动损失。
2. 计算每种脂质库存所需的体积，以创建具有所需脂质成分的混合物（见表1）。假设脂质混合物中共有1摩尔脂质。
3. 在化学烟气罩中执行此步骤。通过绘制完整的氯仿注射器体积并将其丢弃在废物容器中，清洁玻璃注射器。再重复两次。转移氯仿时，仅使用玻璃注射器或移液器。提取氯仿时，缓慢拉上塞子，以防止气泡进入注射器。
4. 使用玻璃注射器将库存脂质按计算转移到干净的玻璃培养管中，使最终脂质混合物为 1% PI3P、20% ergosterol、30% PS、PC（表 1）。根据每种脂质的溶剂，当加入每个脂质后，混合物可能会变浑浊。
   注:要改变 PS 的浓度 （0-30%），请相应地调整音量，并用不同的 PC 进行补偿 （表 1）。
5. 用氮气小心地干燥脂质混合物，以循环运动的方式将脂质混合物均匀地干燥。在干燥过程中，使用低气体流量将脂质保持在玻璃管底部。用铝箔包裹玻璃培养管，使开口未覆盖，并在真空中进一步脱水 1 小时。
6. 加入400 μL的结合缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1 mM MgCl_2），使脂质完全脱水，最终脂质浓度为2.5 mM。
   注:最终脂体浓度可以通过增加更多或更少的结合缓冲液来调节。例如，如果需要，可以添加 200 μL 结合缓冲液以产生 5 mM 的脂体浓度（见下文）。
   1. 在室温下以中等速度在涡旋处摇动脂质30分钟。当脂质重新悬浮时，缓冲液应出现多云。
7. 将悬浮脂体转移到微离心管。从那时起，塑料移液器尖端可用于脂质不再在氯仿中重新悬浮。请注意，脂液溶液应看起来浑浊。
8. 冷冻解冻脂体七至八次，先将微离心管浸入液氮中，然后在37°C水浴中。脂体混合物在解冻前应完全冷冻和眼部固体。
9. 在化学烟气罩中执行涉及氯仿的步骤。通过提取和丢弃全套氯仿注射器，每支三次，清除两个 1 mL 玻璃注射器，以去除任何残留脂质。通过绘制两个注射器体积，将每个玻璃注射器与超纯水平衡，然后通过绘制两个注射器体积与结合缓冲液进行平衡。
10. 根据制造商的建议组装微型挤出机。通过在结合缓冲液中浸入一个 200 nm 膜和两块滤芯支架（参见材料表），使每个膜平衡。
11. 将膜夹在过滤器支架之间并放置在微型挤出机中。为了减少组装的微型挤出机的死体积并确保组件气密，使用 1 mL 玻璃注射器通过微型挤出机传递与脂体混合物体积相当的装订缓冲液。
12. 使用 1 mL 玻璃注射器之一，并绘制脂体混合物。反转微离心管，收集管盖中最后一种脂体混合物，以绘制到玻璃注射器中。
13. 通过200nm膜19-21次挤出脂体。在新的微离心管中收集挤出的脂体。
    注:挤出的脂体在挤出前应比脂体显得少多云。脂质体应在同一天使用，并储存在冰上。最后一次挤出应将脂体放在注射器的对面，因为它开始。

4. SNX-BAR 脂体结合和管状

1. 在进行脂素结合和沉淀实验之前，在超离心器中预清除100，000 x g的纯化蛋白，在4°C下20分钟。去除上清液并将其转移到新的微离心管中;如果有，请勿干扰颗粒。
2. 为了执行脂体结合和输卵管测定，孵育4μM纯化的Snx4-Atg20和2.5 mM脂体的总反应体积为20μL，改变添加的脂体体积。
   注:在同一实验中，应使用相同的脂量体。
3. 在30°C下孵育反应30分钟。
   注:我们建议使用不少于10μL脂体，以在沉积过程中实现可视化，从而最大限度地增加每次反应中2.5 mM脂体的数量。如果在20μL反应中使用10μL的2.5 mM脂体，脂体的最终浓度为1.25 mM。如果稀释了纯化的蛋白质，并且 4 μM 蛋白质需要更大的体积，则在补液步骤期间，脂质可在 200 μL 中重新悬浮，使脂质体的浓度加倍（参见步骤 3.6）;然而，这需要在制造脂体之前知道蛋白质的浓度。
4. 可视化和量化脂体管。
   1. 立即处理脂体结合反应，用于电子显微镜分析。用1%的醋酸尿酸（图5B）16将样品点到碳涂层铜网网格和负污渍上。
   2. 在透射电子显微镜（200 kV）上分析样品。
   3. 使用图像分析软件测量和量化小管直径。要准确量化单个小管的管直径，请沿小管的长度和平均值进行三个直径测量（图 5B）。
      注:方差的双向分析用于确定统计显著性（图5E）。醋酸乙烯是放射性的和有毒的。执行此步骤需要经过适当的实验室安全认证。
5. 脂体结合和沉淀。
   1. 将反应（20 μL，从步骤4.3）转移到聚碳酸酯离心管，并使用兼容转子在超离心机中以100，000 x g在4°C下旋转20分钟。小心地去除上清液并转移到新的微离心管中。请注意，颗粒应保持完好无损。
   2. 在SDS-PAGE 40 μL样品缓冲液中重新悬浮颗粒，并转移到新的微离心管中。将20μL样品缓冲液添加到上清液。在10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中加载等量的颗粒和上清液，并执行Coomassie染色，以可视化与脂质体结合的SNX-BARs（图5A）。
   3. 要量化颗粒分数中的 SNX-BAR 复合物量，请使用密度测定量量化带强度，并量化颗粒分数中 SNX-BAR 蛋白质的比例。
      注:方差的双向分析用于确定统计显著性（图5C）。

结果

该协议描述了一种可重复和强健地生产内源酵母SNX-BAR复合物的方法，可用于下游膜重塑测定（图1）。用于纯化的酵母菌株的构建利用了萌芽酵母的同源重组效率，允许在目标 SNX-BARs 的基因组位点进行修改（图 2）。这种设计有两个优点，（i）由于选择不需要进行修改，可以使用标准的YP介质，从而允许生长到更高的细胞密度，从而更高的蛋白质生产，（ii）目标SNX-BARs的表达水平将均匀，优化异体复合物的生产。在添加半乳酸酯之前，目标 SNX-BARs 将表现出空表型，因此可能导致生长缺陷或特定于目标 SNX-BARs 的其他已知缺陷。此外，2%的拉菲诺和0.1%的葡萄糖的生长比2%葡萄糖的生长慢。因此，在锥酸诱导之前的生长期可能需要优化每个特定的菌株。为了检查 SNX-BAR 表达的正确诱导，可能需要对 TAP 标记进行西印，因为 SNX-BARs 的蛋白质水平可能无法通过 Coomassie 染色检测出来（图 3...

讨论

在这里，我们演示了优化的工作流程，以纯化酵母中的SNX-BAR二聚体和两种检测，以评估其在合成脂质体上的生物物理特性。与大肠杆菌或其他系统中典型的重组蛋白表达相反，其主要优势是能够在原生宿主中均匀地表达 SNX-BAR 蛋白质，从而避免在其它系统中净化 SNX-BARs 时发现的毒性和溶解性问题。值得注意的是，我们的系统不需要分子克隆或窝藏多个表达载体^17。我们的双 SNX-BAR 酵母菌株由染色体工程的锥形增子促进剂驱动，从而确保诱导时均匀表达。一个重要的考虑因素是，如果没有半食酶，目标 SNX-BAR 的表达将很少或根本没有，从而导致空表型。此外，我们发现 SNX-BARs 倾向于很好地容忍 C 终端标记，从而使我们能够在 C 终端添加 TAP 标记。然而，根据被标记的蛋白质，N端TAP标签也可以使用^12。此外，由于 SNX-BARs 仅形成 1:1 的二分器，因此只需标记一种蛋白质即可进行纯化。然而，一些SNX-BARs，通常形成异构体在细胞已被证明形成同构体在非生理浓度^7。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm PC 膜	Avanti	610006
10 mL Poly-Prep 色谱柱 （Bio-Rad）	Bio-Rad	731-1550
27 G 针	BD Biosciences	301629
具有 10K 截止值的 Amicon Ultra 离心过滤器	Amicon	UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 匀浆器	Avestin	EF-C3
BCA 测定	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP 超速离心机	Beckman Coulter	393315
完整蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
麦角甾醇 （Sigma）	Sigma	47130-U
挤出机套装区块 0.2 μL/1 mL	Avanti	610000
FEI Tecnai F20 透射电子显微镜 （200 kV）
玻璃培养管	VWR	47729-570
IgG 琼脂糖珠（GE Healthcare）	GE Healthcare	17-0969-01
Microlter 玻璃注射器	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	或同等产品振荡 30 °C
Ni-NTA 磁性琼脂糖珠	Pierce	78605
Optima XE-90 超速离心机	Beckman Coulter	A94516
封口膜 M	VWR	52858-076
PI3P	梯队	P-3016	或 E梯队等效
聚碳酸酯瓶组件	贝克曼库尔特	355622
TLA-100 固定角转子	贝克曼库尔特	343840
类型 45 Ti 转子	贝克曼库尔特
真空干燥器，底部和盖子，带插座阀	VWR	75871-436
真空泵 阿尔卡特 （Pascal 2005 C1）	A&J 真空	PN07050
带泡沫支架的涡流	VWR	10153-838
VWR 套件	VWR	12620-880